Extracto
Antecedentes
En combinación similar homeodominio 2 (PITX2) es un factor de transcripción homeodominio bicoide que desempeña un papel esencial en el mantenimiento de embriones asimetría izquierda-derecha durante la embriogénesis de vertebrados. Sin embargo, la evidencia emergente sugiere que la regulación al alza aberrante de PITX2 puede estar asociada con la progresión tumoral, sin embargo, aún se desconoce el papel funcional que PITX2 juega en la tumorigénesis.
Principales conclusiones
Uso de tiempo real RT cuantitativa -PCR (Q-PCR), transferencia de Western e inmunohistoquímica (IHC) analiza, hemos demostrado que PITX2 era frecuentemente sobreexpresado en muestras de cáncer de ovario y líneas celulares. la correlación clínico demostró que el PITX2 upregulated se asoció significativamente con alto grado (
P = 0,023
) y el subtipo de células claras (
P = 0,011
) usando Q-PCR y de alto grado (
P Hotel & lt; 0,001) cáncer de ovario mediante el análisis IHC. Funcionalmente, la expresión forzada de PITX2 podría promover la proliferación de células de cáncer de ovario, la capacidad de crecimiento independiente de anclaje, la migración /invasión y crecimiento tumoral en ratones modelo de xenoinjerto. Además, la expresión forzada de PITX2 elevó las proteínas reguladoras del ciclo celular como la ciclina D1 y C-myc. Por el contrario, RNAi mediada desmontables de PITX2 en que expresan las células de cáncer de ovario PITX2-alta tenido el efecto contrario.
Conclusión
Nuestros hallazgos sugieren que el aumento de PITX2 expresión está implicado en la progresión del cáncer de ovario a través de la promoción de la célula el crecimiento y la migración celular /invasión. Por lo tanto, la orientación PITX2 puede servir como un potencial modalidad terapéutica en el tratamiento de tumores de ovario de alto grado
Visto:. Fung FKC, Chan DW, Liu VWS, Leung THY, Cheung CUALQUIER, Ngan HYS (2012) se incrementó La expresión de PITX2 Transcripción factor contribuye a la progresión del cáncer de ovario. PLoS ONE 7 (5): e37076. doi: 10.1371 /journal.pone.0037076
Editor: Qiang Wang, el Cedars-Sinai Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 29 Enero, 2012; Aceptado: April 13, 2012; Publicado: 15 de mayo de 2012
Derechos de Autor © 2012 Fung et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación Wong Compruebe Ella Beneficencia. Este apoyo es de donaciones privadas, y el sitio web de ninguna fuente de financiación está disponible. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es una de las enfermedades más comunes entre la población femenina en todo el mundo [1] .La alta tasa de mortalidad de cáncer de ovario es debido al retraso en el diagnóstico y la mala respuesta terapéutica, porque la enfermedad se manifiesta a menudo con poco o síntomas no específicos en la etapa temprana [2], [3], [4]. El cáncer de ovario se pueden clasificar en cuatro subtipos; seroso, endometrioide, célula mucinoso y claro, basado en la diferenciación histológica del epitelio ovárico y las alteraciones genéticas subyacentes [3], [5], [6]. La clasificación de los tumores de ovario se clasifica de acuerdo con la Federación Internacional de sistema de Obstetricia (FIGO) Ginecología y, revelando que presentan tumor de alto grado la característica del crecimiento celular más rápido y mal pronóstico, así como la quimio-resistencia en comparación con los tumores de bajo grado [7], [8].
en combinación similar homeodominio 2 (PITX2) factor de transcripción es el miembro de la familia del homeodominio bicoide y juega un papel importante en la embriogénesis de vertebrados [9]. Varios estudios han informado de que la mutación de PITX2 se asocia con la patogénesis del síndrome de Axenfeld-Rieger (ARS), que es una enfermedad humana autosómico dominante caracterizado por defectos en el desarrollo de los ojos, los dientes y el corazón [6]. Informes recientes han documentado que PITX2 se sobreexpresa en los adenomas hipofisarios no funcionales [10], el cáncer colorrectal con ganglios positivos [11] y el cáncer de tiroides [12]. Por otra parte, la inhibición de la expresión de PITX2 por shRNA en células de cáncer de tiroides reduce significativamente la capacidad de crecimiento de las células en el ensayo de agar blando, lo que sugiere que PITX2 puede tener potencial oncogénico y pueden estar implicados en la progresión del tumor [12].
