Extracto
Antecedentes y objetivos
cáncer colorrectal (CCR) desarrollo esporádico es un proceso secuencial que muestra la dependencia con la edad, no controlado la proliferación epitelial y una disminución de la apoptosis. Durante la proliferación celular y la apoptosis crecimiento juvenil están bien equilibrados, que puede ser perturbado durante el envejecimiento. Nuestro objetivo fue correlacionar las actividades de proliferación y apoptosis en el envejecimiento humano epitelio del colon y el cáncer colorrectal. También probamos la biología molecular subyacente en relación con la proliferation- y alteraciones de genes reguladores de la apoptosis de expresión.
Materiales y Métodos
biopsias colorrectales de niños sanos (n
1 = 14), sano adultos (n
2 = 10), adenomas adultos (n
3 = 10) y CRC (n
4 = 10) en los adultos fueron probados para Ki-67 inmunohistoquímica y ensayo de apoptosis TUNEL. Mitosis- y la expresión de genes relacionados con la apoptosis también se ha estudiado en niños sanos (n
1 = 6), adultos (n
2 = 41) y en muestras de CRC (n
3 = 34) en HGU133plus2. 0 plataforma de microarrays. alteraciones medidos fueron confirmados con RT-PCR tanto en conjuntos de muestras dependientes e independientes (n
1 = 6, n
2 = 6, n
3 = 6).
índice mitótico (MI) fue significativamente mayor (p & lt; 0,05) en juvenil intacto (MI = 0,33 ± 0,06) y las muestras de CRC (MI = 0,42 ± 0,10) en comparación con muestras de adultos sanos (MI = 0,15 ± 0,06). En contraste, el índice apoptótico (AI) se redujo en los niños (0,13 ± 0,06) y significativamente más baja en el cáncer (0,06 ± 0,03) en comparación con muestras de adultos sanos (0,17 ± 0,05). Ocho proliferation- (por ejemplo MKI67, CCNE1) y 11 genes de la apoptosis asociada (por ejemplo, TNFSF10, IFI6) había alterado la expresión de ARNm tanto en el curso del envejecimiento normal y la carcinogénesis, induciendo principalmente la proliferación y la reducción de la apoptosis en comparación con adultos sanos. Ocho genes de proliferación asociada incluyendo CCND1, CDK1, CDK6 y 26 genes reguladores de la apoptosis (por ejemplo SOCS3) se expresan de forma diferente entre los grupos juveniles y de cáncer en su mayoría apoyan el crecimiento celular pronunciada en el CCR.
Conclusión
muestras colorrectales de los niños y pacientes con CRC se pueden caracterizar por el aumento de manera similar proliferativa y la disminución de las actividades apoptóticas en comparación con las muestras de colon sanos de los adultos. Por lo tanto, los teléfonos alteraciones cinéticas durante el desarrollo del cáncer colorrectal muestran rejuvenecimiento no controlada en comparación con el crecimiento celular controlado en el epitelio del colon juvenil
Visto:. Leiszter K, Galamb O, F Sipos, Krenács T, Veres G, Wichmann B, et al. (2013) Desarrollo de cáncer colorrectal esporádico Muestra Rejuvenescence En cuanto epitelial proliferación y apoptosis. PLoS ONE 8 (10): e74140. doi: 10.1371 /journal.pone.0074140
Editor: Ming Tat Ling, Universidad de Tecnología de Queensland, Australia |
Recibido: 19 Marzo, 2013; Aceptado: July 29, 2013; Publicado: 3 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Leiszter et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el húngaro Fondo de Investigaciones Científicas (Országos Tudományos Kutatási Alapprogram /OTKA-K /) 105530. los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.
Conflicto de intereses: los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la renovación normal de las células del epitelio del colon sano toma alrededor de 5 días, a través de la proliferación celular, la diferenciación y la apoptosis.. La ubicación de los diferentes tipos de células epiteliales en las criptas es muy típico. Las células en crecimiento principalmente residen en la base de las criptas, células diferenciadas en la zona media, mientras que las células apoptóticas se encuentran cerca de la superficie luminal. Varias vías moleculares juegan un papel importante en el fisiológica auto-renovación de las células epiteliales en el intestino grueso humano [1] - [4].
