Extracto
La adquisición de las células madre del cáncer abundantes y de alta pureza (CSC) es un requisito previo importante para la investigación CSC. En la actualidad, los investigadores suelen ganar los CAC de alta pureza a través de citometría de flujo clasificación y los amplíen mediante cultivo esfera corto plazo. Sin embargo, todavía no se sabe si se puede amplificar las CSC de alta pureza a través de la cultura esfera largo plazo. Hemos propuesto un modelo matemático utilizando ecuaciones diferenciales ordinarias para derivar la variación continua de la relación de CSC en la cultura esfera a largo plazo y estima los parámetros del modelo sobre la base de una cultura esfera a largo plazo de las células MCF-7 células madre. Se encontró que la relación de CSC en la cultura esfera largo plazo presenta como poco a poco disminuyó la deriva y podría ser estable en un nivel inferior. Por otra parte, se encontró que los parámetros del modelo empotrados podrían explicar el patrón de crecimiento de las células madre cancerosas principal y diferenciadas las células cancerosas en cultivo a largo plazo esfera
Visto:. Peng T, M Qinghua, Zhenning T, W Kaifa, Jun J ( 2011) largo Plazo Esfera la cultura no puede mantener una alta proporción de células madre del cáncer: un modelo matemático y el experimento. PLoS ONE 6 (11): e25518. doi: 10.1371 /journal.pone.0025518
Editor: Sui Huang, Instituto de Biología de Sistemas, Estados Unidos de América
Recibido: Abril 1, 2011; Aceptado: 7 Septiembre 2011; Publicado: 16 de noviembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Peng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La investigación fue apoyado por el Fondo Nacional de Ciencias Naturales de la República Popular de China (n. ° 30.872.517). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
En la última década, más y más evidencia ha demostrado que los tumores se originan a partir de una subpoblación de células que tienen las células auto-renovación y diferenciación de capacidad multidireccional, llamada madre del cáncer (CSC) o células iniciadoras de tumores (TIC) [ ,,,0],1] - [3]. Por otra parte, los CAC se han confirmado para ser el origen de la recurrencia del cáncer y la metástasis [4] - [6]. Por lo tanto, la investigación sobre células madre cancerosas se ha convertido en un punto focal de la investigación del cáncer.
La adquisición de abundantes células madre cancerosas de alta pureza es un requisito previo importante para la investigación CSC. En 2003, Al-Hajj y col. informó por primera vez de que sólo un pequeño grupo de células de cáncer de mama que tienen un CD44
+ CD24
- /baja fenotipo tiene la capacidad de sostener la formación de tumores [7]. Por lo tanto, las CSC de alta pureza se puede obtener a través de citometría de flujo de clasificación. Sin embargo, la baja proporción de células madre cancerosas entre las células cancerosas significa que difícilmente podemos obtener suficientes células madre cancerosas para experimentos adicionales inmediatamente después de la clasificación de citometría de flujo. Dario Ponti et al. demostrado que las células de cáncer de mama pueden formar mammospheres cuando se cultivan sin suero en placas adherentes y que este método podría enriquecer CD44
+ CD24
- /células madre cancerosas bajas de cáncer de mama [8]. Además, glioma, carcinoma colorrectal y otros tipos de células madre cancerosas se han cultivado usando el mismo método. Por lo tanto, los CAC se han ampliado a través de la cultura esfera [9] - [12]. Sin embargo, si la cultura esfera largo plazo puede mantener una alta proporción de células madre cancerosas no está claro.
simétrica y asimétrica división son dos tipos de patrones de crecimiento de células madre cancerosas [13], [14]. Una CSC puede dividir en cualquiera de dos CSC idénticas a través de la división simétrica o uno CSC y una célula de cáncer diferenciado a través de la división asimétrica. Por otra parte, las células cancerosas diferenciados pueden transformarse en células madre cancerosas a través de la transición epitelio-mesenquimal (EMT) [15]. Mientras tanto, las células cancerosas diferenciadas mezcladas con células madre cancerosas de citometría de flujo clasificación y derivados de la división asimétrica también proliferarán cuando se cultivan. Sin embargo, la influencia de los procesos mencionados en la relación de CSC en cultivo en suspensión sin suero es desconocida.
