Extracto
Sólo un pequeño número de prometedores fármacos diana cáncer de páncreas, que es la cuarta causa principal de muerte por cáncer con una supervivencia a los 5 años de menos del 5%. Nuestro objetivo es desarrollar un nuevo agente bioterapéutico en el que una proteína lisosómica (saposina C, SAPC) y un fosfolípido (dioleoilfosfatidilserina, DOPS) se ensamblan en nanovesículas (SAPC-DOPS) para el tratamiento de cáncer de páncreas. Una característica distintiva de nanovesículas SAPC-DOPS es su alta afinidad por la fosfatidilserina (PS) microdominios ricos, que son anormalmente expuestos en la superficie de la membrana de las células tumorales pancreáticas humanas. Para evaluar el papel de PS celular externa,
in vitro
ensayos se utilizaron para correlacionar la exposición PS y el efecto citotóxico de SAPC-DOPS en tumor humano y células pancreáticas nontumorigenic. A continuación, se utilizaron los xenoinjertos tumorales pancreáticas (modelos ortotópico y subcutáneo) para la orientación del tumor y los estudios de eficacia terapéutica con el tratamiento sistémico SAPC-DOPS. Hemos observado que los nanovesículas asesinados selectivamente las células de cáncer de páncreas humano
in vitro fotos: por la inducción de la muerte apoptótica, mientras que las células no transformadas no se vio afectado. Este
in vitro
efecto citotóxico en correlación con el nivel de exposición de la superficie del PS en las células tumorales. El uso de xenoinjertos, los animales tratados con SAPC-DOPS mostraron beneficios de supervivencia claras y sus tumores se redujeron o desaparecieron. Por otra parte, el uso de un método de doble seguimiento en ratones vivos, demostramos que los nanovesículas fueron dirigidos específicamente a-implantado de forma ortotópica, tumores pancreáticos bioluminiscentes. Estos datos sugieren que la PS fosfolípido ácido es un biomarcador de cáncer de páncreas que puede ser dirigido de manera efectiva para la terapia que utiliza nanovesículas SAPC-DOPS cáncer selectivo. Este estudio proporciona evidencia convincente en apoyo del desarrollo de un nuevo enfoque terapéutico para el cáncer de páncreas
Visto:. Chu Z, Abu-Baker S, Palascak MB, Ahmad SA, Franco RS, Qi X (2013) La focalización y la citotoxicidad de SAPC-DOPS nanovesículas en el cáncer pancreático. PLoS ONE 8 (10): e75507. doi: 10.1371 /journal.pone.0075507
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América
Recibido: 1 de mayo de 2013; Aceptado: August 14, 2013; Publicado: 4 de octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Chu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por el NIH /NCI Subvenciones Número 1R01CA158372-01 (Qi), 1R43CA117283-01 (a Qi y Xu), y el Estado clave de nuevo fármaco Proyecto de la subvención Número 009ZX09102-205 (Qi). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado los siguientes intereses: Xiaoyang Qi en que aparece como inventor en el patente para la tecnología (SAPC-DOPS) que es el objeto de esta investigación. En consonancia con las políticas actuales de Cincinnati Children Hospital Medical Center, el desarrollo y la comercialización de esta tecnología ha sido autorizada para Bexion Pharmaceuticals, LLC, en el que el Dr. Qi tiene un menor (& lt; 5%) participación en el capital. El Dr. Qi es un inventor de la investigación científica que se encuentra en la etapa de pre-clínico para Bexion farmacéuticos. En este momento, Bexion farmacéuticos no ofrece tratamientos negociables o drogas. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El cáncer de páncreas es la cuarta causa principal de muerte por cáncer, con una supervivencia a 5 años de menos de 5% [1], [2], [3]. Por lo general es asintomática en las etapas tempranas, mientras que con frecuencia la invasión de los ganglios linfáticos regionales y el hígado, y con menos frecuencia a los pulmones y los órganos viscerales. estrategias multimodales actuales, incluyendo la cirugía, la quimioterapia y la radioterapia, no han logrado mejorar la supervivencia a largo plazo. El estándar actual de tratamiento, el gemcitabina análogo de nucleósido [4], prolonga la supervivencia de sólo varios meses. A pesar de los esfuerzos exhaustivos para mapear las alteraciones genéticas asociadas con el crecimiento del cáncer de páncreas, se han reportado unos objetivos de fármacos prometedores, y se necesitan urgentemente nuevos tratamientos eficaces. estrategias terapéuticas experimentales incluyen inhibidores de moléculas pequeñas y grandes de las vías oncogénicas, agentes anti-angiogénicos, la vacunación /inmunoterapia, terapias génicas, y muchos otros, pero no han surgido terapias claramente superiores.