Sin embargo, la regulación de los mecanismos de proliferación y apoptosis puede alterar durante el envejecimiento normal y colorrectal carcinogénesis. El envejecimiento es un mecanismo fisiológico que comienza después de la concepción. Afecta casi todas las células en el organismo con la posible excepción de las células madre y células tumorales. cambios macroscópicos y microscópicos están presentes en el tracto gastrointestinal de envejecimiento incluyendo el intestino grueso [5] - [6]. Los cambios en la actividad proliferativa en el curso del envejecimiento se han analizado en modelos animales en los estudios anteriores [7] - [8]. De acuerdo con los resultados de
Mandir et al
, la regeneración epitelial más intensivo (proliferación y apoptosis) se ha demostrado en ratas jóvenes.; y los autores concluyeron que los cambios dramáticos en epitelio del colon joven pueden estar relacionadas con el desarrollo intestinal. Sin embargo, el envejecimiento gastrointestinal normal, no tiene ningún efecto sobre la renovación epitelial [7]. Por el contrario, en las poblaciones animales de entre el aumento de la proliferación celular y se observó una disminución de la apoptosis en epitelio del colon y pensado para facilitar la proliferación celular no controlada y la tumorigénesis, lo que podría explicar la mayor incidencia de cáncer colorrectal en el ser humano de edad avanzada [8].
además, algunas de estas alteraciones puede también estar relacionada con la carcinogénesis colorrectal. Los cambios en el crecimiento celular epitelial y la muerte celular programada también fueron estudiados previamente en diferentes etapas de la carcinogénesis colorrectal, pero los resultados no son concordantes. La proliferación celular y la apoptosis pueden llegar a ser mal regulada y la producción de células y la célula de pérdida desequilibrada determinar el comportamiento de premalignas o trastornos malignos y el crecimiento tumoral [9] - [12]
La tasa de detección de adenomas y la incidencia de avanzada. adenomas colorrectales y cáncer elevan continuamente después de la edad de 40-50, que muestra una fuerte dependencia de la edad [13] - [14]. cánceres de colon esporádicos resultan principalmente en la población adulta mayor de manera similar a numerosas lesiones neoplásicas y precancerosas. Según el modelo Vogelstein [15], el cáncer colorrectal se desarrolla a partir de epitelio normal a través de adenoma pre-maligno en un proceso de múltiples pasos que lleva varios años. Además de los genes (por ejemplo, APC, KRAS, DCC y TP53) tradicionalmente implicados en este modelo la progresión del cáncer, recientemente nuevos genes con expresión de ARNm alterando también se han sugerido para ser contribuir a la transformación maligna del epitelio de colon [16] - [18].
Hay varias alteraciones genéticas y epigenéticas que pueden demostrar una posible relación entre el envejecimiento y la carcinogénesis colorrectal. La acumulación de mutaciones en el ADN y daños, la hipermetilación del promotor, las alteraciones en la reparación del ADN, la actividad de la telomerasa y el metabolismo celular puede afectar cada vez más poblaciones de edad que conducen a la proliferación celular elevada y disminución de la apoptosis, que puede culminar a la transformación maligna y la proliferación incontrolada de células [19].
al mismo tiempo, varios estudios en humanos y animales han puesto de manifiesto la regulación opuesta de algunas vías moleculares durante el envejecimiento normal y la carcinogénesis. A diferencia de envejecimiento normal, la proliferación de células de cáncer muestran un aumento de metabolismo, que se caracteriza por la actividad proliferativa continua y la desdiferenciación, que pueden producir proteínas embrionarias y son potencialmente inmortal por escapar de la apoptosis [20]. En particular, las proteínas reguladores de la apoptosis muestran distinta expresión en células senescentes y cáncer destacados por la regulación a la baja del tumor proteína inductora de apoptosis supresor p53 [21] y Fas /CD95 proteína [22] y la sobreexpresión de antiapoptótico proto-oncogén Bcl-2 en el cáncer en comparación con las células normales de envejecimiento [23] - [25]. Los oncogenes tales como Ras, factores de transcripción, por ejemplo, tirosina-quinasa receptores de señal de crecimiento Myc, y relacionados de transducción-por ejemplo, miembros de la familia EGFR están regulados en algunos tipos de cáncer, mientras que en downregulated células senescentes [26] - [28]
El desarrollo del cáncer puede ser considerada como un "rejuvenecimiento" incontrolada local, utilizando las mismas vías moleculares. pero con la regulación contraria. Liberalizadas proliferación celular y la apoptosis vías pueden permitir ventajas de supervivencia de células de cáncer frente a células senescentes adyacentes, debido a la capacidad perdida de cáncer para el envejecimiento normal [20]. Aumento de la proliferación de células epiteliales en el tracto gastrointestinal puede observarse no sólo en el cáncer colorrectal, sino también en el desarrollo embrionario y juvenil. Una vía esencial que juega un papel fundamental tanto en el desarrollo del intestino y en los cánceres colorrectales esporádicos o familiares es la Wnt /β-catenina señalización [29] - [30].
