Resistencia Resumen
para el tratamiento TKI es un obstáculo importante en el tratamiento eficaz de NSCLC. Además estado de mutación de EGFR, los mecanismos implicados son en gran parte desconocidos. Alguna evidencia apoya un papel para microARN 21 en la modulación de la sensibilidad al fármaco de quimioterapia, pero su papel en la resistencia NSCLC TKI sigue siendo inexplorada. Este estudio tuvo como objetivo investigar si NSCLC miR-21 mediada por la resistencia a la ITC también resulta de PTEN orientación. Aquí, se muestra el miR-21 promueve el cáncer, regulando negativamente la expresión de PTEN en los tejidos de NSCLC humanos: altas miR-21 niveles de expresión estaban asociados con DFS más cortos en 47 pacientes con CPNM; altos miR-21 /bajos niveles de expresión de PTEN indicaron una mala respuesta clínica TKI y la supervivencia general más corta en otros 46 pacientes con CPNM en tratamiento con ITC.
in vitro
ensayos mostraron que el miR-21 se reguló de forma concomitante a la baja regulación de PTEN en /GR células en comparación con las células PC-9-9 PC. Por otra parte, la sobre expresión de miR-21 se redujo significativamente la sensibilidad a gefitinib por Akt y ERK expresión de PTEN y la activación de abajo de la regulación de las células PC-9, mientras que el miR-21 desmontables restaurado drásticamente la sensibilidad gefitinib de PC-9 /GR células por arriba la regulación de la expresión de PTEN y la inactivación de Akt y ERK,
in vivo
y
in vitro
. Proponemos la alteración de la expresión de miR-21 /PTEN como un nuevo mecanismo para la resistencia TKI en el cáncer de NSCLC. Nuestros resultados proporcionan una nueva base para el uso de miR 21 /PTEN-basada estrategias terapéuticas para revertir la resistencia a gefitinib en NSCLC
Visto:. Shen H, Zhu M, Liu J, Xu T, D Pei, Wang R, et Alabama. (2014) La alteración en Mir-21 Expresión /PTEN Modula Resistencia gefitinib en células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 9 (7): e103305. doi: 10.1371 /journal.pone.0103305
Editor: Jung weon Lee, Universidad Nacional de Seúl, República de Corea
Recibido: Marzo 4, 2014; Aceptado: June 27, 2014; Publicado: 24 Julio 2014
Derechos de Autor © 2014 Shen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Los datos se incluyen dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81101705 y 81272532), los proyectos de ciencia y tecnología clínica provincia de Jiangsu (centro de investigación clínica, BL2012008) y la Fundación de Ciencias naturales de la provincia de Jiangsu (BK2011852). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer no microcítico de pulmón no microcítico (CPNM) es la causa principal de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo. [1] Por desgracia, a pesar de los avances en la detección temprana del cáncer, la mayoría de los pacientes con CPNM son diagnosticadas con enfermedad en estadio avanzado, lo que resulta en un mal pronóstico, con una supervivencia media de sólo 10-12 meses. [2], [3] El desarrollo de fármacos que actúan sobre el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), tales como EGFR-TKI (gefitinib y erlotinib) ha mejorado la eficacia de la terapia con NSCLC. De hecho, la presencia de la activación de mutaciones de EGFR exón juega un papel clave en la predicción de la eficacia terapéutica de EGFR-TKI. [2] Estas mutaciones activadoras del EGFR menudo se correlacionan significativamente con una histología de adenocarcinoma-asociado, el tabaquismo, el sexo y origen étnico. [3] Por lo tanto, el EGFR-TKI han sido recomendados como tratamiento de primera línea para los pacientes con CPNM con mutaciones de EGFR. Desafortunadamente, su eficacia clínica está limitada por el desarrollo de la resistencia adquirida: la mayoría de los pacientes que inicialmente responden sería posteriormente experimentar progresión de la enfermedad con el uso continuo de TKI por cerca de 9 a 11 meses; [4] sobre 50% de los pacientes que inicialmente responden a EGFR-TKI adquirir resistencia a EGFR-TKI, mientras EGFR T790M mutación en cuentas exon20 para 50% de esta resistencia adquirida; [4] otro 20% de TKI adquirió resultados de la resistencia de la amplificación MET. [2] Todavía no está claro cómo el 30% restante de los pacientes desarrollan resistencia adquirida.
microARN (miARN), conocido para suprimir intrínsecamente ARNm por la vinculación con la región 3 'no traducida (UTR) del ARNm demostrado que modulan negativamente la expresión de genes específicos. [5], [6] como genes reguladores, miRNA regular alrededor de un tercio de los genes y desempeñan papeles importantes en funciones celulares incluyendo la proliferación, crecimiento, diferenciación y apoptosis. [7], [8] En los últimos años, el papel crucial de los miRNAs en la carcinogénesis ha sido demostrada. [9] Por otra parte, alguna función miRNAs como supresores de tumores
in vitro.