Para predecir la variación continua de la relación de CSC en la cultura esfera a largo plazo, que primero propuesto un modelo cinético utilizando diferencial ordinaria ecuaciones que consideran la división simétrica y asimétrica de células madre cancerosas, así como la proliferación y la transformación de las células de cáncer diferenciado. El análisis teórico mostró que no habría una relación estable de células madre cancerosas en una cultura esfera a largo plazo, dependiendo de los parámetros del modelo y relación inicial de células madre cancerosas. Para fundamentar nuestro resultado teórico, hemos diseñado una cultura esfera a largo plazo de las células MCF-7 de cáncer de mama humano madre. Sobre la base de los datos experimentales, utilizando un algoritmo adaptativo Metropolis-Hastings (M-H) para llevar a cabo un Monte-Carlo (MCMC) simulación extensa Markov de cadena, se obtuvieron los valores de los parámetros estimados. De acuerdo con las simulaciones numéricas basadas en datos experimentales, se encontró que la proporción observada de células madre cancerosas podría ser capturado por nuestro modelo y que los parámetros ajustados tenido un significado experimental.
Materiales y Métodos
Descripción del modelo
Dejado y denotar los tamaños de las poblaciones de células madre cancerosas y las células cancerosas diferenciadas en el tiempo
en la cultura esfera largo plazo, respectivamente. Debido a que las células se cultivan en un plato no adherente y hay suficientes nutrientes en este entorno artificial, podemos suponer que los cambios observados durante un corto intervalo de tiempo, dicen de longitud, son proporcionales a los tamaños de la población, es decir, donde se llaman las constantes la tasa neta de natalidad o la tasa intrínseca de crecimiento de la población, respectivamente. Vemos y como una función suave de. A continuación, dividiendo por y pasando al límite da las siguientes ecuaciones diferenciales:
Debido a que el patrón de crecimiento de células madre cancerosas incluye simétrica y asimétrica división [13], [14] y porque las células cancerosas diferenciadas pueden transformar en células madre cancerosas a través de ciertas modalidades , como EMT [15], surgirán algunas células cancerosas diferenciadas y células madre cancerosas durante la proliferación de las células madre cancerosas y las células cancerosas diferenciadas, respectivamente. Para simplificar el modelo, se define el proceso de división asimétrica que uno CSC se divide en un CSC y una célula de cáncer diferenciado de que el CSC primera divide simétricamente en dos células madre cancerosas y luego uno de ellos se convierte en una célula de cáncer diferenciado. Tomando como la tasa de conversión de células madre cancerosas a las células cancerosas diferenciadas en el proceso de la proliferación de CSC y como la tasa de conversión de las células de cáncer diferenciadas a células madre cancerosas en el proceso de proliferación de células cancerosas diferenciadas, podemos utilizar el siguiente modelo matemático para describir el crecimiento interactivo de las células madre cancerosas y las células cancerosas diferenciados en una cultura esferas largo plazo: (1) el lugar y todos los parámetros son constantes no negativas
Procedimiento experimental
cultivo de células
cáncer de mama humano MCF-7 células (de Shanghai Cell Bank, Academia de Ciencias de china) se cultivaron de forma adherente con medio DMEM (Hyclone), 10% de suero de ternera fetal (Hyclone) y 100 U de penicilina-estreptomicina /ml solución A. CD44
+ CD24
- /bajas de células madre cancerosas MCF-7 células se obtuvieron a través de citometría de flujo clasificación y se inocularon con 1000 células /ml en un sistema de cultivo de células madre para formar mammospheres como se describe anteriormente [8]. En platos no adherentes, células madre cancerosas se cultivaron en suspensión usando medio DMEM-F12 libre de suero (1:01, Hyclone) suplementado con 20 ng /ml EGF (BD Biosciences), 20 ng /ml de bFGF (BD Biosciences), 4 mg /ml B27 (Invitrogen) y penicilina-estreptomicina 100 U /ml de solución A. Las mammospheres se disociaron cada 10-12 días por digestión enzimática con 0,25% de solución de tripsina-EDTA (Invitrogen) a 37 ° C durante 3 minutos y la dispersión mecánica. Las células individuales fueron puestos en libertad por pipeteo suave y se filtró a través de un filtro de células de 70 micras. La suspensión de células se centrifugó a 500 g durante 3 min. Después de sobrenadante se desechó, las células individuales se inocularon con 1000 células /ml y se cultivan para formar mammospheres en las condiciones antes mencionadas.
citometría de flujo.