Como sabemos, no existe un estudio centrado en la regulación de la proliferación y la apoptosis en el epitelio colorrectal humano de menores en relación con el envejecimiento normal y la carcinogénesis. El propósito de este estudio fue analizar la actividad proliferativa y apoptótica en el epitelio del colon humano en el curso del envejecimiento normal y la carcinogénesis colorrectal, tanto a nivel de expresión de proteínas y genes. biopsias colorrectales que representan la etapa de crecimiento controlado de menores, el estado de salud de adultos y el desarrollo incontrolado del cáncer colorrectal se ensayaron para determinar posibles correlaciones.
Materiales y Métodos
Pacientes y muestras
Después consentimiento informado, se tomaron muestras de biopsia de colon durante la intervención endoscópica de rutina en el Departamento de Medicina interna y el 1 Departamento de pediatría, Universidad de Semmelweis, Budapest, Hungría segundo. En total, 44 muestras de tejido fueron analizados en el estudio inmunohistoquímico (14 niños sanos, 10 adultos sanos, 10 adenomas de adultos y 10 CRCs de adultos); 81 muestras de biopsia se analizaron en el análisis de microarrays (6 niños sanos y 41 adultos sanos y 34 CRCs de adultos); y 36 muestras de biopsia estaban involucrados en la validación de PCR en tiempo real (12 niños sanos, 12 adultos sanos y 12 CRC de los adultos). Setenta y cinco (microarrays de las muestras de adultos) se habían hibridado anterior; sus archivos de datos se utilizaron en unos estudios publicados anteriormente utilizando diferentes comparaciones [31] - [32] y están disponibles en la base de datos de genes Expession Omnibus (número de acceso de la serie: GSE10714 y GSE37364). Los conjuntos de datos de los recién hibridados 6 microarrays se registran en el número de acceso en serie GSE37267. Control de los niños fueron remitidos a la consulta externa con sangrado rectal, estreñimiento o dolor abdominal crónico. Ileocolonoscopia era parte de su procedimiento de diagnóstico (excluir una enfermedad orgánica) y las muestras de biopsia mostró aspecto macroscópico e histología normal. Cada espécimen fue verificado por histopathologists.
Para la inmunohistoquímica muestras de biopsia de colon se fijaron rutinariamente en formol y embebidos en parafina. Para los estudios de ARNm, las muestras de colonoscopia se almacenaron en RNALater reactivo (Qiagen Inc, Germantown, US) a -80 ° C antes de la extracción de ARN total para el análisis de la expresión génica y estudio Taqman RT-PCR. aprobaciones éticas (Nr .: 69/2008 y 202/2009) para este estudio fueron emitidas por la Ética de Investigación de la Universidad de Semmelweis (Budapest, Hungría) el Comité Institucional de Ciencia y Regionales y. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito por adelantado de todos los participantes adultos y de los familiares, cuidadores o tutores en el nombre de los menores /niños aprobados por los comités de ética. clinicopatológica especificación detallada de las muestras de los pacientes se resumen en la
Tabla 1 | y
Cuadro 2
.
La inmunohistoquímica para la proliferación celular
se recogieron muestras archivadas de 14 biopsias de colon histológicamente normales de los niños, 10 biopsias de colon normales de adultos, así como adenomas 10 adultos y 10 CRC durante la endoscopia de rutina. 1 mm de diámetro núcleos fueron perforados a cabo a partir de bloques de parafina de muestras de adultos y se recogen en microarrays de tejidos (TMA). Cuatro micras de espesor secciones cortadas tanto desde el TMA y de los niños individuales muestras de biopsia se dewaxed y rehidratada por inmunotinción.