En las dos últimas décadas, celular Las membranas se han convertido en objetivos para los fármacos contra el cáncer. Varias líneas de evidencia han sugerido una relación entre las anormalidades de la membrana celular y la inducción mediada por ceramida de la apoptosis en los tumores [5], [6], [7], [8], [9]. Basándose en estas observaciones, los agentes que interfieren con las membranas celulares se han desarrollado para modular la organización de la membrana, la fluidez, el metabolismo, y la transducción de señales [10], [11], [12]. Poco se sabe, sin embargo, de las vías de señalización subyacentes afectadas por agentes antineoplásicos membrana selectiva.
Hemos estado trabajando para desarrollar un fármaco novedoso bioterapéuticos que pueden atacar selectivamente a la membrana celular de los tumores pancreáticos y destruir con eficacia células pancreáticas malignas sin dañar los tejidos y las células normales. Este agente se compone de dos componentes purificados naturales celulares - una pequeña proteína natural (saposina C, SAPC) y un lípido natural (dioleoilfosfatidilserina, DOPS) - que se ensamblan en nanovesículas cáncer selectivo (SAPC-DOPS). SAPC es una pequeña glicoproteína no enzimático presente en todos los tejidos normales que actúa como un activador biológico de las enzimas lisosomales [13]. La organización funcional de SAPC incluye una membrana de dominio fusogénica y una región para la activación de las enzimas lisosomales [14], [15]. El
N
glicosilación -vinculada no es esencial para la actividad SAPC [16], [17]. SAPC mejora la degradación de la glucosilceramida, esfingomielina, y galactosylceramide a la ceramida a través de β-glucosidasa ácida, esfingomielinasa ácida, y β-galacotsylceramidase ácido, respectivamente [13], [18], [19]. En los pacientes con enfermedades de almacenamiento lisosomal, SAPC acumula junto con glicoesfingolıpidos en macrófagos [20] y parece que SAPC y lípidos excesiva puede ser tóxico para estas células.
Una propiedad general de saposinas es su actividad de unión a membrana lipídica [ ,,,0],21] ya que juegan un papel importante en el transporte de lípidos [22], el montaje de microdominios de lípidos [23], y la reorganización de las membranas biológicas [24], [25], [26]. SAPC interactúa preferentemente con fosfolípidos insaturados, cargados negativamente (tales como DOPS), a pH ácido [15], [21]. Se requiere esta interacción para la activación de las enzimas lisosomales SAPC.
La hipótesis de que debido a la fosfatidilserina (PS) es relativamente abundante en la superficie de las células cancerosas y tejidos [27], [28], que proporcionaría un tumor- objetivo específico para SAPC. En comparación con las células no transformadas, las células neoplásicas son hipermetabólico y por lo tanto producen cantidades significativas de ácido y dióxido de carbono (CO
2) como subproductos de la glucólisis anaeróbica y la respiración aeróbica, respectivamente. Los iones de hidrógeno se acumulan en los tejidos tumorales y, como resultado, el pH extracelular en tumores sólidos media es más bajo (pH ~ 6) que en los tejidos normales (pH ~ 7) [29], [30]. Las células cancerosas también exhiben otras propiedades únicas, tales como alteraciones generalizadas de membrana [31], [32], [33] y "permeabilidad" de las enzimas lisosomales [31]. Curiosamente, varios hidrolasas lisosomales son elevados en los tejidos tumorales [34], [35]. Por lo tanto, un microambiente ácido única con fugas extracelular de enzimas lisosomales hace tejido tumoral un objetivo óptimo para SAPC [9].
En un estudio previo, se encontró que SAPC-DOPS indujo apoptosis en múltiples tipos de células cancerosas, incluyendo neuroblastoma, tumor de vaina nerviosa periférica del tumor y las células de cáncer de mama, sin afectar a las células y tejidos normales [36]. El mecanismo de SAPC-DOPS inducción de la apoptosis se determinó que era, en parte, a través de la elevación de las ceramidas intracelulares, seguido de la activación de caspasa. También se investigó la eficacia antitumoral y biodistribución sistémica de nanovesículas SAPC-DOPS en modelos preclínicos de cáncer [9], [36], [37]. Se encontró que SAPC-DOPS nanovesículas dirigido de manera significativa y se inhibe el crecimiento de xenoinjertos preclínicos de neuroblastoma, tumor de vaina nerviosa periférica del tumor, y el cáncer de piel y no mostró efectos tóxicos en tejidos no tumorales [9], [36], [37].
en el presente estudio, se evaluó la utilidad contra el cáncer de SAPC-DOPS, y su
in vitro
y
in vivo
cáncer de la segmentación y la actividad antineoplásica contra humana Las células de cáncer de páncreas y xenoinjertos tumorales pancreáticas.