La citometría de flujo de clasificación y las pruebas se realizaron con BD FACSAria II FACS clasificador (BD Biosciences) para escoger CD44
+ CD24
- /low células madre cancerosas de las células MCF-7 células adherentes y detectar el CD44
+ CD24
- /baja relación de CSC en mammospheres. Las células adherentes o mammospheres se disociaron enzimáticamente y mecánicamente como se mencionó anteriormente y se filtraron a través de un tamiz de 40 micras para hacer suspensión de células individuales. Entonces, al menos 1 x 10
5 células se centrifugaron a 500 g durante 3 min a 4 ° C, se resuspendió en 10 l de conjugado con PE anti-CD44 (BD Biosciences) y 10 l de conjugado con FITC anti-CD24 (BD Biosciences), después se incubó a 4 ° C en la oscuridad durante 30 minutos. Mientras tanto, las células se incubaron, respectivamente, con isotipo de CD44 y CD24 como control negativo, y conjugado con PE anti-CD44 o conjugado con FITC anti-CD24 como control positivo solo, respectivamente. Las células marcadas se lavaron 3 veces y luego se analizaron por el clasificador FACS. Cada análisis detectó 10.000 células.
Resultados
Análisis teórico del Modelo (1)
En las matemáticas, la transformada de Laplace es un operador lineal de una función con un argumento real ( ), y se puede transformar a una función con un argumento complejo, que se define como. La transformada inversa de Laplace está dada por la integral compleja, donde es un número real, de modo que la ruta de contorno de integración se encuentra en la región de convergencia de. Desde la transformada de Laplace tiene la propiedad útil que muchas relaciones y operaciones más de los originales corresponden a relaciones más simples y operaciones sobre las imágenes, se puede utilizar para resolver diferencial y ecuaciones integrales. Dejar . La transformada de Laplace de las ecuaciones diferenciales (1) es (2) A partir de estas ecuaciones (2) después de algunos cálculos, obtainwhere son las raíces reales de la ecuación cuadrática de una variable.
Tomando el transformadas inversas de los cables de (3), que son las soluciones para el modelo (1).
Tenga en cuenta que y. Podemos obtainwhich significa que el porcentaje de células madre cancerosas en una cultura esfera a largo plazo tienden a ser de un tamaño estable. Nota thatUsing (3), tenemos (4) y (5) Porque (4) es más simple que, vamos a utilizar (4) para estimar los parámetros del modelo.
Vale la pena tener en cuenta que podemos obtener el estado estacionario de la relación por un método simple álgebra. Sin embargo, utilizando el método de álgebra, no podemos derivar los parámetros del modelo explícitas a nuestro conocimiento (véase el Apéndice S1). Por lo tanto, seguimos utilizando la transformación de Laplace aquí para hacer que todo el papel parece más concordante.
Resultados experimentales
La relación de CSC en células MCF-7 de cáncer de mama fue de 1,8% (Figura 1 A), que es consistente con el informe anterior [16]. Después de la clasificación de citometría de flujo, se realizó un análisis post-tipo para determinar la pureza de las poblaciones de células clasificadas. De gran pureza CD44
+ CD24
- /low células madre cancerosas cuya relación era tan alto como 96,2% fueron obtenidos (Figura 1B). CD44
+ CD24
- /bajas de células madre cancerosas MCF-7 células o células individuales de mammospheres formadas esferas compactas dentro de 10-12 días en cultivo en suspensión sin suero. Sin embargo, junto con el procesamiento de la cultura esfera a largo plazo, las relaciones de CSC observados en mammospheres presentados como poco a poco disminuyó la deriva (Figura 1B-G y en la Tabla 1) y finalmente se estabilizó en torno al 1,5%.
(A) El CSC relación en MCF-7 células cultivadas con suero. (B) La pureza de las poblaciones CSC según detectó después de citometría de flujo de clasificación inmediatamente. (C-G) La relación de CSC en mammospheres cultivaron durante 52, 84, 117, 150 y 160 días, respectivamente.
estimaciones basadas en modelos
Para el cálculo de la porcentaje de células madre cancerosas (Tabla 1), se determinó primero la relación de células de cáncer diferenciadas a células madre cancerosas (Tabla 1). Para estimar y, empleamos un algoritmo adaptativo Metropolis-Hastings (MH) para llevar a cabo una simulación extensa cadena de Markov Monte Carlo (MCMC) (Figura 2) descrita anteriormente [17], [18] y obtiene los valores estables para 4 parámetros (,,,). Por lo tanto, podemos concluir que las tasas de crecimiento intrínsecas de células madre cancerosas y las células cancerosas son diferenciadas y, respectivamente, y las tasas de conversión de células madre cancerosas a las células cancerosas diferenciadas y diferenciadas de las células cancerosas a los CAC son y, respectivamente.
( A) serie aleatoria; (B) de histograma. El algoritmo funcionó para 10.000 iteraciones con una quemadura-in de 3.000 iteraciones. Las condiciones iniciales eran
y
.