Después de la recuperación de antígenos en un 9,0 tampón Tris-EDTA pH usando un horno microondas a 900 W durante 10 minutos y después a 370 W durante 40 min, el bloqueo de peroxidasas endógenas en peróxido de hidrógeno 1% disuelto en metanol y de los sitios de unión no específica utilizando 1% de albúmina de suero bovino durante 20 min se lleva a cabo cada uno. Los portaobjetos se incubaron con anticuerpo monoclonal de ratón anti-Ki-67 anticuerpo (Clon: MIB-1, 1:100, Dako, Glostrup, Dinamarca) durante 60 minutos en una cámara humidificada y luego con IgG anti-ratón F (ab ')
2 Alexa Fluor 546 conjugado (1:200, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) durante 30 min.
detección de apoptosis mediante la TDT mediada por dUTP nick de fin de etiquetado (TUNEL) ensayo de
después de la digestión con proteinasa-K (20 g /ml, 20 min), 50 l TUNEL (TUNEL In Situ Cell Death Kit de detección, fluoresceína, Roche, 11684795910) mezcla de reacción (la enzima TdT 5 l + 45 dUTP l) se añadió a la secciones de tejido y TMA diapositivas. A continuación, las muestras se incubaron en una cámara humidificada oscuridad a 37 ° C durante 120 minutos. Los núcleos celulares se tiñeron con Hoechst (5 l colorante Hoechst + 10 ml de TBS, 1 min, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.).
Recuento de mitótico y el índice de apoptosis en las diapositivas Digital
muestras de biopsia manchada y TMA diapositivas fueron digitalizadas con un escáner digital de alta resolución (Pannoramic Scan, 3DHISTECH Ltd. Budapest, Hungría) mediante el escaneo fluorescente de múltiples capas con una alta apertura numérica (0,8) x 20 lente objetivo y un alto rango dinámico AxioCam MRM Rev.3 cámara en blanco y negro conectado al escáner. preparaciones digitales se accede a través de un monitor de ordenador y analizados utilizando el software Pannoramic Viewer (versión 1.11.43.0). El módulo de software de marcador del contador que resulta en anotaciones permanentes en las células contadas se utilizó para estimar la proporción relativa de células proliferativas, apoptóticas y normales.
Ki-67, TUNEL y Hoechst positividades aparecieron todos como fuerte etiquetado nuclear en el diapositivas. Dependiendo del tamaño de la muestra, se contaron las células epiteliales 500-1000 longitudinales en criptas bien orientadas. Hemos determinado la relación proliferativa-apoptótica (PAR: proporción de células proliferativas y apoptóticos en las criptas), el índice mitótico (IM: la proporción de células proliferantes y células totales contadas en las criptas) y el índice apoptótico (AI: La proporción de apoptosis las células y las células totales contadas en las criptas).
ARNm microarrays de análisis de la expresión
el ARN total fue extraído por medio de RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc., Germantown, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Cantidad de ARN aislado se caracterizó por la medición de absorbancia (NanoDrop ND-1000 Espectrofotómetro, NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, EE.UU.). Calidad de ARN aislado fue probado con electroforesis en gel capilar (2100Bioanalyzer y RNA 6000 Pico Kit /Agilent Inc., Santa Clara, CA, EE.UU. /). sondas biotiniladas de ARNc se sintetizaron 1-8 g de ARN total y fragmentado usando el de un ciclo Target Labeling and Control Kit (http://www.affymetrix.com/support/downloads/manuals/expression_s2_manual.pdf), de acuerdo con la Affymetrix descripción. Veinte microgramos de cada muestra de cRNA fragmentado se hibridó en HGU133 Plus2.0 array (Affymetrix) a 45 ° C durante 16 h. Los portaobjetos se lavaron y se tiñeron usando Fluidics la estación 450 y el método de tinción de amplificación anticuerpo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. señales fluorescentes se detectaron mediante escáner GeneChip 3000 (Affymetrix).
TaqMan RT-PCR
Después de análisis de microarrays de expresión génica, los resultados se compararon con otros conjunto de datos disponibles en la base de datos Gene Expression Omnibus (http : //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo; número de serie de la adhesión es GSE18105). reacción en cadena de la polimerasa TaqMan se utilizó para medir la expresión de ARNm de 12 genes seleccionados, la participación en la regulación del ciclo celular, proliferación o apoptosis, en (6 hijos histológicamente intactas, 6 adultos histológicamente intacta y 6 muestras de adultos CRC) originales y conjuntos independientes de muestras ( 6 niños histológicamente intactas, 6 adultos histológicamente intacta, 6 CRC muestras de adultos). 18S ARN ribosomal y GAPDH se utilizaron como referencia.