[10], [11] Por lo tanto, la sobre-expresión de estos miRNAs pueden suprimir las proteínas diana que funcionan como factores cancerígenos. [7], [12] En contraste con ARN de interferencia corto, miRNAs se cree que regulan la misma vía en múltiples niveles. [10] miR-21 es un importante miARN oncogénico, estrechamente relacionada con el crecimiento tumoral y la metástasis. [13], [14] De hecho, la expresión de miR-21 se demostró que se asocia con mal pronóstico y quimio-sensibilidad en el adenocarcinoma de colon. [15], [16] Además, anti-miR-21 suprimió el crecimiento de células de cáncer de mama a través de la regulación por disminución del factor antiapoptótico, linfoma de células B 2 (Bcl-2). [17], [18] Estos datos, tomados en conjunto, apoyan un papel importante de la expresión alterada de miR-21 durante el desarrollo del tumor. Así se investigó si el miR-21 modula la sensibilidad TKI en pacientes con CPNM también.
Hemos encontrado que la regulación de miR-21 y la baja regulación de PTEN en 47 tejidos tumorales de NSCLC en comparación con sus tejidos normales adyacentes, y que sus niveles de expresión de una correlación negativa. miR-21 expresión correlacionada con DFS más cortos en los 47 pacientes con CPNM. Además, nuestros datos muestran una buena correlación entre altos /bajos niveles de expresión de PTEN miR-21 y escasa sensibilidad TKI con la supervivencia global corta en 46 pacientes con CPNM en tratamiento con ITC. Por lo tanto, la hipótesis de que la alteración de la expresión de miR-21-PTEN modula la sensibilidad TKI en células de cáncer de pulmón. Encontramos que el miR-21 fue hasta reguladas concomitantemente con la baja regulación de PTEN en /GR células PC-9 en comparación con las células PC-9,
in vitro
. Por otra parte, la sobre expresión de miR-21 se redujo significativamente la sensibilidad a gefitinib través de la baja regulación de la expresión de PTEN y la activación de Akt y ERK vías, mientras que desmontables de miR-21 de forma espectacular restaurado sensibilidad gefitinib de /GR células 9 pc-hasta-la regulación de PTEN expresión y la inactivación de Akt y ERK vías de señalización, tanto
in vivo
y
in vitro
.
Materiales y Métodos
Materiales
gefitinib fue una especie de regalo de AstraZeneca (Tocris, Reino Unido). Los anticuerpos contra PTEN, fosfato ERK1 /2, fosfo-AKT (Ser-473), y AKT total de fueron adquiridos de Señalización Celular Tecnología (Beverly, MA). Los anticuerpos contra ERK2 se compraron desde Santa Cruz de Biotecnología (CA, EE.UU.). Los anticuerpos contra GAPDH se obtuvieron de Kangcheng Company (Shanghai, China). Lipofectamina y TRIzol reactivos se adquirieron de Life Technologies (Grand Island, NY, EE.UU.). MiR-21 imita y miR-21 inhibidor fueron proporcionados por GenePharma (Shanghai, China). La alta capacidad de ARN a ADNc kit de potencia y SYBR Green PCR Master Mix fueron adquiridos de Applied Biosystems (Carlsbad, CA). Las líneas celulares PC-9 se adquirieron de la Colección de Cultivos Tipo de la Academia de Ciencias de China, Shanghai, China. La línea de PC-9 gefitinib resistentes celular (PC-9 /GR), que fue inducida por la exposición de PC-9 células a concentraciones crecientes de gefitinib como se informó anteriormente [19], [20], fue proporcionado amablemente por el Departamento de Oncología, el hospital pulmonar de Shanghai, la Universidad de Tongji, Shanghai.
muestras clínicas
muestras de NSCLC humanos apareadas (n = 47) y muestras de tejidos adyacentes normales emparejados se obtuvieron de los pacientes sometidos a procedimientos quirúrgicos estándar en el primer Afiliado el hospital de la Universidad de Medicina de Nanjing, Jiangsu (china), con el consentimiento informado por escrito de los pacientes. Una parte de cada muestra de tejido fue inmediatamente se congelaron en nitrógeno líquido mientras que la otra parte se fijó en formalina para el examen histológico.
muestras de parafina embebido de pacientes con NSCLC (n = 46), que estaban recibiendo EGFR el tratamiento con ITC, se obtuvieron de departamento de patología del primer hospital Afiliado de la Universidad de Medicina de Nanjing, Jiangsu (china), con el consentimiento informado por escrito de los pacientes. Todas las muestras se clasifican histológicamente y se clasificaron de acuerdo con el estadio TNM por un patólogo clínico ciego. Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Revisión Institucional del primer hospital afiliado de la Universidad de Medicina de Nanjing, Nanjing (China).