Uso de los valores estimados, que trazan la solución que mejor se ajusta mediante el ajuste de los datos experimentales (Figura 3A). Por otra parte, nos trazan la tendencia a largo plazo de, que mostró que la proporción de las células del cáncer diferenciado de células madre cancerosas se estabilizará alrededor de 71 días después de 200 (Figura 3B). Esto significa que el porcentaje de células madre cancerosas tenderá a ser 1,4%.
(A) El mejor ajuste de los datos experimentales. (B) La tendencia a largo plazo de.
Análisis de sensibilidad
Se utilizó coeficientes de sensibilidad locales (LSC) para medir la sensibilidad de los parámetros, incluyendo,, y. Como se informó anteriormente [19], [20], sabemos que la LSC se define como el grado de variación en la función de diseño en virtud de pequeños cambios de cada variable de diseño, que pueden calcularse por: (6) Debido a que cada parámetro tiene diferentes dimensiones , para comparar los coeficientes de sensibilidad de cada parámetro, estandarizamos (6) aswhere es el rango de cambio de parámetro
.
tomando la suma de cuadrados de las desviaciones (SSD) como la función de diseño y aumentando o disminuyendo 1% , 2%, 3%, 4% y 5% de cada parámetro, se obtuvo la correspondiente LSCs. Dado que hubo una LSC después de cada cambio de parámetro, había diez CEJ para cada parámetro. En consecuencia, la media y la desviación estándar de LSCs se calcularon para cada parámetro (Figura 4). Utilizó un modelo lineal se utilizó para comparar las diferencias, y se utilizó la prueba T2 de Tamhane para comparaciones múltiples debido a la desigualdad de la varianza. Sabemos que los medios de (± 716.5037 528.0119) y (± 925.3620 688.3240) son significativamente más grandes que los de (± 4,8421 73,4361) y (75,3665 13,7670 ±). Debido a que un coeficiente de sensibilidad más grande corresponde a un grado más alto de sensibilidad, se puede concluir que y, las tasas de crecimiento intrínsecos de células madre cancerosas y las células cancerosas diferenciadas, respectivamente, son los parámetros importantes para el porcentaje estable de células madre cancerosas en una cultura esfera a largo plazo.
Discusión
a pesar de que los investigadores suelen ganar los CAC de alta pureza a través de citometría de flujo clasificación y se expanden en el corto plazo por la cultura esfera en un ambiente no adherente sin suero [21], la el crecimiento de los patrones de células madre cancerosas y las células cancerosas diferenciadas en cultivo esfera a largo plazo en esta condición no es clara. Si podemos obtener abundantes células madre cancerosas de alta pureza a través de este método también es incierto. En este proyecto, primero se propone un modelo matemático para deducir la variación continua de la relación de CSC en la cultura esfera largo plazo. Para estimar los parámetros del modelo, que después se le asignó una cultura esfera a largo plazo de las células MCF-7 madre del cáncer de mama, ya que las células MCF-7 línea celular siguió el modelo CSC y su marcador de CSC, CD44
+ CD24
- /baja, fue confirmado en general y fácilmente detectado por citometría de flujo [7] - [8], [22]. A partir de los resultados de los experimentos y simulaciones numéricas, se encontró que la proporción de células madre cancerosas en cultivo a largo plazo esfera presenta como poco a poco disminuyó la deriva y podría ser estable en un nivel inferior. Por otra parte, en el contexto de los datos del modelo y de experimentación, se encontró que los parámetros del modelo empotrados podrían explicar el proceso de crecimiento principal de células madre cancerosas y las células cancerosas diferenciadas en cultivo esfera.
A partir de los parámetros ajustados en nuestro modelo, primero se dio cuenta de que la tasa de crecimiento intrínseca de las células cancerosas diferenciadas es mayor que la tasa de crecimiento intrínseca de las CSC, lo que significa que, si bien se cultivaron en un entorno no adherente sin células de cáncer en suero diferenciado también proliferarán y su velocidad de crecimiento es ligeramente más rápido que la de células madre cancerosas. Sin embargo, la diferencia entre sus tasas de proliferación cuando se cultivan en esta condición es mucho menor que en cultivo adherente. Esta es la principal causa de la relación persistente disminución de los CAC. Mientras tanto, este resultado y el aumento progresivo de la proporción de las células cancerosas diferenciadas también pueden explicar por qué la actividad proliferativa de las esferas aumenta en las etapas de subcultivo muy tarde en comparación con pasajes anteriores [23]. Mientras tanto, la tasa de crecimiento intrínseca de los CAC,, es aproximadamente 20 veces mayor que la tasa de conversión de células madre cancerosas a las células cancerosas diferenciadas, lo que indica que en esta condición de cultivo el patrón de proliferación principal de células madre cancerosas es la división simétrica en lugar de división asimétrica o diferenciación en un entorno de cultivo adherente con suero [8] - [10], [23]. Este resultado conduce a una mayor proporción de células madre cancerosas por un largo tiempo comparativa en este cultivo. Además, debido a que la tasa de conversión de células madre cancerosas a las células cancerosas diferenciadas,, es casi 10 veces mayor que la tasa de conversión de las células cancerosas diferenciadas a células madre cancerosas,, esto significa que la división asimétrica de células madre cancerosas es mayor que la transformación de las células de cáncer diferenciadas para los CCC en esta condición de cultivo, que también es compatible con el bajo porcentaje de células madre cancerosas en la cultura esfera largo plazo. Además, aunque la tasa de conversión de las células cancerosas diferenciadas a células madre cancerosas, es pequeña, su existencia indica que en esta cultura de condición diferenciada células cancerosas todavía puede convertir espontáneamente en células madre cancerosas, lo cual es consistente con los resultados experimentales anteriores [24], y pueden estar una razón importante por la cultura esfera puede enriquecer células madre cancerosas [8].