En el presente estudio, hemos demostrado que con frecuencia PITX2 se regula positivamente y se asoció significativamente con el cáncer de ovario de alto grado. El uso de modelos celulares de cáncer de ovario, que reveló que el PITX2 upregulated podría elevar los reguladores del ciclo celular, tales como CyclinD1 y C-myc, y promover la proliferación celular, la migración celular /invasión, así como el crecimiento del tumor en ratones modelo de xenoinjerto. Nuestros resultados proporcionan una mayor comprensión de la función oncogénica de PITX2 en la mediación de la tumorigénesis cáncer de ovario.
Materiales y Métodos
Las muestras clínicas y líneas celulares
La resección quirúrgica de 97 muestras de tumores de primario Los pacientes con cáncer de ovario y ovarios normales muestras de enfermedad benigna fueron elegidos al azar para el análisis Q-PCR. El subtipo histológico y el estadio de los tumores se clasifican de acuerdo a la Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia de clasificación (FIGO). consentimiento informado por escrito fue tomado por los participantes anteriores y el uso de estas muestras clínicas fue aprobado por Junta Institucional de la Universidad de Hong Kong /Autoridad de Hong Kong West Cluster del Hospital (Universidad de Hong Kong /HA HKW IRB) (número Junta de Revisión Institucional de la opinión: UW05- 143 T1806). Se utilizaron dos células epiteliales superficiales de ovario humanas inmortalizadas: MANGUERA 10-2 y 17-1 MANGUERA (amablemente proporcionados por el Profesor George Tsao, la Universidad de Hong Kong) [13]. Una línea inmortalizada de células epiteliales del oviducto humana, OE-E6 /E7, se obtuvo del Dr. Calvin Lee (La Universidad de Hong Kong) [14]. Se utilizaron nueve líneas celulares de cáncer de ovario: OV2008, C13 *, A2780s, A2780cp (amablemente proporcionado por el profesor Benjamin Tsang, La Universidad de Ottawa) [13], [15], OV420, OV429, OV433, OVCAR3, Skov-3, TOV21G fibroblastos de ratón, células renales y Wnt3a L 293 células embrionarias humanas (HEK 293) (América del Type Culture Collection, Rockville, MD, EE.UU.). Todas las líneas celulares se cultivaron en cualquiera de medio esencial mínimo o medio de Eagle modificado de Dulbecco con 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina-estreptomicina en 75 cm
2 frascos y se incubaron a 37 ° C en 5% de CO
2.
plásmidos y transfección celular
pCI
hA-PITX2A
expresando plásmido (donación del Dr. Kathy Kozlowski, Universidad de Michigan) se utilizó para la expresión ectópica de hA-etiquetados PITX2A. El plásmido contiene humano de longitud completa
PITX2A
cDNA y su expresión fue impulsado por el promotor CMV. El vector pCI se utilizó como control negativo. El vector HuSHpGFP-V-RS plásmido y horquilla corta interferencia de ARN (shRNA) dirigidos a
Hoteles en PITX2 pGFP-V-RS vector (pGFP-V-RS-
PITX2
) fueron adquiridos de OriGene tecnologías (OriGene Technologies, Inc, Rockville, MD, EE.UU.). La secuencia shRNA orientación
PITX2
era 5 'GAA CCG GTT TGT CTC TTC TCC AAA GAC TC 3'.Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.) se utilizó para la transfección de células de acuerdo con el fabricante instrucciones. células estables que sobreexpresan PITX2A o desmontables de PITX2 se recogieron después de 14 días de puromicina (/ml 1 g) selección y verificado por análisis de transferencia de Western.