Se realizaron la extracción de ARN, calidad y cantidad de los controles totales como se ha descrito anteriormente. Utilizando la alta capacidad de cDNA transcripción reversa kit con RNasa Inhibidor, 1 g de ARN total por muestra se sometió a transcripción inversa (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.). La calidad de ADNc se comprobó por SDHA PCR en tiempo real (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basilea, Suiza). A continuación, se utilizó cDNA plantilla 16,7 ng por muestra para el análisis de expresión de genes seleccionados con la expresión génica TaqMan Master Mix (Life Technologies). La medición se llevó a cabo en LightCycler 480 (Roche) con formato de detección Mono Color La hidrólisis de la sonda /UPL Probe. Después de desnaturalización a 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos de PCR se llevaron a cabo (amplificación a 95 ° C durante 15 segundos, y a 60 ° C durante 1 min).
Evaluación estadística
para el análisis estadístico de Ki-67 y la inmunotinción TUNEL resultados se aplicó el test de ANOVA y post-test de Tukey HSD. En ambos métodos fue criterios de significación p. & Lt; 0,05
Para la expresión de mRNA perfiles de expresión de los vectores Affymetrix fueron principalmente pre-procesadas por el método de corrección de fondo GCRMA con cuantil normalización y resumen de mediana polaco. Se aplicó SAM análisis para la determinación de los genes proliferation- y reguladores de la apoptosis con la alteración de la expresión de ARNm. Se utilizaron los siguientes criterios SAM: LogFC≥abs 1, P-value & lt; 0,05. Todos estos genes se compararon y los expresados diferencialmente los se investigaron más. La expresión de cada gen seleccionado entre los diferentes grupos de muestras se analizaron por ANOVA y post-test de Tukey HSD
Los conjuntos de datos están disponibles en el banco de datos Gene Expression Omnibus (http:. //www.ncbi.nlm.nih .gov /geo /), la serie de números de acceso:. GSE10714, GSE37364 y GSE37267
Para la validación de PCR en tiempo real se analizaron 12 muestras en cada etapa (niños, adultos sanos normales y /adulto CRC). Para la normalización, 18S ribosomal RNA se utilizó como control interno. Para el análisis estadístico se aplicaron la prueba de ANOVA y post-test de Tukey HSD. Se utilizaron los siguientes criterios: Doble change≤0.5 o retirarse change≥2 y el valor p & lt; 0,05
Resultados
proliferación y apoptosis en juvenil, adulto normal, las muestras de carcinoma colorrectal y adenoma
la proliferación de las células epiteliales se localizaron predominantemente en la base de las criptas mientras que las células apoptóticas estaban cerca de la superficie luminal de la mucosa colónica normal
(
Figura 1 |
)
. relación proliferativa-apoptótica (PAR: proporción de células epiteliales de proliferación y apoptosis en las criptas) e IM fueron significativamente mayores en los niños (PAR = 3,51 ± 2,49; MI = 0,33 ± 0,06) y las muestras de CRC (PAR = 9,83 ± 7,72; MI = 0,42 ± 0,10) que en las muestras de adultos sanos (PAR = 0,88 ± 0,22; MI = 0,15 ± 0,06) (p & lt; 0,05). Ellos mostraron aumento continuo en el transcurso de la secuencia adenoma-carcinoma (ACS). PAR era 3,99 veces mayor en niños sanos epitelio del colon y 11,17 veces mayor en los CRC en comparación con el epitelio adulto sano; y PAR fue de 2,8 veces mayor en los CRC en contraste con las muestras de menores. En base a los resultados immunhistochemical, MI fue 2,2 veces mayor en los niños y 2,8 veces mayor en comparación CRC que a lo normal sano, y 1,27 veces mayor en los CRC en contraste con las muestras de menores. La más alta PAR y MI fueron encontrados en muestras de cáncer colorrectal
(
Figura 2
)
.
puntos azules representan los núcleos de las células inactivas. Las imágenes fueron tomadas con microscopio digital: tejido normal del niño (Ch), tejido adulto normal (N), adenoma (Ad) y carcinoma (CRC) en adultos. La actividad mitótica disminuye durante el envejecimiento y aumenta durante la AEC en contraste con la actividad apoptótica.