a partir de nuestra investigación, incluyendo los datos experimentales y el análisis teórico del modelo matemático, se encontró que a pesar de las CSC eran cultivadas en un entorno no adherente sin suero , hubo una deriva del estado CSC hacia un estado de equilibrio aparente en los que había menos células madre cancerosas que en la siembra. Este resultado podría ser una evidencia de heterogeneidad no genética en los tumores, porque no había alteración genética artificialmente en todo el proceso de cultivo [25]. Para obtener abundantes células madre cancerosas de alta pureza por la cultura esfera en base a la expresión de una relación límite de las células cancerosas diferenciadas y células madre cancerosas en (5), sugerimos las siguientes medidas reglamentarias: obtener una relación inicial más alto de células madre cancerosas, lo que inhibe la diferenciación o división asimétrica de células madre cancerosas y promover la conversión de las células cancerosas diferenciadas a células madre cancerosas, tales como cultivando con TGF-β para impulsar la EMT [15], [26].
Tenga en cuenta que la estimación de parámetros de este modelo matemático se basaba únicamente nuestros ensayos de datos línea celular de cáncer de mama MCF-7 experimental de células madre cancerosas, que se cultivaron como se mammospheres. Por lo tanto, aunque el modelo podría ser aplicable para la predicción de la variación continua de la relación de CSC en casi cada tipo de tumor sólido CSC cultura esfera, los parámetros no se pueden aplicar extensamente debido a las diversas características de diferentes tumores. Mientras tanto, esta investigación que acabamos de analizar el proceso de cultivo de células madre cancerosas de alta pureza como esferas. Sin embargo, el procedimiento para el enriquecimiento de células madre cancerosas mediante cultivo esferas podría ser diferente. En otro procedimiento, una gran cantidad de células de cáncer diferenciadas se sometería a la apoptosis en las primeras etapas, debido a la inadaptación a la condición de cultivo en suspensión. Sin embargo, en nuestra condición, la adaptación al medio de cultivo en suspensión podría ser la razón por la cual las células cancerosas aumentan gradualmente diferenciadas [22]. Por lo tanto, los parámetros que describen el proceso de enriquecimiento de células madre cancerosas también serían distintas en comparación con el presente documento. Por otra parte, a pesar de nuestro modelo simplificado era válido para capturar el patrón de crecimiento y la transición de la cultura células madre cancerosas (es decir, revelar el mecanismo de la heterogeneidad estructural de las células cancerosas), sistema dinámico más complicado (por ejemplo, tasas de número de células de crecimiento /dependiente de la densidad y de conversión) podrían ser factible adaptar estos últimos descubrimientos de los CAC [24], [27] - [28]. Nos gustaría estudiar estos parámetros y modelos alternativos futher en el trabajo futuro.
Apoyo a la Información
Apéndice S1.
declaraciones del método de álgebra para calcular la constante-stete de relación.
doi: 10.1371 /journal.pone.0025518.s001 gratis (DOC)
Reconocimientos
Estamos muy agradecidos a dos árbitros anónimos y el editor académico para un estudio cuidadoso y valioso los comentarios que dieron lugar a la mejora de nuestro manuscrito original. Los autores desean agradecer a Zhao Bin (profesor asociado, editor de Inglés de Chinese Journal of Breast Disease), Yu Shicang y Bin Wang (MD del Instituto de Patología, Hospital del Suroeste, Tercera Universidad Médica Militar, República Popular de China) para la lectura crítica de la manuscrito y la amabilidad de dar valiosos consejos.