Extracto
La expresión del factor potenciador linfoide 1 (LEF1) está frecuentemente alterado en diferentes cánceres humanos. Este estudio tuvo como objetivo evaluar la expresión LEF1 en tejidos de cáncer de colon y de explorar fenotipos modificados, las expresiones de genes, y el posible mecanismo después de derribado LEF1 expresión en líneas celulares de cáncer de colon. Un total de 106 de cáncer de colon y los tejidos normales emparejados paratumorous se utilizaron para evaluar la expresión LEF1 mediante inmunohistoquímica y QRT-PCR. LEF1 lentivirus se utilizó para desmontables expresión LEF1 para la evaluación de la viabilidad celular, la distribución del ciclo celular, apoptosis, y las expresiones de genes. El ensayo de xenoinjerto de ratón desnudo se realizó para detectar los efectos de la caída LEF1
in vivo
. Los datos mostraron que los niveles de LEF1 ARNm y proteínas se incrementaron significativamente en los tejidos de cáncer de colon humano en comparación con los tejidos normales paratumorous emparejados y se asociaron con la profundidad de infiltración, los ganglios linfáticos y metástasis a distancia, etapas avanzadas TNM (tumor de nodo metástasis), y la supervivencia general más corta. Además, LEF1 caída reduce la viabilidad de células tumorales, la capacidad de invasión, MMP2 y la expresión de MMP-9, pero la apoptosis inducida. Ensayo de xenoinjerto en ratones desnudos mostró que LEF1 caída suprime la formación de tumores y el crecimiento
in vivo
. Además, la expresión de Notch proteínas relacionadas con la vía-RBP-jκ y Hes1 se redujo en las células desmontables Lef1. En su conjunto, la proteína LEF1 se sobreexpresa en tejidos de cáncer de colon y desmontables expresión LEF1 inhibe el crecimiento del cáncer de colon
in vitro
y
in vivo
. Estos datos sugieren que la orientación de la expresión LEF1 debe evaluarse aún más para la prevención y la terapia del cáncer de colon
Visto:. Wang W-J, Yao Y, Jiang L-L, Hu T-H, Ma J-Q, Liao Z-J, et al. (2013) Derribo del factor potenciador linfoide 1 inhibe la progresión del cáncer de colon
in vitro
y
En Vivo
. PLoS ONE 8 (10): e76596. doi: 10.1371 /journal.pone.0076596
Editor: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 31 de mayo de 2013; Aceptado: 3 de septiembre de 2013; Publicado: 2 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.81001090) (http://www.nsfc.gov.cn/nsfc/cen/xxgk/slzz.html).The~~number=plural donantes no tenía papel en el diseño del estudio , recopilación de datos y análisis, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cáncer de colon es uno de los más comunes. cáncer tanto en hombres y mujeres en el mundo, lo que representa la segunda causa de muerte por cáncer en los Estados Unidos [1,2] y el cuarto en china [3]. Por lo tanto, el cáncer de colon sigue siendo un importante problema de salud pública mundial, aunque hay una disminución significativa en todo el mundo en la mortalidad relacionada con el cáncer de cáncer de colon en los últimos decenios, debido a los considerables avances en el diagnóstico precoz y tratamientos eficaces. Hasta la fecha, la patogénesis y el mecanismo molecular responsable del desarrollo de cáncer de colon han sido exhaustivamente estudiada y un gran cuerpo de conocimiento se ha generado con respecto a las alteraciones moleculares asociadas con la carcinogénesis de colon, que implica la activación de oncogenes y el silencio de genes supresores de tumores [4]. Sin embargo, aún queda mucho por hacer para que el conocimiento preciso de la carcinogénesis de colon y el desarrollo de nuevas estrategias para controlar eficazmente esta enfermedad.
Con este fin, nuestra investigación se centra en linfoide potenciador de la unión del factor-1 (LEF1) , un miembro de la familia de proteínas de alto grupo de movilidad (HMG).