extracción de ARN y la transcriptasa inversa-PCR
ARN total de las muestras clínicas y las células cultivadas se aisló usando el reactivo TRIzol (Invitrogen). El ADNc se preparó utilizando el kit de reactivos de transcripción reversa (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). La transcriptasa inversa cuantitativa-PCR (Q-PCR) se utiliza para la evaluación de las expresiones
PITX2
,
La ciclina D1-
y
C-myc
se realizó por Taqman® génica ensayos de expresión; humana
PITX2 gratis (ensayo ID: Hs00165626_m1), humano
La ciclina D1-gratis (ensayo ID: Hs00765553_m1) y humano
C-myc gratis (ensayo ID: Hs00153408_m1), en un sistema de ™ 7500 ABI PRISM (Applied Biosystems). El humano
18S rRNA gratis (ensayo ID: Hs99999901_m1) se utilizó como control interno
Western blot
Las células fueron lisadas por tampón de lisis (Cell Signaling Technology) que contiene. inhibidor de la proteasa (Sigma) y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU.). Las muestras de proteínas se separaron en un 10% SDS-PAGE y electrotransferencia sobre membranas Hybond los-P (Amersham Pharmacia Biotech, Cleveland, OH, EE.UU.). Las transferencias se bloquearon con leche desnatada 5%, seguido de incubación con PITX2 (C16) y C-Myc (N262) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, EE.UU.), ciclina D1-y β-catenina (Señalización Celular ), anti-HA y β-actina (Sigma) durante la noche a 4 ° C. Las transferencias se incubaron con anti-ratón, anti-conejo (Amersham Pharmacia Biotechnology) y anti-cabra (Santa Cruz) anticuerpos secundarios se conjugan con peroxidasa de rábano picante durante 1 hora a temperatura ambiente y se visualizaron usando el reactivo ECL ™ Western Blotting de detección (Amersham).
Para el análisis inmunohistoquímico, dos arrays de tejido de cáncer de ovario comerciales (OVC1021 y OVC481, Pantomics Inc, San Francisco, CA) se immunostained con anticuerpo policlonal de conejo anti-anticuerpo primario PITX2 (AbcamInc, Cambridge, MA, EE.UU.) en 1 :200 dilución. La sección teñida fue identificado como positivo o negativo. Para aquellas muestras inmuno-positivo, la intensidad de la tinción (1, débil, moderado 2, 3 y 4 fuerte muy fuerte) y la proporción de área manchada (0-100%) se obtuvo. La inmunorreactividad de cada muestra se determina multiplicando la intensidad y el porcentaje de área manchada. La media de valor de inmunorreactividad de los casos normales y borderline se utilizó para normalizar todos los casos. Todo sección de tejido se examinó y se obtuvo de forma independiente por dos investigadores.
viabilidad de las células de ensayo
La viabilidad celular se analizó mediante un kit de proliferación celular (XTT) (Roche Ciencias Aplicadas, Indianapolis, IN, EE.UU.) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Cada muestra se realizó por triplicado y tres experimentos independientes se llevaron a cabo.
Soft-agar ensayo
Un total de 1 × 10
4 Se prepararon células en 1,5 ml de medio completo que contiene 0,6% agarosa. Se añadieron las mezclas sobre la capa inferior solidificado que contiene 1% de agar en 2 ml de medio completo. colonias viables se contaron y se fotografiaron después de 14-36 días. El experimento se realizó por triplicado y llevó a cabo tres veces de forma independiente.
Curación de Heridas ensayo
Las células fueron sembradas en una placa de seis pocillos hasta que se alcanzó la confluencia completa en una monocapa. A continuación, en cada pocillo medio se reemplazó por medio fresco que contiene la mitomicina C (10 mg /ml) (Sigma) y se incubó durante 3 horas a 37 ° C.A sola herida fue creado en el medio de cada pocillo usando una punta de micropipeta. La placa se incubó a 37 ° C en 5% de CO
2. La imagen de cierre de la herida fue tomada en diferentes cursos de tiempo. La tasa de migración relativa se expresa como la anchura relativa de las heridas /hora. Tres experimentos independientes se realizaron por triplicado.
migración celular Transwell y ensayo de invasión
La cuantificación de la migración celular y la invasión se realizaron con QCM ™ 24-Well colorimétrico de Migración Celular de ensayo (Millipore Corporation, Billerica, MA, EE.UU.) y la invasión celular Kit de ensayo (Chemicon Internacional, Temecula, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Tres campos diferentes de las células teñidas se fotografiaron y se contaron para cada uno pozos. Los experimentos se realizaron tres veces de forma independiente.
En vivo
modelo de xenoinjerto de tumor
Para investigar si la sobreexpresión PITX2 promueve el crecimiento tumoral
in vivo
, PITX2 establemente se inyectaron sobreexpresa SKOV-3 células por vía subcutánea en ratones desnudos. Diámetro del tumor se midió cada tres días y los ratones se escarificada un mes después de la inyección. El volumen del tumor se calculó como (media de diámetros)
3 × π /6. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de la Universidad de Hong Kong sobre el uso de animales vivos en la Enseñanza y la Investigación (CULATR N ° 2053-09).