Cultivo de células
pc-9 humana y PC-9 /GR celular líneas, y las células HEK293T fueron cultivadas en RPMI y DMEM, respectivamente, suplementado con 10% de suero fetal bovino, 100 unidades /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina a 37 ° C en un ambiente humidificado que contiene 5% de CO
2 .
transfección celular
HSA-mir-21 o HSA-mir-NC imita se transfectaron en células PC-9 utilizando el reactivo lipofectamina (Life Technologies), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las concentraciones finales de hsa-miR-21 o HSA-mir-NC imita para la transfección fueron 40 nM. Un procedimiento similar se utilizó para transfectar miR-21 inhibidor (40 nM) o NC en /GR células PC-9.
viabilidad de las células de ensayo
PC-9 y PC-9 /GR células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 4 × 10
3 células /pocillo y se dejaron adherir durante la noche. En paralelo, PC-9 células fueron sembradas en placas de 96 pocillos y se transfectaron con miR-21 imitador y NC durante 24 h, mientras que las células PC-9 /GR se transfectaron con miR-21 inhibidor. Después de la adhesión celular, se añadió gefitinib a una concentración final de 2,5 a 40 mmol /L. Después de 72 h de incubación, la viabilidad celular se evaluó mediante el recuento celular Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Laboratories), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cada muestra se sembró por triplicado y se realizaron tres experimentos independientes.
envasado y el establecimiento de Lentiviral línea celular estable
a desmontables de forma estable el miR-21 expresión en PC-9 /GR células, el embalaje lentiviral se utilizó el kit (Thermo Fisher Scientific). Lentivirus llevar el miR-21 o el inhibidor de control negativo (miR-NC) fue empaquetado siguiendo las instrucciones del fabricante. gen proteína fluorescente verde (GFP) se insertó en el sistema de envasado y co-expresada con miRNAs. Lentivirus fue empaquetado en células HEK293T y se secreta en el medio. Las células PC-9 /GR fueron infectados por lentivirus que llevan el miR-21 inhibidor o miR-NC en presencia de polibreno (Sigma-Aldrich), y seleccionados por puromicina (Sigma-Aldrich) durante 2 semanas para obtener pc-9 GR /MIR -21 inhibidor y PC-9 GR /líneas celulares estables miR-NC.
apoptosis ensayo
La apoptosis se midió como se describe anteriormente [21]. Brevemente, las células se trataron con tripsina y se marcaron con Alexa Fluor 647 Anexina V (Biolegend) y 7-AAD (BD Pharmingen), y se analizaron por citometría de flujo. Las células se consideraron apoptóticas cuando eran anexina V-positivas y 7-AAD-negativas.
aislamiento de ARN y cuantitativa en tiempo real PCR (qRT-PCR) análisis
Total de ARN se extrajeron de cultivaron células o muestras de tejido humano usando reactivo TRIzol según las instrucciones del fabricante. Para medir los niveles de expresión de miR-21, los ARN fueron transcritas por imprimación tallo-bucle RT RT usando PrimeScript Reactivo Kit (Takara) como se ha descrito anteriormente [21], [22]. Las secuencias de los cebadores de RT fueron los siguientes: miR-21-RT, 5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG TCAACATC -3 '; U6-RT, 5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3 '. QRT-PCR se realizó utilizando SYBR Premezcla DimerEraser (Takara) en un sistema 7900HT (Applied Biosystems). miR-21 cebadores qPCR fueron: sentido, 5'-ACACTCCAGCTGGG TAGCTTATCAGACTGA -3 '; anti-sentido, 5'-TGGTGTCGTGGAGTCG -3 '. cebadores U6 snRNA qPCR fueron: sentido, 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3 '; anti-sentido, 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3 '. La expresión de miR-21 se normalizó a los niveles de U6 y el método de ciclo umbral comparativo (2
-ΔΔCT) se utilizó con U6 como control.
extracción de proteínas y Western blotting
células o tejidos se recogieron y se lisaron en hielo durante 30 minutos en tampón RIPA (Beyotime) suplementado con 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF). Los lisados se sometieron a ensayo de Western Blot como se describe anteriormente [23] y se detecta con anticuerpos contra PTEN, fosfo-AKT (Ser-473), AKT total fosfo-ERK, total ERK, GAPDH.