LEF1
códigos de una proteína nuclear de 48 kD que habitualmente se expresa en las células T [5,6] pre-B y y juega un papel importante en la embriogénesis y el desarrollo del cáncer [7]. LEF1 es una proteína multifuncional que influye en numerosas funciones celulares, como la regulación de la señalización Wnt para la proliferación celular, la apoptosis, la movilidad y la transcripción de genes [8,9]. La expresión alterada de la proteína LEF1 se ha informado a participar en la tumorigénesis de diferentes cánceres humanos, incluyendo el cáncer de colon [10]. Molecularmente, LEF1 puede mediar la expresión de Wnt de señalización genes a través de reclutamiento de β-catenina al promotor de los genes diana [11,12], pero sí LEF1 carece de su propio potencial de activación de la transcripción en las células. proteína LEF1 que contiene dominios de unión β-catenina puede regular la proliferación celular y la invasión de las células tumorales [13]. Múltiples factores podrían influir en la expresión LEF1, tal como el factor-2 de crecimiento de fibroblastos, PITX2, y el factor de crecimiento de hepatocitos [14-16].
Por lo tanto, en este estudio, se detectó la expresión primera LEF1 en tejidos de cáncer de colon en comparación con los tejidos de colon paratumorous y luego investigaron los efectos de LEF1 caída en la regulación de la viabilidad de células de cáncer de colon, la distribución del ciclo celular, apoptosis, y la expresión génica
in vitro
y en xenoinjertos de ratones desnudos. Además, se estudiaron los efectos de LEF1 caída en la regulación de la vía de Notch.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Conducta Humana de el primer hospital Afiliado de la Facultad de Medicina de la Universidad de Xi'an Jiaotong. consentimientos informados escritos fueron obtenidos de todos los pacientes.
El animal protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Xi'an Jiaotong.
Pacientes y muestras
En este estudio, se reclutaron de forma retrospectiva 106 pares de cáncer de colon resecado quirúrgicamente y muestras de tejidos normales paratumorous (5 cm de distancia de la lesión tumoral) desde el primer hospital Afiliado de la Facultad de Medicina de la Universidad de Xi'an Jiaotong entre enero de 2006 y marzo de 2007. Estas muestras de tejido se obtuvieron de 60 a 46 pacientes de sexo femenino con una edad media de 55,5 años (rango de 30 a 81 años) y masculinos. características clinicopatológicas de estos pacientes se muestran en la Tabla 1. El diagnóstico patológico de estos especímenes fue independientemente re-confirmó por dos patólogos de una manera ciega. Todos los pacientes no fueron tratados con cualquier quimioterapia o radioterapia antes de la cirugía. El último paciente de seguimiento se llevaron a cabo a finales de mayo de 2012. Los pacientes que se perdieron durante el seguimiento o la muerte por causas distintas al cáncer de colon fueron considerados como datos censurados durante el análisis de supervivencia.
Las variables clinicopatológicas
N
puntuación de expresión LEF1 (media ± DE)
P
valor
Edad (años) & lt; 60414,87 ± 2.330.502≥60655.21 ± 2.65Tumor differentiationWell504.84 ± 1.940.274Moderate394. 95 ± ± 2.87Poor175.59 3.02Infiltration deptht
1 + T
2404,12 ± 1.980.002T
3 + T
4665,66 ± 2.56Lymph nodo metástasis N
0464,06 ± 2,12 & lt; 0,001 N
1 a 3605,85 ± 2.74Distant metastasisM
0864,69 ± 2.040.004M
1206,31 ± 2.77TNM stageI81.39 ± 3,23 & lt; 0.001II334.14 ± ± 2.40III455.33 2.25IV207.12 ± 1 2.69Table . Asociación de expresión LEF1 con factores clínico-patológicas de los pacientes.
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secciones histopatología e inmunohistoquímica
incluidas en parafina
(5 micras) se deparaffinized y rehidratada a través de una serie de alcoholes graduados. Para la inmunohistoquímica, se utilizó un anticuerpo primario contra LEF1 (C12A5, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) a una dilución de 1: 100, y se incubó durante la noche a 4 ° C. Las secciones se incubaron con un anticuerpo de control isotipo como control negativo. A continuación, las secciones se tiñeron con un anticuerpo secundario conjugado con biotina y el color fue desarrollado usando 0,05% 3 ', 3'-tetrahidrocloruro de diaminobencidina seguido de contratinción con hematoxilina. Las secciones fueron revisados y finalmente se calificó con un microscopio Olympus (BX41; Tokio, Japón), de acuerdo con un estudio anterior utilizando multiplicando la puntuación de la intensidad y el alcance de la puntuación de tinción [17]. La intensidad de la tinción se puntuó como 0 (sin tinción), 1 (tinción débil), 2 (medio de tinción), o 3 (fuerte tinción). El grado de tinción se evaluó mediante la asignación de las muestras de las puntuaciones basadas en el porcentaje de células teñidas positivamente como sigue: 0 (0%), 1 (1-25%), 2 (26 a 50%), 3 (51-75%) , y 4 (76 a 100%). El número de células positivas se evaluó contando 10 campos aleatorios a magnificación × 400. La puntuación final se varió de 0 a 12. Una puntuación de 0-2 se definió como expresión negativa, las puntuaciones de 3-5 como "expresión débil", las puntuaciones de 6-9 como "una expresión moderada" y las puntuaciones de 10-12 como "fuerte expresión ". Para el propósito de un análisis más detallado de las muestras con puntuación de 0 a 5 se definieron como marcadamente reducida tinción o pérdida de la expresión LEF1, mientras que las muestras con puntuaciones de 6-12 se agruparon y se definen como la expresión positiva.