Análisis de los datos
Los datos se presentan como media SD ±. Estudiante de
t-test
se utilizó para el análisis de datos paramétricos. Un
P-valor de
. & Lt; 0,05 se consideró significativo en todo el experimento
Resultados
UpregulatedPITX2 se observa en las células de cáncer de ovario
A pesar de las funciones de PITX2 durante la embriogénesis se han estudiado ampliamente, el papel funcional de PITX2 en los cánceres humanos siguen siendo en gran parte desconocido. A continuación, se evaluó el estado de la expresión de
PITX2 Hoteles en muestras de cáncer de ovario (n = 97), los ovarios normales (n = 54), líneas de células de ovario normales incluyendo dos mangueras (manguera y la manguera 10-2 17-1 ) y una línea celular inmortalizada epitelial del oviducto humano (OE-E6 /E7) por Q-PCR. Hemos encontrado que
PITX2
se upregulated significativamente en muestras de cáncer de ovario (~ 15 pliegues) en comparación con ovarios normales y líneas celulares de ovario (
P
& lt; 0,001) (Figura 1A). la correlación clínico demostró que la sobreexpresión
PITX2
se asoció con muy alto grado (grado 3) (
P = 0,023
) y el cáncer de ovario subtipo de células claras (
P =
0,011) (Tabla 1). Sin embargo, no hubo una asociación significativa entre la sobreexpresión
PITX2
y otros parámetros como la edad, el estadio y la recurrencia (Tabla 1). Además, también se llevó a cabo el análisis de transferencia Western para comparar la expresión de PITX2 en un panel de líneas celulares de cáncer de ovario humano y las células normales de ovario epitelio superficial (mangueras). En comparación con líneas celulares de mangueras, se observó un aumento generalizado de la expresión de PITX2 en todas las líneas celulares de cáncer de ovario (Figura 1B). Además, nuestros Western blot datos también mostraron que PITX2 obviamente estaba aumentada en una línea celular de cáncer de ovario subtipo de células claras (TOV21G) cuando se compara con OE-E6 /E7 (Figura S1 A), la línea de células epiteliales normales inmortalizadas trompa de Falopio. Este resultado confirma aún más los hallazgos clínico-patológicos anteriores. A fin de evaluar el nivel de proteína de PITX2 en muestras de cáncer de ovario, la tinción inmunohistoquímica de PITX2 se realizó en una matriz de tejido de cáncer de ovario (OVC481), que incluye 16 casos de muestras de cáncer de ovario emparejado con ovarios normales. Consistente con los hallazgos Q-PCR, el aumento de expresión de PITX2 se observa generalmente en las muestras de cáncer de ovario en particular en alto grado o tumores no diferenciados en comparación con sus correspondientes tejidos ováricos normales no afectados (Figura S1B). Además, se analizó la expresión de PITX2 en una piscina más grande de muestras de cáncer de ovario mediante el uso de otra matriz de tejido de cáncer de ovario comercial (OVC1021) que incluye 2 normales, 2 benigna, 1 cystademoma limítrofe y 97 muestras de tumores malignos. Nuestro hallazgo mostró que el PITX2 upregulated se correlacionó significativamente con tumor de ovario de alto grado única (
P Hotel & lt; 0,001). Y era consistente con el resultado del análisis Q-PCR (Tabla 2)
(a) Quantitative análisis RT-PCR se realizó en ovarios normales (n = 54) y las muestras de cáncer de ovario (n = 97) utilizando
PITX2
cebador específico. 18S y la proteína de unión (PDD) de la caja TATA se utilizaron como controles de carga internos. *
P Hotel & lt; 0,001. (B) Análisis de transferencia de Western usando anticuerpo anti-PITX2 para evaluar el nivel de expresión de PITX2 (isoformas A, B y C)) (35 kDa) en líneas celulares de cáncer de ovario (n = 9) y las líneas celulares de la manguera (n = 2) . β-actina se utilizó como control de carga. (C) El análisis inmunohistoquímico de la expresión de PITX2 (tinción nuclear) en cistoadenoma limítrofe y de alto grado (3) cystadenocarcinoma seroso en una matriz de tejido de cáncer de ovario (OVC1021). Ampliación:. 20 ×
PITX2 aumenta el crecimiento celular en células de cáncer de ovario