La inmunohistoquímica (IHC )
, tejidos embebidos en parafina fijadas con formalina recogidas de pacientes con NSCLC (n = 46), se seccionaron a 5 micras, y se incubaron con anticuerpos contra PTEN (Cell Signaling Technology). La evaluación de las señales de IHC se realizó por dos patólogos experimentados en una forma ciega. Cinco campos de alta potencia (200 ×) fueron seleccionados al azar en todas las muestras. Los porcentajes de células tumorales se clasificaron en cinco clases semicuantitativa: 0 (≤5% de células positivas), 1 (6% -25% de células positivas), 2 (26% -50% de células positivas), 3 (51% -75 % de células positivas), y 4 (& gt; 76% de células positivas). La intensidad de la tinción se determinó también semi-cuantitativamente en una escala de 0 a 3 como sigue: 0 (negativo), 1 (débilmente positivo), 2 (moderadamente positivo), y 3 (fuertemente positivo). Los productos de las puntuaciones porcentuales de intensidad de la tinción rindieron resultados de IHC finales: 0 (negativo), + (1-4), ++ (5-8), y +++ (9-12) como se describe anteriormente [24]
.
la hibridación in situ
ISH se realizó sobre muestras de parafina incrustación de CPNM para investigar la respuesta clínica a la ITC y miR-21 expresión. Brevemente, los portaobjetos se trataron y se hibridaron con la sonda 10 pmol (LNA-modificado y DIG oligonucleótido marcado; Exiqon) complementario a miR-21, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la incubación con los fragmentos Fab anti-DIG-HRP conjugados con peroxidasa de rábano picante, las sondas hibridadas se detectaron por incubación con una solución de 3'3-diaminobencidina con núcleos contrastados con hematoxilina de Carazzi. patrones de tinción se analizaron por 3 expertos y la proporción de células tumorales teñidas positivamente se calificó como sigue: 0 (no hay células positivas), 1 (& lt; 10% de células positivas), 2 (10% -50% de células positivas), 3 ( & gt; 50% de células positivas). Las células en cada intensidad de la tinción se registraron en una escala de 0 (sin manchas), 1 (tinción débil, la luz azul o amarillo), 2 (tinción moderada, azul o amarillo), y 3 (fuerte tinción, azul oscuro o amarillo) . Para los tumores que mostraron tinción heterogénea, el patrón predominante fue considerado para la puntuación. El índice de tinción (SI) se calculó como proporción de células tumorales teñidas positivamente × intensidad de la tinción. Usando este método, la expresión de miR-21 se puntuó como 0, 1, 2, 3, 4, 6 ó 9. En caso de desacuerdo (discrepancia score & gt; 1), se volvió a examinar las diapositivas y se alcanzó un consenso de los expertos .
modelo de tumor de xenoinjerto en ratones desnudos
Para los ensayos de crecimiento tumoral, 6 semanas de edad ratones desnudos macho (BALB /cA-nu (nu /nu) fueron adquiridos de SLAC Animal Center ( Shanghai, china), y mantenerse en condiciones especiales libres de patógenos (SPF). los protocolos para experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Protección de los animales de la Universidad de Medicina de Nanjing. alícuotas de células (4 × 10
6) se suspendieron en 150 ml medio FBS-RPMI libre de DMEM y subcutánea inyectaron en el flanco posterior de ratones desnudos (n = 6). el tamaño del tumor se midió utilizando un calibrador a vernier cada siete días hasta que se sacrificaron el día 35 después de la implantación y el tumor de volumen se derivó como 0,5 × Longitud × Ancho
2.