PAR y disminución MI durante el envejecimiento y aumento durante la carcinogénesis, en contra de la influenza aviar.
AI se redujo en muestras de niños sanos (0,13 ± 0,06) y significativamente menor en las muestras de cáncer colorrectal (0,06 ± 0,03) que en las muestras histológicamente adultas intactas colon (0,17 ± 0,05) (p & lt; 0,05). AI mostró disminución continua en paralelo con el ACS colorrectal. índice apoptótico se comprobó 0,76 veces menor en los niños, y 0,35 veces menor en el CCR en comparación con las muestras normales sanos; y era 0,46 veces menor en comparación con las muestras de CRC juveniles. El más bajo de IA se detectó en muestras de cáncer colorrectal
(
Figura 1 |
-
2
).
no se encontró alteración significativa en la actividad proliferativa entre el adulto sano mucosa colónica (PAR = 0,88 ± 0,22; MI = 0,15 ± 0,06) y las muestras de adenoma (PAR = 1,45 ± 0,89; MI = 0,13 ± 0,05); mientras que el AI se encontró que era significativamente menor en las muestras de adenoma (Normal AI = 0,17 ± 0,05; Adenoma AI = 0,10 ± 0,04) (p & lt; 0,05).
La expresión de los genes proliferation- y reguladores de la apoptosis en menores , muestras normales de adultos y de carcinoma colorrectal
expresión de ARNm de 117 genes de proliferación de regulación fueron estudiados en microarrays HGU133 Plus2.0. La expresión génica de 5 sondas (perteneciente a 4 genes) alterados en el curso del envejecimiento por sí solo en la mucosa colónica histológicamente intacta; la expresión del ARNm de 18 sondas (pertenecientes a 13 genes) fueron alterados durante la carcinogénesis colorrectal; y 11 sondas (pertenecientes a 8 genes /BRCA1, ccnb1, CCNE1, Cdc20, CDK1, CDKN2B, MKI67 y TFDP1 /) se expresan de forma diferente en ambos grupos de muestras (
Figura
3A). Del mismo modo, la expresión génica de 534 genes reguladores de la apoptosis también se analizó en este estudio. la expresión del ARNm de 15 sondas (perteneciente a 9 genes) alterados en el curso del envejecimiento por sí solo en la mucosa colónica histológicamente intacta; 46 sondas (pertenecientes a 32 genes) mostraron cambios durante la carcinogénesis colorrectal; y 12 sondas (pertenecientes a 11 genes /Acvr1b, BRCA1, CHEK2, DYRK2, IFI6, SERPINB9, SFRP1, SOCS3, SST, TNFSF10 y Zak /) fueron expresados de manera diferente en ambos grupos de muestras
(
Figura 3B
)
.
en el mapa de calor, aumento de la expresión de genes se representa con líneas rojas, mientras que la disminución de la expresión de verde. Los primeros 6 muestras con luz azul muestran los genes en los niños, el azul oscuro son de adultos sanos, mientras que las últimas muestras en verde son de pacientes con cáncer.
alteraciones de expresión génica entre los menores y la CRC muestras
Proliferation- y los genes reguladores de la apoptosis se investigaron más para encontrar genes con expresión de ARNm disímiles que pueden explicar las diferencias entre la proliferación celular controlada y no controlada. Doce sondas pertenecientes a 8 genes de proliferación de control (BCL2, CDKN2B, rad9a, BRCA2, CCND1, CDK1, CDK6 y RBL1)
(
Figura 4A
) y 26
los genes reguladores de la apoptosis (AIFM2, AIFM3, BTK, CIDEB, CIDEC, DAPK2, MAL, NLRP1 (LOC728392), SFRP1, SIVA1, SPN, SST, TR53I3, TNFRSF25, ANXA1, CBX4, CASP4, INHBA, MYC, PLAGL2, PMAIP1, POLB, PROK2, SOCS3, TNFRSF10B y ZAK) con 39 sondas
(
Figura 4B
)
mostró alteración significativa entre los niños y los grupos de cáncer, de acuerdo con el valor de p .
en el mapa de calor, aumento de la expresión de genes se representa con líneas rojas, mientras que la disminución de la expresión de verde. Las muestras de color azul oscuro son de niños sanos mucosa colónica (Ch) y la luz azul son de las muestras de cáncer colorrectal (CCR).