Materiales y Métodos
Cultivos celulares
líneas de células pancreáticas humanas (MiaPaCa-2, PANC-1, BxPC-3, Capan- 1, AsPC-1, HPAF-II, Hs766T) de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassa, VA) se cultivaron con de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino, 100 unidades de penicilina /ml, y 10 mg de estreptomicina /ml. epitelio ductal pancreático humano (HDPE) fue proporcionado amablemente por A. Lowy (Moores UCSD Cancer Center, La Jolla, CA), y se cultivaron como se ha descrito en la literatura [38]. línea celular pancreática humana cfPac1-Luc3 fue proporcionado amablemente por O. Wildner (Ruhr-Universität Bochum, Bochum, Alemania) [39]. Todas las células se cultivaron a 37 ° C en 5% de CO
2. Sin contaminación cruzada se encontró en estas células.
Preparación de Proteínas y nanovesículas
SAPC se produjeron como se describe anteriormente [17] con modificaciones. En pocas palabras, saposinas recombinantes se expresan utilizando el sistema PET en
E. Coli
células. Las proteínas expresadas se purificaron en una columna de níquel y completamente desalaron por cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa C4 (HPLC). Después de la liofilización, se utilizó polvo de saposina y su concentración se determinó por su peso. Todos los fosfolípidos se adquirieron en Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). sonicación de baño se utiliza para formar nanovesículas SAPC-DOPS como se ha descrito previamente con modificaciones menores [40]. Después de la eliminación del disolvente bajo gas nitrógeno, se mezclaron los fosfolípidos con proteínas saposina puras en 20 l de tampón de ácido (pH 5) y se diluyó rápidamente en 50X volumen de solución acuosa fisiológica. Después, la mezcla proteína-lípido se sometió a ultrasonidos suavemente y los dos componentes fácilmente ensamblados en nanovesículas. Los nanovesículas sonicadas se pueden utilizar después de almacenar a 4 ° C durante al menos una semana. Para el almacenamiento a largo plazo, se liofilizaron muestras SAPC-DOPS estables se prepararon con un sistema de co-disolvente orgánico agua. Tras eliminar el disolvente, se secó DOPS se disolvió en 80% de alcohol terc-butilo. solución SAPC y sacarosa (10 mg /ml) se hicieron en agua. DOPS y SAPC /sacarosa (vol: vol = 1:0.6) mezcla se liofilizó para una torta de polvo en un secador por congelación (VirTis Unitop, The VIRTIS Co., Gardiner, NY). Para la inyección animal, la torta se rehidrata en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para formar nanovesículas SAPC-DOPS. Esos nanovesículas mostraron el mismo tumor-focalización y la citotoxicidad
in vitro
y
in vivo
.
Nanovesículas
SAPC-DOPS se caracterizaron y supervisados por un analizador de tamaño de partícula más N4 como anterior descrito [9], [36]. Estable nanovesículas SAPC-DOPS tienen un diámetro medio de aproximadamente 200 nm con un potencial zeta media a -42. SAPC une las moléculas de lípidos y espontáneamente incorpora en la bicapa lipídica de los liposomas sobre sonicación. Después de la sonicación y ultracentrifugación para sedimentar SAPC-DOPS acoplado liposomas, no se detectó SAPC en la fracción sobrenadante, que implican una eficiencia muy alta de carga /acoplamiento [9]. SAPC seco se disolvió en solución de PBS para el tratamiento SAPC sin DOPS. DOPS sin SAPC se preparó usando el mismo procedimiento de preparación para nanovesículas SAPC-DOPS.
imágenes en vivo
etiquetado fluorescente de nanovesículas SAPC-DOPS.