El análisis estadístico
Los valores se obtuvieron a partir de al menos tres experimentos independientes y se presentan como medias ± sE. Student no pareada de
t
se llevó a cabo la prueba y los valores se consideraron significativamente diferentes cuando
P
. & Lt; 0,05
Resultados
Sobre regulación de miR-21 y la baja regulación de PTEN se correlaciona negativamente con DSF más corto en los tejidos tumorales de pacientes con NSCLC humanos
Para determinar los niveles de expresión de la proteína de miR-21 y PTEN en los tejidos tumorales de pacientes con NSCLC humanos, se evaluó 47 pares de cáncer las muestras de tumor y los tejidos normales adyacentes (Tabla S1) por QRT-PCR y encontraron una expresión significativamente mayor de miR-21 en 37/47 (78,7%) en los tejidos tumorales en comparación con tejidos normales adyacentes (fig. 1A). Desde PTEN es uno de los objetivos importantes de miR-21, [25], [26] se determinó la relación entre la expresión de miR-21 y PTEN en NSCLC humano especímenes tanto por inmunoblot e inmunohistoquímica (IHC). Se encontró que los niveles de proteína PTEN se redujeron significativamente en los tejidos 34/47 (72,3%) de tumores en comparación con los normales adyacentes (Fig. 1B). Además, los niveles relativos de expresión de PTEN fueron evaluados por dos patólogos experimentados en una forma ciega, y marcados con el final de resultados de IHC 0 (negativo), + (débil), ++ (moderada) y +++ (fuerte) (Fig. 1C ). Los niveles de miR-21 se redujeron a alta intensidad PTEN (Fig. 1D). Además, el análisis gráfico de dispersión mostró una correlación inversa entre el miR-21 niveles de expresión y resultados de IHC señales PTEN (Fig. 1E). Estos resultados demostraron que los niveles de expresión de miR-21 estaban inversamente correlacionados con los niveles de PTEN en los tejidos de NSCLC. A fin de evaluar la correlación entre miR-21 /niveles de expresión de PTEN y el pronóstico en pacientes con CPNM, se utilizó el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier y la prueba de log-rank para evaluar las normalizados de miR-21 niveles de expresión (tumor /normal) y la supervivencia libre de enfermedad ( DFS). Los resultados mostraron que los pacientes con altos niveles de miR-21 expresión tenían una enfermedad más corta supervivencia libre (DFS) en comparación con los pacientes con baja expresión de miR-21 (Fig. 1F)
.
(A) Los niveles de expresión de miR 21 fueron hasta reguladas en 37/47 pares de tejidos de NSCLC relativamente a los especímenes normales adyacentes. MiR-21 se analizaron por tallo-bucle QRT-PCR, y se normalizaron a los niveles de U6. Plegables cambios se obtuvieron por la relación de miR-21 abundancia en los tejidos de cáncer a que en los tejidos normales adyacentes. *
p Hotel & lt; 0,05 indica una diferencia significativa comparando la expresión de miR-21 en tejidos tumorales con los tejidos normales adyacentes. (B) los niveles de proteína PTEN Representante en los tejidos de NSCLC (T) y las muestras normales adyacentes (N) evaluados por inmunoblot, GAPDH se utilizó como control de carga. (C) PTEN inmunohistoquímica (IHC) los resultados de las secciones de NSCLC, 0 (negativo), + (positivo débil), ++ (moderadamente positivo) y +++ (muy positiva). (D) Análisis de correlación entre los niveles de proteína PTEN y miR-21 niveles de expresión en tejidos de NSCLC. resultados de IHC se utiliza para describir los niveles de proteína PTEN en los tejidos tumorales, evaluados por los patólogos experimentados en una forma ciega. curvas de regresión (E) lineales de expresión de miR-21 y los niveles de proteína PTEN. curvas (F) de Kaplan-Meier que representa la supervivencia libre de enfermedad según la expresión de miR-21. El valor de corte de los subgrupos (alta y baja) de miR-21 nivel de expresión era el valor percentil 50.
Sobre regulación de miR-21 y la baja regulación de la proteína PTEN se asocian con mala TKI sensibilidad y menor supervivencia global en los tejidos tumorales de pacientes con NSCLC humanos sometidos a tratamiento con ITC
Los estudios anteriores han demostrado que el miR-21 induce la resistencia a cisplatino en CPCNP [27]. Además, Wang et al. encontró que el miR-214 regula la resistencia adquirida a gefitinib a través de la PTEN /AKT Camino en líneas celulares de EGFR mutante [28]. Teniendo en cuenta el efecto potencial de los miARN en la modulación de la sensibilidad al fármaco, se investigó si la alteración de la expresión de miR-21 /PTEN se correlaciona con la sensibilidad de TKI. Después de un seguimiento del tratamiento clínico de los 47 pacientes con CPNM, encontramos sólo 5 pacientes que utilizaron el tratamiento con ITC. Un paciente que muestra una respuesta parcial (RP) mostró miR-21 nivel de expresión (tumor /normal) de sólo el 0,16; tres pacientes con enfermedad estable (SD) muestran el promedio de miR-21 niveles de expresión de 2,57; un paciente con una enfermedad progresiva (PD) mostró una alta expresión de miR-21 a 33,15 (Fig. 2A). ensayos de IHC en los tejidos obtenidos a partir de estos cinco pacientes mostraron que los niveles de expresión PTEN correlacionados negativamente con la respuesta clínica de TKI: un tejido de un paciente PD mostró expresión PTEN de (-); PTEN expresión en los cuatro pacientes restantes con PR y SD varió de (++) a (+++) (Fig. 2B). A fin de confirmar nuestros hallazgos, se evaluó el miR-21 niveles de expresión utilizando ensayos ISH (Fig. 2D) y los niveles de expresión de PTEN por IHC de muestras incluidas en parafina de 46 pacientes con CPNM tratados con TKI (gefitinib o erlotinib) como tratamiento y seguimiento a su clínica respuesta y estado de supervivencia (Tabla S2). Como era de esperar, los niveles de expresión de miR-21 en pacientes con EP fueron significativamente mayores que los de los grupos PR y SD (Fig. 2C). Mayores de miR-21 niveles de expresión también indicaron más corta supervivencia global en pacientes tratados con ITC (Fig. 2E). Además, PTEN niveles de expresión en los pacientes con EP fue significativamente menor que en PR y los grupos de pacientes SD (Fig. 2f), y una mayor expresión PTEN correlacionado con la supervivencia global más tiempo en los pacientes tratados con TKI (Fig. 2G). Estos hallazgos son todos de acuerdo y sugieren la implicación de la alta expresión de miR-21 PTEN /baja en la modulación de la sensibilidad TKI en CPNM
.