tiempo real transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa
ARN celular total fue aislado de los tejidos y líneas celulares utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Estas muestras de ARN se transcribe a continuación a la inversa en ADNc usando un kit de RT-PCR (Takara, Dalian, China). a continuación, en tiempo real PCR se realizó en iQ5 Sistema Multi-color de PCR en tiempo real de detección (Bio-Rad, Hercules, CA) utilizando SYBR Premezcla Ex Taq TM II (Takara). Las secuencias de los cebadores para amplificar LEF1 fueron: 5'-AGCGAATGTCGTTGCTGAGTGTA-3 'y 5'-CTCTTGCAGACCAGCCTGGATAA-3'. Una limpieza gen GAPDH se utilizó como control interno, y las secuencias de los cebadores fueron 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 'y 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'. Los datos fueron adquiridos como un ciclo umbral (? C
t) de valor. Los? C
t valores se determinaron restando la media interna limpieza de genes C
valor t del gen diana promedio de C
valor t. Dado que la eficiencia de la amplificación de los genes diana y el gen de control interno era igual, la expresión génica relativa se calculó utilizando el método 2
-ΔΔCt. Cada medición se realizó por triplicado.
Construcción del vector de lentivirus shRNA llevar LEF1
Un vector de lentivirus shRNA LEF1 (U6-vshRNA-CMV-PUR-GFP-GV248-shLEF1) fue diseñado, sintetizado y construido por Genechem Co. (Shanghai, china). Se seleccionaron las siguientes secuencias diana en el gen LEF1 humano, es decir, meta 1, GCTGACATCAAGTCTTCCTTG; meta 2, GTGAAGAGCAGGCTAAATATT; la meta 3, GCTGGTCTGCAAGAGACAATT; y la meta 4, GCTCA TTCCCAACGTGCAAAG. Objetivo 3 fue elegido para los experimentos posteriores. El vector de lentivirus U6-vshRNA-SHNC, que codifica una secuencia aleatoria de ARNi, se utilizó como control negativo.
Las líneas celulares, la cultura, la transfección génica y tratamientos
líneas celulares de cáncer de colon humano, Caco
2, Colo205, HCT116, HT29, y Lovo se obtuvieron del Centro de recursos de la célula, Shanghai Institutos de Ciencias Biológicas (Shanghai, china) y se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Hyclone, Logan, UT, EE.UU.) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS; Invitrogen), penicilina (100 UI /ml) y estreptomicina (0,1 mg /ml) en 5% de CO
2 a 37 ° C. Una línea celular de cáncer de colon humano SW480 se cultivó en medio RPMI 1640 (Hyclone, Logan, UT, EE.UU.) suplementado con 10% FBS, penicilina (100 UI /ml) y estreptomicina (0,1 mg /ml) en 5% de CO
2 a 37 ° C, mientras que otra línea celular de cáncer de colon humano, SW620, se cultivó en medio L-15 (Invitrogen) suplementado con 10% FBS, penicilina (100 UI /ml) y estreptomicina (0,1 mg /ml) en 5 % de CO
2 a 37 ° C. células SW480 y SW620 se infectaron con vectores de lentivirus a una multiplicidad de infección (MOI) de 10 y 100, respectivamente, y luego seleccionados en medio de crecimiento que contiene puromicina. Después de 7 días de cultivo, las colonias resistentes a la puromicina fueron recogidos, se expandieron y se analizaron por separado
γ-secretasa DAPT inhibidor (100 M; Sigma-Aldrich, EE.UU.). Se utilizó para los ensayos de inhibición farmacológica, lo que efectivamente puede bloque de dominio intracelular Notch (NICD) que entra en el núcleo de la célula. En breve, estas células se sembraron en placas de seis pocillos y se trataron con 2 ml de medio que contiene 1% de FBS y DAPT. Las células de control se trataron con la misma cantidad de dimetil sulfóxido (DMSO). Después de 48 h de incubación, los extractos de células se prepararon para la transferencia de Western como se describe a continuación.