En algunas partes del experimento , los nanovesículas SAPC-DOPS fueron marcadas con fluorescencia con una intensidad colorante estable y alto, CellVue® Castaños (CVM, Molecular Orientación Technology Inc., Exton, PA - excitación max = 647 nm; emisión max = 677 nm [9], [36 ]). CVM ha demostrado utilidad en tumores subcutáneos de formación de imágenes, así como ocultos, ortotópicamente implantado, y tumores metastásicos. El destino del tinte podría ser seguido en los ratones vivos utilizando un dispositivo de imágenes de todo el animal de [IVIS-200X (filtro Cy5.5), Xenogen]. Para todos de formación de imágenes, los ratones se anestesiaron ligeramente con isoflurano y se colocaron en una plataforma de calor en el dispositivo de imagen
.
Una alícuota de CVM en etanol se mezcló con el disolvente de fosfolípidos para la preparación de baño de ultrasonidos por el procedimiento descrito anteriormente. CVM etiquetado nanovesículas SAPC-DOPS se separaron del fluoróforo CVM libre utilizando una columna Sephadex G25 ™ (PD-10, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
La bioluminiscencia de las células tumorales pancreáticas.
para realizar el seguimiento las células tumorales, se utilizaron de luciferasa que expresa células tumorales pancreáticas humanas cfPac1-Luc3. Después de la inyección de luciferina, se utilizó el mismo dispositivo de formación de imágenes en vivo (IVIS-200X, Xenogen) para la visualización y localización de la bioluminiscencia.
In vitro Estudios
Efecto de nanovesículas sobre las células tumorales SAPC-DOPS.
Tres líneas celulares de adenocarcinoma de páncreas ampliamente utilizadas las células no transformadas (MiaPaCa-2, PANC-1 y BxPC-3) y (HPDE) se sembraron (10
4 /100 l /pocillo) en placas de 96 pocillos de fondo plano de cultivo de tejidos (Falcon, Becton Dickson Labware, Franklin Lakes, NJ) y se cultivaron en sus respectivos medios de cultivo durante 24 horas, después de lo cual SAPC-DOPS (0,14 mg) o vehículo PBS se añadieron al medio de cultivo. Para evaluar la viabilidad celular, un estándar de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) -dye ensayo (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) se llevó a cabo como se describió previamente [9], [36] tres días después de iniciar el tratamiento. Se llevó a cabo la evaluación microscópica de las células tumorales y las células HPDE.
Con el fin de evaluar la apoptosis, MiaPaCa-2 células de cáncer pancreático fueron tratados con SAPC-DOPS, PBS, o ADNasa (control positivo), y posteriormente evaluados con desoxinucleotidil transferasa terminal mediada por dUTP nick fin de etiquetado (TUNEL) ensayo usando In Situ Cell Death Kit de detección, POD (Roche Applied Science, Alemania) como se describe en el protocolo del fabricante.
con el fin de confirmar que era el ensamblados nanovesículas SAPC-DOPS que causaron la muerte celular, MiaPaCa-2 células de cáncer de páncreas y HDPE se trataron con SAPC-DOPS, SAPC solo, o DOPS solos. La viabilidad celular se evaluó con un ensayo MTT-dye.
Para determinar si la apoptosis inducida por SAPC-DOPS estaba mediada por la activación de caspasas, proteínas de MiaPaCa-2 células nanovesículas tratados se analizaron mediante transferencias Western. Las células se trataron durante 48 horas con SAPC-DOPS, DOPS, PBS, o estaurosporina (control positivo) y después se lisaron para el análisis de proteínas por inmunotransferencia utilizando NuPAGE Novex Bis-Tris geles (4-12%), y el procedimiento de electroforesis por fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). La proteína se transfieren por medio de una unidad semi-seco secante (FB-SDB-2020, Fisher Biotech, Pittsburgh, PA) a la membrana Hybond-ECL nitrocelulosa (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Se utilizaron anticuerpos de caspasa-9 Anti-humano y anti-actina (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) para la detección de las caspasas activas y actina (control), respectivamente
.
Estos experimentos se realizaron por cuadruplicado y los datos se analizados por análisis de varianza (ANOVA). Se utilizaron análisis de la prueba T o de dos vías ANOVA de Tukey para determinar la significación estadística de los experimentos con dos o más de dos grupos, respectivamente. Los análisis se realizaron con SPSS 12.0.
Correlación entre matar efecto de la exposición SAPC-DOPS y PS en la superficie de las células pancreáticas.