(A) La respuesta clínica del TKI y miR-21 niveles de expresión en pacientes con CPNM 5 evaluada por Q-RT-PCR. (B) La respuesta clínica de los niveles de expresión TKI y PTEN en 5 pacientes con CPNM probados por inmunohistoquímica. PR (respuesta parcial) y SD (enfermedad estable) pacientes tuvieron relativamente más bajos de miR-21 y los niveles de expresión más altos niveles de expresión de PTEN en comparación con Pd (enfermedad progresiva) de los pacientes. (*
p Hotel & lt; 0,05). análisis (C) La correlación se realiza entre el miR-21 niveles de expresión y la respuesta clínica al ITC. (D) representativos de miR-21 niveles y las puntuaciones en los tejidos sometidos a tratamiento de NSCLC TKI evaluado mediante hibridación in situ. curvas (E) de Kaplan-Meier que representa la supervivencia global según la expresión de miR-21 en 46 pacientes con CPNM en tratamiento ITC. análisis (F) La correlación se realiza entre los niveles de expresión PTEN y la respuesta clínica al ITC. curvas (E) de Kaplan-Meier que representa la supervivencia global de acuerdo a la expresión de PTEN en 46 pacientes con CPNM en tratamiento ITC.
PC9 /GR células muestran una resistencia significativa a gefitinib, sobre regulación de miR-21, baja regulación de PTEN y la activación de AKT, ERK en comparación con las células PC9
con el fin de probar si el efecto de la alta expresión de PTEN miR-21 /baja en la modulación de la sensibilidad TKI, que selecciona PC-9, una línea celular sensible TKI, y la línea celular resistente a gefitinib PC-9 /GR (amablemente proporcionados por el Departamento de Oncología, hospital pulmonar de Shanghai, la Universidad de Tongji, Shanghai) fueron inducidos por exposición de las células PC-9 a concentraciones crecientes de gefitinib como se informó anteriormente . [19], [20] Se utilizó el ensayo de CCK-8 para detectar la sensibilidad gefitinib en PC-9 y GR células 9 pc-y encontró que 9-pc GR células fueron resistentes a gefitinib en comparación con PC-9 células (Fig. 3A , Fig. 3B). La IC50 para gefitinib en PC9 /células GR eran aproximadamente 2,54 mol /L, 200times mayor que en las células PC9 (0,0127 mol /L, P & lt; 0,001) (Fig. 3C). Después de 72 h de /l tratamiento con gefitinib 1 mol, se utilizó citometría de flujo para evaluar las tasas de apoptosis inducida gefitinib. Nuestros datos muestran tasas de apoptosis significativamente más altos en las células PC9 en comparación con PC9 /GR (15,04% vs. 3,08%) (Fig. 3D). QRT-PCR datos mostraron que el miR-21 fue 3,70 veces aumentada en células PC9 /GR en comparación con las células PC9 (Fig. 3E). El uso de ensayos de Western-blot, puso de manifiesto la pérdida de PTEN y la activación de AKT y ERK en células PC-9 GR en comparación con las células PC-9, pero no mostró AKT total y diferencia total expresión de ERK entre las dos líneas celulares (Fig. 3F, 3G).