Se extrajo
extracción de proteínas y Western blot
La proteína de los tejidos y células, y estos lisados de proteínas fueron separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio -12% 6%; proteínas separadas se transfirieron a continuación electrónicamente a membranas de difluoruro de polivinilideno (Millipore, Danvers, MA). Las membranas se bloquearon a continuación y posteriormente se incubaron con los siguientes anticuerpos primarios: anti-LEF1 de anticuerpos (1: 800; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anti-MMP2 (1: 500; Cell Signalling Technology, Danvers, MA), anti -MMP7 (1: 100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-MMP9 (1: 100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-NICD (1: 800; Cell Signalling Technology), anti- RBP-jκ (1: 100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-Hes1 (1:50; Santa Cruz Biotechnology), o anticuerpo anti-β-actina (1: 1000; Santa Cruz Biotechnology). En el último, las manchas se visualizaron mediante un sistema de detección ECL (Millipore) con una peroxidasa de rábano picante conjugada con anticuerpo secundario (Santa Cruz Biotechnology). Western blots se repiten tres veces para cada muestra de proteína.
La viabilidad celular ensayo MTT
Las células (5 × 10
3 por pocillo) se sembraron con 200 l de medio de crecimiento en un 96 -bien placa y se dejó crecer hasta 7 días. Al final de los experimentos, 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil-tetrazolio (MTT, 0,5 mg /ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) se añadido a cada pocillo. Las células fueron cultivadas a 37 ° C durante 4 h, y se añadieron 150 l de DMSO en cada pocillo y se mezclaron por agitación a temperatura ambiente durante 10 min. Después de eso, la velocidad de absorción se midió a una longitud de onda de 490 nm utilizando un espectrofotómetro. Cada experimento se realizó por triplicado y se repitió al menos tres veces.
ensayos de citometría de flujo del ciclo celular y la apoptosis
Para el análisis del ciclo celular, (5 × 10 5
) y las células fueron cultivadas recogió, se lavó dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), y se fija con helado de etanol 70% durante 24 horas a 4 ° C. Las células fijadas se tiñeron con 150 l de yoduro de propidio y 150μl RNasa A (Sigma-Aldrich) secuencialmente. Después de la incubación durante 30 minutos a 37 ° C, las muestras fueron examinadas por un citómetro de flujo (FACS-Calibre, Franklin Lakes, NJ), y Cell Quest software se utilizó para analizar los datos. Cada experimento se repitió al menos tres veces.
Para el análisis de apoptosis, las células (5 × 10
5 por pocillo) se cultivaron en placas de seis pocillos, se recogió y se lavó dos veces con PBS enfriado en hielo. A continuación, 500 l de tampón de unión, 5 l Anexina V-APC, y 5 l 7-AAD (keygen Biotech, Nanjing, China) se añadieron secuencialmente a las muestras. Después de la mezcla y la incubación durante 15 min a 37 ° C, las muestras se corrieron en la citometría de flujo inmediatamente. Cada experimento se repitió al menos tres veces.