Dado que el PITX2 upregulated se asocia con el cáncer de ovario de alto grado, puede PITX2 poseen funciones oncogénicas en la mediación de fenotipo agresivo en las células de cáncer de ovario. Para probar esta idea, se generó por primera vez PITX2 clones que expresan estables a partir de dos líneas celulares de cáncer de ovario de grado alto (SKOV3 y OVCA433) (Figura 2A). Por otro lado, otro líneas celulares de cáncer de ovario de alto grado con la expresión PITX2-alto (OV2008), así como OVCA433 fueron elegidos para knockdown estable de PITX2 utilizando el enfoque de ARNi basado en vectores. Cuatro shRNA construcciones diana en diferentes sitios de marco de lectura abierto PITX2 se transfectaron transitoriamente en las células, respectivamente, y dos de ellos (K1 y K2) produjo la reducción de 50 a 70% de PITX2 endógena fue elegido para la transfección estable (Figura 2B). Por ensayo de proliferación celular XTT, la tasa de crecimiento relativo de la PITX2 expresan de forma estable clones en SKOV3 y OVCA433 células fue significativamente mayor (1,5 a 3 veces) que los controles de vector (Figura 2C). A la inversa, el agotamiento de PITX2 en células OV2008 y OVCA433 deteriora significativamente su tasa de proliferación celular por de 2 a 3 veces en comparación con sus controles revueltos (Figura 2D).
se establecieron (A) PITX2A clones que expresan estables en las células SKOV3 y OVCA433. El análisis de transferencia de Western usando anticuerpo anti-HA mostró los niveles de expresión de PITX2A marcada con HA en C4 y C5 clones de SKOV-3, y se utilizó clones C33 y C34 de OVCA 433. β-actina como control de carga. (B) Análisis de transferencia de Western usando anticuerpo anti-PITX2 mostró la menor expresión de PITX2 endógena en los clones estables generados por desmontables shRNA construye 2 (K1 y K2). Revueltos es el control no específica shRNA. Las unidades numéricas representan las expresiones relativas de reducción de PITX2 en cada clon estable en comparación con los controles revueltos. ß-actina se utilizó como control de carga. (C) la expresión ectópica de PITX2A estimuló la proliferación celular en las células de cáncer de ovario. Tanto C4 y C5 de Skov-3 células demostraron 1,5 veces de incremento del crecimiento celular (*
P
& lt; 0,05), C33 y C34 de OVCA 433 células tenían 3- veces de incremento del crecimiento celular (**
P
& lt; 0,01) en comparación con su control de vectores. (D) El agotamiento de PITX2 endógeno reduce la proliferación celular en células de cáncer de ovario. Una de 3 a 4 veces superior al de la reducción en la viabilidad celular en ambos clones desmontables (K1 y K2) de las células OV2008 (**
P
& lt; 0,01) y de 2 a 3 veces disminución en la proliferación celular en clones desmontables (K1 y K2) de OVCA 433 células (*
P
& lt; 0,05). se observaron
Además, la expresión forzada de PITX2 aumentó no sólo el tamaño, sino también las número de colonias en las células OVCA433 y SKOV3 por 2 veces (
P
& lt; 0,05) y 8 veces (P & lt; 0,01), respectivamente (Figura 3A). En contraste, el agotamiento de PITX2 reduce tanto el tamaño y el número de colonias en OV2008 y OVCA433 células por 2,6 veces a 5 veces (
P
& lt; 0,01), respectivamente, en comparación con su control mezclado (Figura 3B). En conjunto, estos datos sugieren que la regulación al alza de PITX2 podría promover el crecimiento celular de células de cáncer ovárico y apoyar las funciones oncogénicas de PITX2 en tumor de ovario de alto grado.
(A) la expresión forzada de PITX2A mejorado la capacidad de anclaje independiente crecimiento de las células de cáncer de ovario. El gráfico de barras muestra que PITX2A clones que expresan de forma estable (C33 y C34) de OVCA 433 (**
P
= 0.05) y (C4 y C5) de Skov-3 (*
P =
0,01) tenían mayor número de colonias en agar blando en comparación con sus controles de vectores. Representante imágenes muestran tamaño de las colonias más grandes en PITX2A estable que expresa los clones bajo microscopía. (B) El agotamiento de PITX2 por shRNA inhibe su capacidad de crecimiento independiente del anclaje de las células de cáncer de ovario. El número de colonias en clones PITX2stable desmontables (K1 y K2) de OVCA 433 y OV2008 mostró significativamente la reducción en comparación con los controles revueltos (*
P
& lt; 0,01). Representante imágenes muestran que el tamaño de la colonia reducido de clones PITX2stableknockdown y sus controles revueltos. El experimento anterior se repitió al menos tres veces de forma independiente y los datos se calculó con la media ± SD.