(a, B) PC-9 y /GR células fueron tratadas con gefitinib durante 72 h en 0,1% de suero que contiene RPMI 9 pc-. El crecimiento celular se midió por CCK-8 de ensayo por triplicado. El crecimiento celular a las 72 h se representa frente a la concentración de gefitinib. (C) gefitinib IC 50 en PC-9 y /GR células con ensayos por triplicado realizadas pc-9. ** Indica p & lt; 0,01. (D) las tasas de apoptosis de PC-9 /GR y las células PC-9 inducida por gefitinib fueron evaluados por citometría de flujo. Las células PC-9 /GR y PC-9 fueron tratados con 1 mol /L de gefitinib durante 72 horas antes de la evaluación de la apoptosis. (E) los niveles de expresión de miR-21 en PC-9 y /GR células evaluadas por tallo-bucle QRT-PCR-9 PC, y se normalizaron a los niveles U6. ensayos por triplicado se realizaron para cada muestra de ARN. Las diferencias significativas se indican con * (P & lt; 0,05). (F) PTEN, p-AKT, AKT, p-ERK, las proteínas ERK en pc-9 y /GR células analizadas por Western blot 9-pc. (G) La cuantificación de análisis de transferencia Western mostró que la expresión de proteína PTEN se redujo en-9 PC /célula GR en comparación con las células PC-9 ** P & lt; 0,01; p-AKT y p-ERK proteínas de expresión fueron hasta reguladas en las células PC-9 GR en comparación con el PC 9-células ** P & lt; 0,01; no hubo diferencias significativas de AKT total y proteínas ERK totales entre PC-9 y /GR células.
elevada expresión de miR-21 gefitinib sensibilidad reducida, una mayor capacidad invasora 9-PC y la reducción de gefitinib inducidas apoptosis en células PC-9 por abajo de la regulación PTEN y la activación de Akt y ERK vías
Nuestros resultados descritos anteriormente mostraron que el miR-21 estaba regulada hacia arriba y PTEN se había reducido regulado en 9-PC GR células en comparación con PC-9 células. Por lo tanto, la hipótesis de que el miR-21 /PTEN alteración expresión juega un papel importante en la modulación de la sensibilidad gefitinib en PC con 9 celdas y 9-PC /GR células. Transfectadas las células PC-9 con el miR-21 imita y luego co-transfectadas con estas células PTEN plásmido para observar si PTEN podría rescatar el miR-21 inducida por los cambios biológicos en células PC-9. qPCR datos confirmaron que la expresión de miR-21 fue significativamente mayor en-21 miR células transfectadas imitan en comparación con las células transfectadas NC, ** p & lt; 0,01 (Fig. 4A). A continuación, se utilizó el kit de ensayo de CCK-8 para detectar la sensibilidad gefitinib 24 h después de la transfección. Como era de esperar, el miR-21 redujo la sensibilidad gefitinib en células PC-9 y la sobre-expresión PTEN podría rescatar a este cambio de sensibilidad a gefitinib. ** P & lt; 0,01 (Fig. 4B, 4C). Para observar otros cambios de parámetros después de miR-21 de la transfección, se realizó un ensayo transwell para determinar la influencia de miR-21 en la capacidad invasiva. Se encontró que el miR-21 transfectadas PC-9 células eran más invasivo que el grupo NC y la sobre expresión PTEN podrían rescatar esta capacidad invasiva ** p & lt; 0,01 (Fig. 4D, 4E). Con el fin de detectar el impacto de miR-21 en gefitinib inducida por apoptosis, las células descritas anteriormente fueron tratados con 1 mol /L gefitinib durante 72 horas. Mediante citometría de flujo, se encontró que en el PC-9 células, se observó una marcada disminución de la muerte celular programada en 21 miR células transfectadas imitan en comparación con las células NC transfectadas y miR-21 células mímica y el plásmido PTEN co-transfectadas después del tratamiento con gefitinib (fig. 4F). Para entender mejor los mecanismos moleculares implicados en el miR-21 inducida por la resistencia a gefitinib en células PC-9, se utilizaron ensayos de Western-blot para evaluar la expresión de proteínas relacionadas. En las células PC-9, elevada expresión de miR-21 dio lugar a la represión de la expresión de PTEN y la activación de p-AKT y p-ERK en comparación con el grupo de Carolina del Norte, pero no cambió la expresión de la proteína total de AKT y EKR. La sobreexpresión de la expresión de PTEN podría rescatar a la sobre regulación de miR-21 inducida por la activación de p-AKT y p-ERK. (Fig. 4G, 4H).