Tumor de células Matrigel ensayo de invasión
La capacidad de invasión de las células de cáncer de colon se evaluó mediante el uso de una cámara de invasión Millicell (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) . Los insertos 8 micras de poro fueron recubiertos con Matrigel (Becton Dickinson y Company, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.). Las células (5 × 10
4) se resuspendieron con 200 l de medio libre de suero con 5 mg /ml de mitomicina C (Sigma-Aldrich) en la cámara superior y la cámara inferior se llenó con medio de cultivo normal. Después de incubación durante 24 h, las células no invasoras en la superficie superior se eliminaron con un hisopo de algodón y las células invasoras en la superficie inferior del filtro se fijaron en metanol, se tiñeron con 0,1% de cristal violeta, y se contaron bajo un microscopio utilizando 10 campos seleccionados al azar en una magnificación de 200x
ratón desnudo ensayo de xenoinjertos de células tumorales
Hombre Balb /c ratones desnudos (edades entre 4 y 6 semanas;. Shanghai Experimental Animal Center, de Shanghai, China) se inocularon por vía subcutánea con 1 x 10
7 células y alojarse en una instalación libre de patógenos del Centro Animal de la Universidad de Xi'an Jiaotong. El volumen del tumor se determinó por la longitud (L) y la anchura (W), medida con un calibrador deslizante y calculado como L x W
2 × 0,5. Los ratones fueron sacrificados 45 días después de la inyección subcutánea de células tumorales. Tumor de ratones desnudos portadores fueron observados por el sistema óptico IVIS (espectro IVIS, Xenogen, CA, EE.UU.) antes de ser sacrificado.
El análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Los datos descriptivos se analizaron con la prueba de chi-cuadrado de Pearson (doble cara). Los datos de medición se analizaron con el estudiante de
t-test
o el análisis de la varianza (ANOVA). Un
valor de P Red de menos de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
LEF1 expresión en tejidos de cáncer de colon humano y líneas celulares
En este estudio , primero se determinó la expresión de la proteína LEF1 en tejidos de cáncer de colon humano y líneas celulares mediante inmunohistoquímica. Los resultados mostraron que 71 de 106 tejidos de colon y 23 de 106 paratumours tejidos de colon normales expresan la proteína LEF1, lo que indica que los tejidos de cáncer de colon expresaron niveles más altos de LEF1 que las de los tejidos de colon normales paratumours (
P
& lt; 0,05; Figura 1A). Obviamente, no se observó expresión LEF1 en los núcleos en los tejidos de cáncer de colon y paratumours tejidos de colon normales (Figura 1A). Además, la expresión de la proteína se asoció con LEF1 profundidad de infiltración, los ganglios linfáticos y metástasis a distancia, y TNM avanzado (tumor-nódulo-metástasis) etapas de cáncer de colon (
P
& lt; 0,01; Tabla 1). El análisis de supervivencia (5-años de seguimiento de 106 pacientes con cáncer de colon) mostró que la tasa de supervivencia media de los pacientes con LEF1 expresa del tumor fue de 48,5 meses, que fue significativamente peor que aquellos con tumores LEF1-negativo (más de 60 meses) (
P
& lt; 0,05; Figura 1B)
(a) tinción inmunohistoquímica de LEF1 en tejidos de colon paratumorous (a) y tejidos de cáncer de colon (BD) (barra de escala, 25μm):. ( a) expresión negativa, (b) débil expresión, (c) expresión moderada, (d) la expresión fuerte. (B) Curva de Kaplan-Meier para la asociación de la expresión de proteínas LEF1 con la supervivencia global de los pacientes. (C) QRT-PCR se utilizó para detectar los niveles de expresión relativa de ARNm LEF1 (tejidos cc: tejidos de cáncer de colon; tejidos normales: tejidos de colon paratumorous). Columnas, media (n = 106); bares, SD; ***
P Hotel & lt; 0,001 en comparación con los tejidos de colon paratumorous.
P
valor fue determinado por el estudiante de
t-test
. (D) Análisis de transferencia Western de la expresión LEF1 en siete células de cáncer colorrectal (Caco
2, Colo205, HCT116, HT29, Lovo, SW480, SW620 y). β-actina se utilizó como control interno.
Del mismo modo, en tiempo real el análisis de PCR mostró que los niveles de mRNA LEF1 se incrementaron significativamente en estos 106 pares de tejidos de cáncer de colon en comparación con los tejidos de colon normales paratumours (
P Hotel & lt; 0,05; Figura 1C). Además, la expresión LEF1 fue altamente expresado en líneas celulares de cáncer de colon SW480 y SW620 (Figura 1D). Por lo tanto, hemos elegido estas dos líneas celulares para derribar la expresión LEF1 en estudio.
caída estable de expresión LEF1 en células de cáncer de colon
Para explorar el papel de LEF1 en las células de cáncer de colon, hemos utilizado un lentivirus shRNA llevar LEF1 para infectar SW480 y SW620 para desmontables expresión LEF1. Objetivo 3 se utilizó para establecer las líneas celulares estables LEF1 desmontables. Obtuvimos desmontables células LEF1 estables denominados shLEF1 y SHNC (con el vector de control negativo). En tiempo real el análisis de PCR mostró que la expresión de mRNA LEF1 se inhibió hasta el 70% en las células shLEF1 comparación con las células SHNC (
P
& lt; 0,05; Figura 2A). Del mismo modo, los niveles de proteína LEF1 también fueron eliminados de manera significativa en las células shLEF1 que en las células SHNC (Figura 2B).