PITX2 mejora la migración celular y la invasión de células de cáncer de ovario
Estudios anteriores han demostrado que PITX2 podría desencadenar la migración de las células neuronales durante el desarrollo de hipotálamo de ratón [16], lo que indica que posee PITX2 migratoria celular promoción de la capacidad. A continuación, se intentó investigar si PITX2 confiere un papel en la promoción de la migración celular y la invasión de células de cáncer de ovario. Hemos llevado a cabo la primera prueba cicatrización de la herida para examinar si PITX2 podría promover la migración celular. Tras el tratamiento de mitomicina C para excluir el factor de aumento del crecimiento celular, se observó que la expresión forzada de células PITX2in SKOV3 exhibió una tasa de cierre de la herida más rápido que el control de vector (Figura 4A). Por el contrario, desmontables de PITX2 endógeno en células OVCA433 reduce notablemente la tasa de migración celular observada en el ensayo de curación de la herida (
P
& lt; 0,05) (Figura 4B). Además, mediante ensayos de migración y la invasión Transwell, hemos demostrado que había de 2 a 3 veces (
P
& lt; 0,01) y 0.8- a 1,5 veces (
P
= 0,04 y 0,01 ) el aumento de la tasa de migración celular y la tasa de invasión, respectivamente, en PITX2 clones que expresan estables (C4 y C5) en comparación con el control de los vectores de las células SKOV3 (Figura 4C). En contraste, el número de células penetrado a través de la membrana en el ensayo de migración Transwell e invadieron a través de matrigel en el ensayo de invasión Transwell se redujeron significativamente en PITX2 clones desmontables estable (K1 y K2) en comparación con control mezclado de OVCA433 (
P
& lt; 0,01) (Figura 4D). Estos datos sugieren que PITX2 posee la capacidad en la promoción de la migración celular y la invasión en las células de cáncer de ovario.
(A) Wound ensayo mostró que la curación de células que expresan de forma estable PITX2 (C4 de SKOV-3) exhibió tasa de cierre de la herida más rápido que el control de vectores en el curso del tiempo de 8 horas (**
P Hotel & lt; 0,05). (B) PITX2 clones estables desmontables (K1 y K2 de OVCA 433) mostraron una reducción significativa en la tasa de cierre de la herida en comparación con el control del vector en el curso de tiempo de 12 horas (*
P
& lt; 0,05). Las flechas indican la anchura de la herida y la tasa de migración celular relativa se expresa como la anchura relativa de las heridas /hora. El ensayo se repitió tres veces de forma independiente. (C) Transwell migración y ensayo de invasión demostraron que PITX2 expresan de forma estable clones en SKOV3 (C4 y C5) de las células migran más rápido a través de la membrana (*
P & lt; 0,01
) e invadir más rápido a través de la matrigel (C4, *
P = 0,04
y C5, **
P
= 0,01) en comparación con el control de vectores. (D) PITX2 clon caída estable (K2 de OVCA 433) mostró notable reducción en la penetración celular a través de las membranas y la invasividad celular en comparación con los controles revueltos (**
P
= 0,01). Tres puntos de vista se seleccionaron al azar en cada uno de los insertos y se contaron los números de célula invadida. Los resultados de tres experimentos independientes se trazaron con barra de error.
PITX2 regula ciclina D1-y C-myc en células de cáncer de ovario
ciclina D1 y C-myc son dos cruciales reguladores en la promoción de la proliferación celular [17]. Para resolver si PITX2 regula estos genes en la promoción del crecimiento celular de células de cáncer de ovario, se realizó en primer lugar, el análisis Q-PCR y mostró que no había 2-12 pliega aumento de expresiones de
La ciclina D1-
y
C myc
en PITX2 de forma estable que expresan las células de cáncer de ovario (Figura 5A). Además, el análisis de transferencia Western también reveló que tanto la ciclina D1-y C-myc elevada al menos 60% en PITX2 de forma estable que expresan las células de cáncer de ovario (Figura 5B). Por el contrario, desmontables de PITX2 reduce notablemente la expresión de ciclina D1-y C-myc al menos 20% en comparación con sus controles revueltos en OVCA 433 y células OV2008 (Figura 5C) Estos hallazgos indican que PITX2 podría regular positivamente la Ciclina D1 y C- myc en la promoción del crecimiento celular de las células de cáncer de ovario.