(A) los niveles de expresión de miR-21 en PC-9 /NC + pCMV 6 células transfectadas, PC-9 /miR-21 imitan + pCMV 6 células transfectadas y /miR-21 células transfectadas plásmido + PTEN imitan pC-9 fueron evaluados por tallo-bucle QRT-PCR, y se normalizaron a los niveles U6. ensayos por triplicado se realizaron para cada muestra de ARN. Las diferencias significativas se indican con ** (P & lt; 0,01). (B) la sensibilidad gefitinib de PC-9 /NC + pCMV 6 células transfectadas, PC-9 /miR-21 mímica + pCMV 6 células transfectadas y 9 pc-/miR-21 células imitan + PTEN plásmido transfectadas fueron evaluados por CCK-8 ensayo. (C) IC50 para gefitinib en PC-9 /NC + pCMV 6 células transfectadas, PC-9 /miR-21 imitan + pCMV 6 células transfectadas y /miR-21 células transfectadas plásmido + PTEN imitan 9-pc. ** P & lt; 0,001,#P & lt; 0,01. (D) PC-9 /NC + pCMV 6 células transfectadas, PC-9 /miR-21 mímica + pCMV 6 células transfectadas y 9 pc-/miR-21 células imitan + PTEN transfectadas plásmidos se utilizaron para ensayos de invasión celular. Invasión células teñidas en un 0,1% de cristal violeta se contaron 24 h después de la siembra. Paneles superiores: fotografías representativas de células invasivas (x200). (E) Número de células invasivas por campo se obtuvo a partir de al menos tres pocillos replicados y representada por la media ± SD (gráfico inferior). ** Indica diferencia significativa entre pc-9 /NC + pCMV 6 células transfectadas y + pCMV 6 células transfectadas pc-9 /miR-21 imitador (P & lt; 0,01). ## Indica una diferencia significativa entre el PC-9 /miR-21 + 6 pCMV células transfectadas mímicos y PC-9 /miR-21 mímica + células transfectadas plásmido PTEN (P & lt; 0,01). (F) Apoptosis tasas de PC-9 /NC + pCMV 6 células transfectadas, PC-9 /miR-21 mímica + pCMV 6 células transfectadas y PC-9 /miR-21 mímica + PTEN células plásmido transfectadas inducidas por gefitinib fueron evaluados por citometría de flujo. Todas las células se trataron con 1 mol /L gefitinib durante 72 horas antes de la evaluación de la apoptosis. (G) PTEN, p-AKT, AKT, p-ERK, y ERK proteínas de PC-9 /NC + pCMV 6 células transfectadas, PC-9 /miR-21 mímica + pCMV 6 células transfectadas y PC-9 /miR 21 células plásmido transfectado + PTEN imitan se analizaron por Western blot. (H) La cuantificación de Western blot mostró baja regulación de la proteína PTEN en el PC-9/21 imita + pCMV 6 células transfectadas en comparación con-9 PC /+ pCMV 6 células transfectadas NC (* P & lt; 0,05) y PC-9 /miR-21 células transfectadas plásmido + PTEN mímicos (# P & lt; 0,05); p-AKT y p-ERK proteínas de expresión fueron reguladas en el PC-9/21 imita + pCMV 6 células transfectadas en comparación con-9 pc /+ pCMV 6 células transfectadas NC (* P & lt; 0,05) y PC-9 /miR 21 células imitan + PTEN plásmido transfectado (# P & lt; 0,05). No hubo diferencias significativas en el total de Akt y ERK proteínas totales entre las tres células.
Desmontables de miR-21 restaura la sensibilidad gefitinib, reduce la capacidad invasiva y mejorado gefitinib en la apoptosis inducida por PC-9 /GR células por hasta la regulación de PTEN y la inactivación de la AKK y ERK
Para confirmar aún más la función de miR-21 sobre la regulación de la sensibilidad gefitinib en PC-9 /GR células, PC-9 /GR células fueron transfectadas con el miR -21 inhibidor para disminuir miR-21 expresión y luego co-transfectadas estas células con PTEN siRNA. Primero probamos el efecto de PTEN siRNA, transfectadas /GR células con dos PTEN siRNAs y scramble siRNA (siSCR) 9-pc. Tanto el BM y los ensayos de QRT-PCR mostraron que siPTEN#1 podría disminuir la proteína PTEN (Fig. S1 A), y el nivel de expresión de mRNA (Fig. S1B) con más eficacia que siPTEN#2. Así que elegimos siPTEN#1 para hacer más experimento. qPCR resultados confirmaron que el miR-21 expresión se redujo significativamente en el miR-21 células transfectadas de inhibidor en comparación con las células NC, ** p & lt; 0,01 (Fig. 5A). CCK-8 datos del ensayo mostraron que el miR-21 desmontables disminuyó significativamente la sensibilidad a gefitinib de PC-9 /GR y reducción del nivel PTEN expresión podría restaurar la sensibilidad a gefitinib de PC-9 /GR ** p & lt; 0,01 (Fig. 5B, 5C). Yang et al.