Un análisis de citometría de flujo con anexina V marcada con FITC se realizó en 8 líneas celulares (Hs766T, AsPC-1, cfPac1-Luc3, Capan-1, BxPC-3, MiaPaCa-2, HPAF-II, y PANC-1) para determinar el nivel de exposición de PS en la superficie celular. Las líneas celulares fueron separados en dos grupos: el grupo "High-PS" contenía los que tenían una media de fluorescencia (MF) de más de 50 (unidades arbitrarias) y el grupo "Low-PS" contenía los que tienen un MF menos de 50. las células fueron tratadas con nanovesículas SAPC-DOPS y el porcentaje de muerte celular se determinó mediante el ensayo de MTT. experimentos MTT se realizaron por cuadruplicado y los datos se analizaron mediante ANOVA. Los datos presentados son la media aritmética ± SEM.
En vivo
Estudios
Declaración de Ética del uso de animales.
Todos los estudios con animales fueron aprobados por el institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión de la Universidad de Cincinnati (IACUC Protocolo Número: 11-05-05-02) y el Centro Médico del hospital infantil de Cincinnati (IACUC Protocolo Número: 1E03031). Los animales fueron anestesiados con isoflurano o pentobarbital a la moderación antes de las inyecciones de las células tumorales para minimizar el dolor y la angustia. La profundidad de la anestesia se controló mediante la comprobación de la respuesta al dolor (dedo del pie o de pinzamiento del rabo), el músculo y la mandíbula laxitud, y la presencia de respiraciones regulares. Los animales se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron 20% de la masa corporal (es decir, tamaño de la cabeza), ulcerada o necrosado. animales portadores del tumor fueron sacrificados con dióxido de carbono cuando se deterioran las funciones fisiológicas normales, tales como comer y beber, orinar y defecar. Los criterios de eliminación temprana debido a complicaciones de la cirugía incluyen secreción del sitio de la cirugía, pérdida de apetito, pérdida de peso, y la ausencia de limpieza. criterios de eliminación tempranas como resultado del crecimiento del tumor incluyó hemiplejía, sin respuesta a estímulos tales como el ruido o el tacto por un período superior a 12 horas después de la administración de analgésicos, la pérdida de peso superior al 20% con la semana de pesaje, deshidratación, falta de novio, o letargo durante más de 24 horas. Estos criterios fueron abordadas por consulta con el veterinario a cargo
.
En vivo y modelos se utilizaron para investigar la especificidad, la actividad anti-tumoral y la sensibilización aumento de la citotoxicidad de nanovesículas SAPC-DOPS en la orientación del páncreas células tumorales. Para todos los
in vivo
estudios, los ratones hembra nude /nude atímicos (Taconic Farms, Germantown, NY, total de 98) con un peso aproximado de 20-25 gramos se utilizaron. Las células tumorales se inyectan por vía subcutánea o ortotópicamente (Figura S1, Materiales S1). Todas las inyecciones IV se realizaron en la vena de la cola. Para confirmar la presencia de tumores humanos pancreáticas, hematoxilina y eosina (H & amp; E) tinción de los tumores xenoinjertados se realizó; ejemplos se muestran en la figura S2.
evaluación de la dosis para la inhibición del crecimiento del tumor de páncreas en SAPC-DOPS.
Ratones (en total 24) se inocularon por vía subcutánea en el flanco derecho con una suspensión de PANC- 1 en las células tumorales (10
7cells /ratón). Veinticuatro días después de la inoculación, el tamaño del tumor se midió utilizando calibradores vernier y la fórmula V = (π /6) LW
2 (V = volumen, L = longitud, W = ancho) [36]. El día siguiente (día 1), los grupos de ratones portadores de tumores (n = 6 /grupo) se inyectaron cada una por vía intravenosa con SAPC-DOPS (1, 4, o 8 mg /kg en un volumen de 0,2 ml de dosis) o control de vehículo ( 0,2 ml de PBS). mediciones del tamaño del tumor se realizaron a diario y las inyecciones se continuaron cada dos días hasta que los tumores más grandes llegaron a & gt; 2.000 mm
3 tamaño (18 días). Los ratones se sacrificaron y se midió un peso tumoral real. Los análisis estadísticos en esta parte del estudio se realizaron con el software GraphPad Prism ® v4. Las diferencias en los pesos tumorales finales se confirmaron mediante ANOVA con la prueba de comparación múltiple de Dunnett post.
Evaluación de la capacidad de SAPC-DOPS para apuntar PS superficie de las células tumorales pancreáticas.