(a) Q-PCR análisis reveló que los niveles de
la ciclina D1-
y
C-myc fueron elevados en PITX2A clones que expresan de forma estable (C4, C5 de SKOV-3 y C33, C34 de OVCA 433). (B) Análisis de transferencia Western mostró que los niveles de proteína de la Ciclina D1 y C-myc se incrementaron en PITX2 en PITX2A clones que expresan de forma estable (C4, C5 de SKOV-3 y C33, C34 de OVCA 433). (C) Desmontables de PITX2 redujo significativamente los niveles de ciclina D1-y C-myc en PITX2 desmontables clones estables (C6, C8 de OVCA 433 y C1, C4 de OV2008). Los niveles de PITX2A marcada con HA se detectaron usando anticuerpo anti-HA, mientras que la expresión endógena PITX2 se examinó por el anticuerpo anti-PITX2, β-actina se utilizó como control de carga. El valor numérico en cada panel representa la expresión relativa de la ciclina D1-y C-myc a sus controles de vectores.
promueve PITX2
in vivo
el crecimiento del tumor de las células de cáncer de ovario
Además de
in vitro
estudios tumorigénicos en PITX2, se intentó determinar si la sobreexpresión de PITX2 podría mejorar la capacidad de crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto de ratón. Dos clones estables que expresan PITX2 (C4 y C5) y un control de los vectores de SKOV3 se inocularon por vía subcutánea en ratones desnudos. Después de 36 días, se observó que ambos clones estables con sobreexpresión PITX2 tenían 2,5-3 veces mayor intumor tasa de crecimiento en comparación con el control de vector (
P
& lt; 0,01) (Figura 6A & amp; 6B). El análisis de transferencia Western en los tejidos tumorales diseccionadas recogidas en el día 36 mostró que ambos PITX2 clones que expresan estables (C4 y C5) de SKOV3 expresaron altos niveles de PITX2 y concomitante con expresiones elevadas de la ciclina D1-y C-myc (Figura 6C). Este resultado es consistente con el
in vitro
datos oncogénicas y otros apoyos que PITX2 podría promover el crecimiento del tumor a través de la regulación positiva de ciclina D1 y C-myc.
(A) PITX2 clones que expresan establemente en SKOV3 (C4 y C5) mostraron más rápido en el crecimiento tumoral en ratones desnudos en comparación con el control de vectores. El tamaño del tumor fue representado por la media ± SE de cinco ratones y se midió durante 36 días *,
P
. & Lt; 0,01, significativamente diferente del grupo de control del vector. (B) Fotografía ilustra los tumores diseccionados tomadas de ratones desnudos por vía subcutánea inyectaron por dos PITX2 clones estables que expresan en SKOV3 (C4 y C5) y el control de vectores en el Día 36. (C) El análisis de transferencia Western mostró la expresión de PITX2, ciclina D1- y C-myc de los tejidos tumorales subcutáneos ratones. El valor numérico en cada panel representa la expresión relativa de la ciclina D1-y C-myc a sus controles de vectores.
PITX2 es regulada por Wnt /β-catenina de forma independiente en las células de cáncer de ovario
informes previos han documentado que PITX2 es el mediador aguas abajo de Wnt /β-catenina vía [12], [18]. Por lo tanto, hemos sido de interés para examinar si la regulación al alza de PITX2 se debe a la Wnt /β-catenina activado. Tras el tratamiento de inhibidor de GSK3 (cloruro de litio), se encontró que la actividad /β-catenina Wnt se activó a través de la mayor expresión de β-catenina de una manera dependiente de la dosis en las células OVCA433 y A2780cp. Sin embargo, sólo había leve o incluso ningún cambio de expresión PITX2 en ambas líneas celulares (Figura S2A). Del mismo modo, en el tratamiento de la condición de medio Wnt3A, tanto A2780cp y Ovča 433 células mostraron respuesta no evidente a la mayor actividad de Wnt /β-catenina (Figura S2 B). Estos hallazgos indican que la regulación positiva de la expresión de PITX2 en las células de cáncer de ovario no está regulado principalmente por la señalización /β-catenina vía, pero tal vez por otros mecanismos moleculares.