Validación de la expresión génica mediante RT-PCR TaqMan
la expresión del ARNm de 10 genes incluidos CDKN2B, MKI67, CDC2 /CDK1, CCNE1, ACVR1B, TNFSF10, DYRK2, SOCS3, IFI6 y SERPINB9 fueron validados con TaqMan RT-PCR
(
Tabla 3
)
.
de acuerdo con los resultados del análisis de microarrays de genes de proliferación de regulación (CDKN2B, MKI67, CDC2 /CDK1 y CCNE1), alteraciones significativas de expresión de mRNA fueron detectados por el valor de doblar los cambios (o FC≤0.5 FC≥2) y la prueba de ANOVA (p & lt; 0,05) en niños vs. normal y normal vs. comparaciones CRC; y estos resultados también fueron confirmados con Tukey-test en el caso de Cdc2 /CDK1 y CCNE1. validación de PCR confirmó la tendencia de las alteraciones de la expresión génica en todos los casos con respecto a la regulación de proliferación. CDKN2B, MKI67, CDC2 /CDK1 y CCNE1 mostraron dudosos significativos cambios en la expresión de ARNm en las comparaciones mencionadas anteriormente, de acuerdo con doble cambio. Tukey post-test reclutados alteraciones de la expresión génica durante el envejecimiento y la carcinogénesis colorrectal en caso de Cdc2 /CDK1 (p & lt; 0,05).
número de genes reguladores de la apoptosis (Acvr1b, TNFSF10, DYRK2, SOCS3, IFI6 y SERPINB9) también se analizaron con RT-PCR. La expresión de genes de ACVR1B, TNFSF10 y DYRK2 fue significativamente menor en los niños y muestras de CRC en comparación con el adulto normal mucosa colónica (FC≤0.5 o FC≥2; p & lt; 0,05); y estos resultados fueron validados por RT-PCR también. De acuerdo con los resultados del estudio Affymetrix, la expresión de ARNm de genes anti-apoptóticos, tales como SOCS3, IFI6 y SERPINB9, mostró significativamente más alta expresión en niños y muestras de CRC con respecto a las muestras que histológicamente colon intacto adultos. validación de PCR confirma la tendencia de las alteraciones de expresión génica entre los niños frente a un adulto normal y normal para adultos vs CRC. ANOVA y análisis de Tukey-test de los resultados de RT-PCR han verificado estas alteraciones en caso de SOCS3 y IFI6 (p & lt; 0,05). cambios en la expresión de los genes seleccionados se resumen en la
Tabla 4
.
Discusión
El envejecimiento se asocia con una mayor incidencia de tumores malignos colorrectales esporádicos, que es una de las principales causas de mortalidad en los países occidentales [33]. El cáncer colorrectal se relaciona con la proliferación celular incontrolada y apoptosis desregulada. crecimiento juvenil, por otra parte, se caracteriza por un crecimiento controlado, la proliferación celular y la apoptosis [34]
.
En este estudio, la actividad proliferativa y apoptótica en intacta epitelio colorrectal humano de niños y adultos en comparación a la de adenoma y se investigó el cáncer colorrectal. La expresión de los genes relacionados también se probó en microarrays de mRNA. Encontramos un mayor proliferativa y una disminución de la actividad apoptótica en los niños y las muestras de cáncer en comparación con el epitelio normal del adulto.
Estos resultados sugieren una regulación molecular de oponerse a la proliferación y la apoptosis durante el envejecimiento normal y la carcinogénesis colorrectal. Enhanced la proliferación celular de las células tumorales sin "envejecimiento" puede contribuir a su ventaja de supervivencia sobre las células senescentes adyacentes.