(A) análisis de QRT-PCR de la expresión LEF1 después de la infección de diferentes vectores de expresión de lentivirus LEF1 shRNA, *
P
& lt; 0,05 en comparación con la célula madre. (B) Análisis de transferencia Western de la expresión de proteínas LEF1. β-actina se utilizó como control interno. 1-4 (diferentes vectores de posición objetivo) y SHNC (control negativo). Objetivo 3 se utilizó para establecer las líneas celulares estables LEF1 desmontables.
Desmontables expresión de LEF1 inhibió la viabilidad de las células de cáncer de colon
in vitro Opiniones y formación de tumores y el crecimiento
in vivo
transfectantes estables LEF1 shRNA fueron sembradas y cultivadas en el medio de cultivo que contenía puromicina para la evaluación de la viabilidad celular. Nuestros datos muestran que las células SW480-shLEF1 y células SW620-shLEF1 crecieron mucho más lentamente que las células SW480-SHNC y células SW620-SHNC, respectivamente (
P
& lt; 0,01; figura 3A). distribución del ciclo celular detectado por un citómetro de flujo mostró un retraso prolongado y destacado de la progresión de la fase G0 /G1 a la fase S en células shLEF1 en comparación con la de las células SHNC (
P
& lt; 0,01; Figura 3B y 3C). Por otra parte, se analizaron, además, si la viabilidad de las células tumorales reducido es debido a la inducción de la apoptosis y encontrado que las células SW480 y SW620 con estable transfección LEF1 shRNA tenían significativamente más apoptosis en comparación con las células control (Figura 3D y 3E).
(A) ensayo de MTT. **
P Hotel & lt; 0,01 en comparación con las células SHNC correspondientes. (B y C) Flujo de distribución del ciclo celular por citometría. Columnas, media (n = 3); bares, SD; **
P Hotel & lt; 0,01 en comparación con las células SHNC correspondientes. (D y E) Flujo de ensayo de apoptosis por citometría. Cell apoptosis espontánea se evaluó por citometría de flujo. Columnas, media (n = 3); bares, SD; ***
P Hotel & lt; 0,001 en comparación con las células de control SHNC
Además, se realizó un ensayo de xenoinjerto en ratones desnudos para evaluar el papel de LEF1 caída
in vivo.
. Cuarenta y cinco días después de la inyección de células tumorales, xenoinjertos LEF1 knockdown-tumorales mostraron una reducción del crecimiento del tumor en comparación con xenoinjertos de tumor de control-SHNC. Además,
in vivo de formación de imágenes
mostró que ambos tipos de ratones no tenían metástasis de tumores observables a los órganos distantes (Figura 4A). Los volúmenes promedio de la masa tumoral derivada de células SW480-shLEF1 y células SW620-shLEF1 eran mucho más pequeños que los de los xenoinjertos de tumores derivados de las células SW480-SHNC y células SW620-SHNC, respectivamente (
P
& lt; 0,001 La figura 4B). El peso del tumor también mostró que desmontables de expresión LEF1 inhibió el crecimiento de células de cáncer de colon en ratones desnudos (Figura 4C), ya que el peso de los tumores de masa en SW480 y SW620 células que expresan shLEF1 fue significativamente más ligero que los de los ratones de control. Este hallazgo sugiere que la formación LEF1 desmontables inhibido y el crecimiento de xenoinjertos de tumores in vivo.