Para determinar si SapC- DOPS nanovesículas atacan específicamente las células tumorales pancreáticas
in vivo
, MiaPaCa-2 células (5 × 10
6 células) se inyectaron por vía subcutánea en los flancos de los ratones. Después de 5 semanas, cuando los tumores eran palpables, uno de los siguientes era IV inyecta en cada ratón: la etiqueta fluorescente nanovesículas SAPC-DOPS (6 mg /kg), SAPC no acomplejado y DOPS marcados con fluorescencia, DOPS marcados con fluorescencia solo, o PBS de control (5 ratones /grupo, el total de 20). Evaluación de la
in vivo
distribución de la fluorescencia se realizó con el dispositivo de formación de imágenes en vivo-animal. Las imágenes fueron tomadas en varios intervalos de tiempo desde 5 minutos hasta 100 horas después de la inyección.
Para determinar el efecto de bloqueo de la unión de PS, se utilizaron células tumorales pancreáticas cfPac1-Luc3 luciferasa que expresa. Las células se trataron previamente con el PS proteínas de unión lactadherin-C2 [41] y β2-glicoproteína [42] (0,1 mg /ml), o hacia la izquierda en medio sin tratamiento como control durante una hora y luego se inyecta por vía subcutánea en la parte superior de la jefe de ratones desnudos (en total 8). Imágenes de bioluminiscencia se realizó para visualizar las células tumorales. A una hora después de la implantación, la etiqueta fluorescente nanovesículas SAPC-DOPS se inyecta IV, y la señal de fluorescencia se documentó mediante el sistema de imágenes en directo.
Para investigar aclaramiento SAPC-DOPS a partir de tejido normal de ratón, marcado con fluorescencia SAPC-DOPS se IV inyecta en 5 ratones. Los ratones fueron sacrificados y el hígado, bazo, pulmón, corazón, riñón y se eliminaron y la imagen a 1, 12 y 24 horas después de la inyección para evaluar la presencia de la etiqueta fluorescente SAPC-DOPS.
Efecto de nanovesículas sobre el crecimiento del tumor de páncreas SAPC-DOPS
.
MiaPaCa-2 células tumorales pancreáticas (5 × 10
6 células), que se documenta en el
estudios in vitro
fueron susceptibles a SAPC tratamiento -DOPS (& gt; 80% de muerte celular), se inyectaron por vía subcutánea en la parte superior trasera de los ratones. El tamaño del tumor se midió con calibres cada 3 días y se calculó el volumen. Cuando el volumen medio del tumor creció a $ $ 500 mm
3, los ratones fueron inyectados IV, ya sea con SAPC-DOPS (6 mg /kg) o PBS solo (5 ratones /grupo, el total de 10). Las inyecciones se repitieron el día 3, 6, 12, 15, 18, 21, y 24, y las medidas del tumor se continuaron hasta el día 30. análisis o de dos vías ANOVA Tukey T-test se utilizaron para determinar la significación estadística de los experimentos con dos o mayor que dos grupos, respectivamente. Los análisis se realizaron con SPSS 12.0.
Seguimiento de la bioluminiscencia del tumor y la fluorescencia SAPC-DOPS en ratones con tumores de páncreas ortotópico.
Para demostrar cómo SAPC-DOPS se dirige selectivamente a los tumores de páncreas ortotópico, cfPac1- humana se inyectaron células Luc3 en el páncreas del ratón desnudo. Después de un tumor de páncreas ortotópico se detectó el uso de imágenes en vivo en el día 6, la etiqueta fluorescente nanovesículas SAPC-DOPS, marcado con fluorescencia SAPC, DOPS marcados con fluorescencia, o PBS (control) fueron inyectados IV (6 ratones /grupo, el total de 24).
ratones
la supervivencia de SAPC-DOPS-tratados con tumores pancreáticos implantados de forma ortotópica.
Los grupos de ratones (n = 6 cada uno, 12 en total) con células tumorales pancreáticas ortotópica inyectadas (luciferasa que expresan la línea cfPac1-Luc3) confirmada por bioluminiscencia en imágenes en vivo fueron IV inyectados con dosis múltiples (día 6, 9, 12, 15, 19, 23, 27, 30, 34, 41) de SAPC-DOPS (6 mg /kg en 30 l de PBS) o vehículo control (PBS 30 l). Los nanovesículas SAPC-DOPS marcados con fluorescencia se detectaron entonces usando el sistema de imágenes en directo. Los animales supervivientes se observaron hasta que todos los ratones en el grupo de control caducado. Las curvas de supervivencia fueron creados usando el método de Kaplan y Meier con el software GraphPad Prism. Los tumores bioluminiscentes fueron monitorizados con el dispositivo de imágenes en vivo durante 23 semanas.
seguimiento a largo plazo de la bioluminiscencia del tumor y la fluorescencia SAPC-DOPS en ratones con tumores de páncreas ortotópico.
luciferasa que expresan cfPac1- células tumorales pancreáticas Luc3 se inyectaron ortotópicamente en el páncreas del ratón. Después de 110 días, la distribución de los tumores bioluminiscentes se controló usando el dispositivo de formación de imágenes en vivo-animal. Después de la bioluminiscencia disipa, se inyectaron marcados con fluorescencia nanovesículas SAPC-DOPS (6 mg /kg) y los ratones se obtuvieron imágenes de nuevo.