Un aumento de la proliferación celular detectada en los niños mucosa colorrectal puede estar relacionado con el crecimiento fisiológico del intestino grueso sin embargo, la renovación celular se ralentiza durante el envejecimiento normal en el adulto intacto cripta colónica histológicamente. La proliferación celular y la regulación de la apoptosis entre el crecimiento controlado en la infancia y el crecimiento incontrolado de CRC no se han correlacionado antes en la mucosa colónica. Aquí encontramos varios genes incluyendo la proliferación promoción de la ciclina B1 /CCNB1 /, ciclina E1 /CCNE1 /y la quinasa dependiente de ciclina (CDK1) que se upregulated tanto en muestras y jóvenes con cáncer en comparación con la mucosa normal del adulto (
Figura 3
). Estos resultados se correlacionan bien con nuestra conclusión significativamente mayor proliferación de fracciones de células en los niños y las secciones de tejido de cáncer en comparación con muestras de adultos normales. CDK, de hecho, tiene papel crucial en la regulación del ciclo celular y el crecimiento de las células eucariotas. complejos de CDK son una familia altamente conservada de proteínas quinasas Ser /Thr, que consta de una subunidad CDK catalítica y una subunidad ciclina activación. Diferentes CDK pueden controlar diferentes partes del ciclo celular; estos complejos pueden ser activadas por fosforilación, unión de la activación de ciclinas o inhibidores de subunidades [35] - [36]. CCNB1, CCNE1 y CDK1 expresiones, que puede correlacionarse con un aumento de la actividad proliferativa, fueron más altos en los niños y la mucosa del colon neoplásico en comparación con mucosa normal del adulto. Por otra parte, la ciclina D1 (CCND1), los niveles de ARNm de CDK1 y CDK6 fueron significativamente mayores en comparación con las muestras CRC niños normales, que pueden estar relacionados con la proliferación celular incontrolada en el cáncer (
Figura 4
). Ciclina D1 tiene varios efectos reguladores de la diferenciación celular normal, el crecimiento y el metabolismo; Sin embargo, la sobreexpresión de CCND1 es una de las alteraciones más comúnmente observado en los cánceres humanos, como lo ha hecho del ciclo celular efectos reguladores en fase G1 [37]. De acuerdo con
Zhang et al.
Resultados, lo anormal regulación de ciclina D1 puede ser un evento temprano en la carcinogénesis intestinal [38].
Sahl et al.
Han investigado la expresión de diferentes quinasas dependientes de ciclina en cáncer de colon humano. Observaron que la activación de CDK1, CDK2 y CDK6, que puede fosforilar la proteína retinoblastoma, resulta en la liberación de la inhibición de la progresión hacia adelante de la fase G1, es en relación con la carcinogénesis colorrectal humano [39].
Hay varias moléculas reguladoras que pueden modular y bloquear la función de CKD, llamados inhibidores de quinasas dependientes de ciclina. En nuestro estudio, hemos investigado las alteraciones de expresión de mRNA CDKN2B en los procesos de envejecimiento y la carcinogénesis colorrectal. CDKN2B también se conoce como supresor de tumores múltiples 2 (MTS2), quinasas dependientes de ciclina 4 y 6 o proteína p15-INK4b (p15) de unión. CDKN2B se encuentra adyacente a CDKN2A supresor de tumor en el cromosoma 9, que con frecuencia está mutado y se elimina en una gran variedad de neoplasias. Este gen codifica un inhibidor de quinasa dependiente de ciclina que pueden producir complejos con CDK4 y CDK6, inhibiendo el crecimiento celular o del ciclo celular. En el análisis de microarrays se encontró una expresión de ARNm de moderado de CDKN2B en, muestras de biopsia de colon hiperproliferativos bien controlados de los niños en comparación con adultos histológicamente intacta la mucosa colónica, y se observó una notable reducción de la expresión génica en muestras de CRC (
Figura 3
). De acuerdo con estudios anteriores, CDKN2B puede actuar como un gen supresor de tumores y un efector potencial de la detención del ciclo celular inducida por TGF [40].
Herman et al.
Certificó que el silenciamiento de genes de p15 por la isla CpG hipermetilación puede causar trastornos neoplásicos [41]. pérdida significativa de las funciones de estos genes puede contribuir a la proliferación celular incontrolada en el CCR.
En el análisis inmunohistoquímico, una disminución moderada actividad apoptótica se encontró en los niños sanos muestras de biopsias de colon en comparación con adultos sanos y se redujo drásticamente en el curso de la secuencia adenoma-carcinoma. alteraciones de expresión de ARNm de inductor de apoptosis o -inhibiting genes analizados en nuestro estudio (por ejemplo ACVR1B, TNFSF10, DYRK2, SOCS3, IFI6 y SERPINB9) puede explicar este fenómeno.