(A)
En
in vivo análisis de imágenes
. El crecimiento de tumores formados por células shLEF1 y células SHNC de control en ratones desnudos Se obtuvieron imágenes por IVIS. (B) El volumen del tumor se midió cada 3 días a partir del día 9 después de la inoculación mediante la medición de la longitud y la anchura del tumor. Columnas, media (n = 6); bares, SD; ***
P
& lt; 0,001 en comparación con las células de control SHNC. (C) El peso del tumor se comparó en día 45 después de la inoculación de células tumorales. Columnas, media (n = 6); bares, SD; ***
P
. & Lt; 0,001 en comparación con el control SHNC
Desmontables expresión de LEF1 disminuyó invasión de células de cáncer de colon y la expresión de MMP-2 y MMP-9
Después de eso, se determinó el efecto de LEF1 caída en la regulación de la invasión de células de cáncer de colon mediante el ensayo de invasión de Matrigel. Se han tratado las células con mitomicina C para eliminar la influencia del aumento de la proliferación. Los resultados mostraron que el número de células invasoras SW480-shLEF1 y células SW620-shLEF1 eran mucho más baja que la de las células SW480-SHNC y células SW620-SHNC (
P
& lt; 0,01; Figura 5A y 5B). Por otra parte, desmontables de expresión LEF1 podría disminuir significativamente los niveles de MMP-2 y la proteína MMP-9, pero no MMP-7 proteína en las células shLEF1 en comparación con la de las células de cáncer de colon SHNC (Figura 5C).
( A y B) ensayo de invasión de células tumorales. imágenes representativas de tinción, × 200. El análisis cuantitativo de las células tumorales invadido entre LEF1 desmontables y las células de control. Columnas, media (n = 3); bares, SD; **
P
& lt; 0,01 en comparación con las células de control SHNC. (C) Análisis de transferencia Western para MMP2, la proteína MMP-7 y MMP-9. β-actina se utilizó como control interno.
Desmontables expresión de LEF1 inhibió la actividad de RBP-jκ
Hasta la fecha, se han reportado varios estudios que vía Wnt y Notch controla la proliferación celular y cooperativamente tumorigénesis en los intestinos [18]. Para revelar los posibles puntos de convergencia y para aclarar el posible mecanismo por el cual LEF1 regula la proliferación y la tumorigénesis, hemos detectado la expresión de Notch dominio intracelular (INET) /RBP-jκ /Hes1 vía de los genes en estas células de cáncer de colon. No se encontró ninguna diferencia significativa en los niveles de expresión en las células INET cáncer de colon con diferentes tratamientos; sin embargo, los niveles de proteínas RBP-jκ y Hes1 se redujeron en células SW480-shLEF1 y células SW620-shLEF1 comparación con las células control (Figura 6A).
(A) análisis de transferencia de Western de NICD, RBP-jκ y la expresión Hes1. (B) Análisis de transferencia Western de la expresión LEF1 después de ser tratado con DAPT inhibidor de la vía Notch (100 M). β-actina se utilizó como control interno.
Nuestros datos no publicados mostraron un aumento de la actividad del promotor LEF1 de larga duración a co-transfección de cDNA en el INET SW480, HepG2, HEK293, A549 y células HeLa ; Por lo tanto, hemos utilizado DAPT, un inhibidor de la vía de Notch, para bloquear la expresión NICD en SW480 y las células SW620. Nuestros datos muestran que INET regulación a la baja afectada expresión de proteínas Hes1 y LEF1 (Figura 6B), lo que sugiere una regulación recíproca entre la vía Notch y LEF1.
Discusión
En el presente estudio, se analizó la primera LEF1 expresión de ARNm y proteína en muestras de tejido de cáncer de colon y luego se investigaron los efectos de LEF1 caída en la regulación de la viabilidad de las células tumorales cambiada, la distribución del ciclo celular, la apoptosis y la expresión de los genes
in vitro Opiniones y en xenoinjertos de ratones desnudos . Se encontró que los niveles de ARNm y proteínas LEF1 se incrementaron significativamente en los tejidos de cáncer de colon y asociados con la profundidad de infiltración, los ganglios linfáticos y metástasis a distancia y la supervivencia general más corta. LEF1 caída reduce la viabilidad de células tumorales, la capacidad de invasión y la expresión de MMP2 y MMP-9, pero la apoptosis inducida en células de cáncer de colon. LEF1 knockdown suprime la formación de tumores y el crecimiento en ratones desnudos. Por otra parte, la expresión de RBP-jκ y Hes1 se redujo en desmontables células Lef1. Estos datos sugieren que LEF1 podría evaluarse adicionalmente como un objetivo para la prevención y tratamiento del cáncer de colon.