Orientación de los tumores implantados ortotópicamente oculta-y metastásicos por nanovesículas SAPC-DOPS marcadas con fluorescencia.
ortotópico tumores pancreáticos se generaron mediante la implantación de una línea de luciferasa que expresan de páncreas tumoral (cfPac1-Luc-3) en ratones. Después de 6 semanas, se obtuvieron imágenes de los ratones para identificar todos los sitios del tumor. Una vez que la bioluminiscencia se había disipado, marcado con fluorescencia SAPC-DOPS fue inyectado IV.
Resultados
in vitro
Estudios
Efecto de SAPC-DOPS en nanovesículas las células tumorales.
En estudios previos, se encontró que la relación molar óptima de SAPC y DOPS era 01:03-01:10 para el efecto citotóxico máxima contra el neuroblastoma humano y células de cáncer de piel [36], [37 ]. Hemos determinado que este intervalo molar de SAPC: relación de DOPS también tuvo efecto letal significativo sobre las células de cáncer pancreático humano (MiaPaCa-2) (Figura 1A). Cuando las tres líneas celulares de adenocarcinoma de páncreas y las células se trataron con HPDE SAPC-DOPS, la mayoría de las células tumorales murieron, mientras que las células permanecieron viables HPDE (Figura 1B). La inspección microscópica de las células tratadas con SAPC-DOPS indicado que las células tumorales tenían rasgos morfológicos consistentes con la muerte apoptótica, mientras que las células no transformadas HPDE parecían normales (Figura 2). TUNEL análisis reveló que SAPC-DOPS, efectivamente inducir la apoptosis (Figura 1C). A diferencia de SAPC-DOPS y la ADNasa control positivo, el control negativo de PBS no tuvo efecto apoptótico. Ambos componentes de SAPC-DOPS eran esenciales para la destrucción de células tumorales óptima. Si sólo la proteína (SAPC) o los componentes de fosfolípidos (DOPS) se añadieron individualmente a las células, no hubo inducción de la apoptosis y el porcentaje de células apoptóticas fue comparable al control de PBS (Figuras 1B y 1D). El análisis de transferencia Western reveló que la escisión de la pre-pro-enzima caspasa-9 a la forma activa se produjo sólo en las células tratadas con SAPC-DOPS y las células tratadas con estaurosporina (Figura 1E)
.
(A) Papel de relación molar SAPC y DOPS para la citotoxicidad sobre las células de páncreas humano (MiaPaCa-2) de cáncer. (B) La muerte celular (%) en las células humanas de cáncer de páncreas (MiaPaCa-2, PANC-1 y BxPC-3) y controles normales (HPDE) después de la exposición a SAPC-DOPS. (Se reportan los datos en 1B-1D como media aritmética ± SEM.) (C) Apoptosis (%) en MiaPaCa-2 células de cáncer de páncreas después del tratamiento ya sea con SAPC-DOPS, PBS (control negativo), o ADNasa (control positivo). (D) La muerte celular (%) en las células de cáncer de páncreas humano y HPDE después de la exposición a SAPC-DOPS, solo SAPC, o DOPS solo. (E) Análisis de transferencia Western demuestra que el tratamiento de 2 MiaPaCa células de cáncer de páncreas tanto con el SAPC-DOPS y el control positivo estaurosporina (P) resultó en la escisión de pre-caspasa-9 de la caspasa-9 activa, mientras que el tratamiento con DOPS, PBS , y el control negativo (N) no provocó activación de la enzima.
Las células tumorales (PANC-1, Capan-1 y MiaPaCa-2 en (B), (C) y (D) , respectivamente) tenían características morfológicas consistentes con la muerte por apoptosis después del tratamiento con SAPC-DOPS, mientras que las células no transformadas HPDE (a) parecían normales.