Discusión
La progresión tumoral es un multi- proceso paso que avanza el cáncer para ser un maligno y agresivo fenotipo más [19]. tumor de alto grado representa una progresión más avanzado que posee mayor proliferación celular y la capacidad de invasión [20]. En este estudio, hemos demostrado que en primer lugar se PITX2 frecuencia aumentada en los cánceres de ovario particularmente en alto grado y subtipo de células claras de cáncer de ovario usando Q-PCR, Western blot y análisis IHC. Más importante aún, se abordó el papel oncogénico de PITX2 posee en la proliferación celular, la capacidad de crecimiento independiente de anclaje, /invasión, así como el crecimiento del tumor migración de células en un modelo de xenoinjerto en ratones de tumor.
Según FIGO clasificación clasificación, células tumorales de ovario de alto grado histológico son generalmente mal diferenciados [20], crecer más rápido y altamente metastásico [7]. Además, el pronóstico del tumor de ovario de alto grado es pobre a partir de entonces se asocia a menudo con una pobre tasa de supervivencia [21], [22] .Los claras subtipo de células cáncer de ovario representa aproximadamente el 6% de todos los tumores ováricos epiteliales y la mayoría de los casos de este subtipo son tumores de alto grado que exhiben un fenotipo agresivo [3], [22], [23]. Nuestro estudio demostró que tanto los niveles de ARNm y proteínas de PITX2 se upregulated con frecuencia en el cáncer de ovario en particular en los subtipos de alto grado y de células claras, lo que indica que PITX2may juegan un papel importante en el impulso de fenotipos agresivos en el cáncer de ovario.
PITX2 es un factor de transcripción de homeodominio que desempeña un papel esencial en el desarrollo embrionario como el hígado, la hematopoyesis, las gónadas, y la diferenciación neuronal etc [24], [25], [26]. informes recientes, ha habido un incremento que muestran que PITX2 se sobreexpresa en los cánceres humanos, tales como los adenomas hipofisarios no funcionales [10], el tumor de Wilms [27] y el cáncer colorrectal con ganglios positivos [11]. Sin embargo, el papel funcional de PITX2 en cánceres humanos tales como cáncer de ovario sigue siendo desconocido. Con el fin de dar a conocer el papel funcional de PITX2 en el cáncer de ovario, generamos ganancia o pérdida de la función de PITX2 en modelos celulares de cáncer de ovario de alto grado y se realizó una serie de
in vitro
y
in vivo
ensayos tumorigénicas en relación con el efecto de PITX2 en el crecimiento de células tumorales y la metástasis. Nuestro estudio demostró que la expresión forzada de PITX2 podría mejorar significativamente la proliferación celular, la capacidad de crecimiento independiente del anclaje, la migración celular /invasión y crecimiento tumoral de las células de cáncer de ovario en el modelo de xenoinjerto de tumor de ratón. Por el contrario, el agotamiento de PITX2 por shRNA deteriora los fenotipos tumorigénicos anteriores en modelos celulares de cáncer de ovario de alto grado. Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren que las funciones oncogénicas que poseen los PITX2 se encuentran exclusivamente en el cáncer de ovario de alto grado y son coherentes con el análisis clínico-patológico de que el PITX2 sobreexpresada está estrechamente relacionada con el cáncer de ovario de alto grado.
estudios anteriores han demostrado que PITX2 eleva factores reguladores del ciclo celular tales como ciclina D1, -D2 y C-myc promoviendo de tipo celular específico en la proliferación de líneas de células de la pituitaria y de mioblastos murinos [18] [28], [29], [30, ]. Además, los estudios bioquímicos representan sitios de unión que PITX2 se encuentran a lo largo de las regiones promotoras de
La ciclina D1-
, -
D2
y
C-myc
, lo que sugiere que estos genes son objetivos directos de transcripción de PITX2 [18], [28], [29], [30], [31], [32]. Además, la activación de oncogenes tales como la ciclina D1-y C-myc podría mejorar el crecimiento independiente de anclaje en células epiteliales mamarias de ratón sobre el crecimiento del tumor y en la inmunodeficiencia combinada (SCID) los ratones graves [17].