Estudios anteriores demostraron que la expresión y activación de la proteína LEF1 contribuyeron al desarrollo del cáncer [10,13,19]. De hecho, nuestro estudio actual analizó la expresión de LEF1 ARNm y proteínas en el cáncer de colon y los tejidos de colon paratumorous y encontró que LEF1 se sobreexpresa en tejidos de cáncer de colon. Los niveles de expresión LEF1 se asociaron con la profundidad de infiltración, los ganglios linfáticos y metástasis a distancia, y estadios TNM avanzados de cáncer de colon así como una pobre tasa de supervivencia global en pacientes con cáncer de colon. Los últimos datos eran diferentes de los datos reportados por Kriegl, L et al [20], pero fueron similares a otro estudio anterior [21]. Estos datos sugieren que LEF1 puede ser un marcador útil para la predicción de la progresión del cáncer de colon.
Para comprender mejor el papel de la LEF-1 en el cáncer de colon, derribaron la expresión LEF1 en dos líneas celulares de cáncer de colon, SW480 y SW620. Hemos explorado el papel de LEF1 en el crecimiento del cáncer de colon. desorganización del ciclo celular se define como un inductor que conducen a la proliferación incontrolada celular y la progresión del cáncer, seguido de la tumorigénesis, por ejemplo, Shtutman et al identificaron que la ciclina D1 fue uno de los β-catenina /LEF1 genes diana complejos [22], encargada para la proliferación de células tumorales y la progresión del tumor. En consonancia con este estudio, nuestros datos actuales muestran que la regulación negativa de la proliferación celular LEF1 cáncer de colon, inhibió
in vitro fotos: por el aumento de la población sub-G1 apoptosis, prolongando la fase G0 /G1, y la reducción de la fase G2 /S en LEF1 derribado SW480 y SW620 células
in vitro Opiniones y en xenoinjertos de ratones desnudos, lo que confirmó otros dos estudios previos en endometrio humano y el cáncer de colon [9,23].
Además, nuestra actual estudio mostró que la sobreexpresión LEF1 en los tejidos de CRC primarias se asoció con metástasis a distancia de pacientes con CRC, lo que es consistente con varios estudios previos documentan que LEF1 se caracterizó como un biomarcador de cáncer de colon a la metástasis en el hígado [21]. De hecho, nuestros
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datos actuales confirman que desmontables de expresión LEF1 inhibe la capacidad de invasión de las células SW480 y SW620 en comparación con el control de las células transfectadas con shRNA. A nivel molecular, MMP2, MMP9 MMP7 y están asociados con el proceso de migración de células, que influyen en el desarrollo y progresión del cáncer [24,25]. Se encontró que el knockdown de la expresión LEF1 MMP2 suprimido y la expresión de MMP-9, pero no MMP-7, lo que indica que la modulación selectiva de MMPs por LEF1 podría tener la importancia biológica en la progresión del cáncer de colon. Por el contrario, LEF1 era capaz de regular MMP-7 expresión y la actividad en las células de cáncer de mama [26], mientras que otro estudio anterior mostró que circula MMP-2 y MMP-9 se podrían utilizar para potencialmente clasificar a los pacientes en riesgo bajo, alto riesgo, enfermedad benigna y cáncer de mama [24]. Sin embargo, nuestro ensayo de xenoinjerto de ratón desnudo no mostró ninguna metástasis tumoral tanto en el LEF-1 desmontables y los xenoinjertos de tumor de control; por lo tanto, se evidencia la necesidad de estudios adicionales.
Además, la vía de Notch se activa con frecuencia en diversos cánceres humanos, tales como cánceres de cerebro, glándulas mamarias, cuello uterino, pulmón, cabeza y cuello, colon, riñón, páncreas, y mieloide aguda [27,28]. La inhibición de las células tumorales inducidas vía de Notch a la apoptosis y proliferación de células tumorales en el cáncer colorrectal reducido [29]. Una publicación reciente mostró que la vía de Wnt era capaz de regular la vía de Notch [30]. La diafonía entre Notch y vías de Wnt puede estar parcialmente mediada por la regulación específica de la fosforilación de GSK-3β Notch-dependiente. La fosforilación de proteínas Notch ha sido indirectamente correlacionada con la activación de Notch y la translocación nuclear, así como la transformación celular. Además, Jagged1, uno de los ligandos de Notch, puede ser activado por ß-catenina durante la formación de folículo piloso ectópico en epidermis adultos [31].