Correlación entre matar a efecto de SAPC-DOPS y la exposición de PS en el páncreas superficie de la célula.
el histograma de fluorescencia en la Figura 3A demuestra que el nivel PS externa en células PANC-1 fue mayor que el de las células AsPC-1. La expresión relativa PS en la superficie celular de líneas celulares de tumor pancreático humano se demuestra en la Figura 3B. Entre estas líneas celulares, MiaPaCa-2, HPAF-II, y PANC-1 tenían MF más de 50 y, por tanto, formaban el grupo de "High-PS". Como se muestra en la Figura 3C, las células en el grupo de alta PS demostraron significativamente mayor citotoxicidad en respuesta a SAPC-DOPS de las células en el grupo de bajo-PS (p & lt; 0,05).
(A) histograma de fluorescencia de los niveles de PS en PANC-1 y las superficies de AsPC-1 de células medidas por Anexina V-FITC. (B) La expresión diferencial PS en la superficie celular pancreática humana de 9 líneas celulares. (C) Porcentaje combinado de la supervivencia celular en los dos grupos de líneas de células tratadas con SAPC-DOPS como se determina mediante el ensayo de MTT (p = 0,0032) guía empresas
En vivo
Estudios.: subcutánea pancreático modelo de tumor
evaluación de la dosis para la inhibición del crecimiento del tumor de páncreas en SAPC-DOPS.
tamaños de los tumores después de la administración de SAPC-DOPS a dosis de 4 mg /kg y 8 mg /kg cada otro día fueron significativamente más pequeño que el del grupo de control y 1 mg grupo de tratamiento kg /(p = 0,003 * y 0,00015 **) después de 18 días de tratamiento (Figura 4). Sobre la base de estos datos, se optó por un tratamiento con dosis de 6 mg /kg para los estudios de eficacia.
PANC-1 xenoinjertos de tumores en ratones desnudos fueron tratados cada dos días con 1, 4, u 8 mg /kg de SAPC -DOPS, o con el control de PBS. tamaños tumorales en altas dosis (4 mg /kg y 8 mg /kg) fueron significativamente más pequeños que los grupos /kg a 1 mg control y (p = 0,003 * y ** 0,00015, respectivamente).
Evaluación de la capacidad de SAPC-DOPS para apuntar PS superficie sobre las células tumorales pancreáticas.
formación de imágenes en vivo demostraron que la etiqueta fluorescente nanovesículas SAPC-DOPS se dirige rápidamente a la tumor palpable dentro de los 5 minutos (datos no mostrados) y la fluorescencia persistido durante más de 4 días (Figura 5). La fluorescencia del ensamblado SAPC-DOPS nanovesículas dirigido a los sitios de tumor, mientras que no se observó fluorescencia tumor después de la co-inyección de no acomplejado SAPC y DOPS marcado con fluorescencia, o después de la inyección de marcado con fluorescencia DOPS solo o control PBS (Figuras 6A y 6B). Mientras que la etiqueta fluorescente SAPC-DOPS se observó a acumularse en el hígado temprano (2 horas después de la inyección), no había ni rastro de la fluorescencia de hígado en las imágenes en vivo después de 24 horas (Figura 6A). Del mismo modo, la no acomplejado SAPC y DOPS marcados con fluorescencia, y los DOPS marcados con fluorescencia por sí solos, se identificaron en el hígado a las 0,5 horas de imágenes en vivo, pero se disipó rápidamente (Figura 6B).
Los nanovesículas fueron atacados rápidamente al tumor palpable dentro de los 5 minutos (datos no mostrados). La fluorescencia persistió durante más de 1 (A) y 4 (B) días. SAPC = 3,2 mg /kg, DOPS = 1,8 mg /kg, CVM = 6 M.
heterotópico MiaPaCa-2 tumores (en el círculo) fueron generados mediante inyección subcutánea en el flanco superior de ratones desnudos. (A) Los ratones 1 & amp; 2 eran ratones portadores de tumores, inyectados con la etiqueta fluorescente nanovesículas SAPC-DOPS; 3 del ratón era no portadores de tumores, PBS inyectado. Los ratones 1 y 2 demuestran tanto la localización de la etiqueta fluorescente al sitio del tumor. La fluorescencia también se localiza en el hígado por 2 horas, pero se ha ido por 24 horas. (B) los ratones portadores del tumor de 4, 5 y 6 fueron inyectados con SAPC no acomplejado y DOPS marcados con fluorescencia, sólo DOPS marcados con fluorescencia, y PBS, respectivamente. No hay fluorescencia localizada a tumor en ninguno de estos ratones.