Extracto
fijados con formol y tejido humano embebido en parafina resecado durante la cirugía del cáncer es indispensable para fines diagnósticos y terapéuticos y representa un vasto y un recurso sin explotar para la investigación. La microscopía óptica de dicha muestra está restringida por la resolución de difracción limitada de la microscopía óptica convencional. Para superar esta limitación, se utilizó STED super-resolución microscopía permitiendo resolución óptica muy por debajo de la barrera de difracción. Hemos visualizado distribuciones de proteínas a nanoescala en las secciones de tejido humano embebido en parafina bien anotado cáncer rectal almacenada en un repositorio clínico. Utilizando antisueros contra varias proteínas mitocondriales, STED microscopía reveló distintas distribuciones de proteína sub-mitocondrial, lo que sugiere un alto nivel de preservación estructural. El análisis de tejidos humanos almacenados durante hasta 17 años demostró que estas muestras eran todavía susceptibles de super-resolución de la microscopía. La microscopía STED de las secciones de HER2 adenocarcinoma de recto positivo reveló detalles en la superficie y distribución de HER2 intracelular que fueron borrosa en las imágenes convencionales correspondientes, lo que demuestra el potencial de super-resolución de la microscopía para explorar el régimen nanoescala hasta ahora en gran parte sin explotar en los tejidos almacenados en biorepositories.
Visto: Ilgen P, S Stoldt, Conradi LC, CA Wurm, Rüschoff J, Ghadimi BM, et al. (2014) STED Super-Resolución de Microscopía de tejido de cáncer rectal humano embebido en parafina clínica. PLoS ONE 9 (7): e101563. doi: 10.1371 /journal.pone.0101563
Editor: Anthony W.I. Lo, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 12 Marzo, 2014; Aceptado: June 9, 2014; Publicado: July 15, 2014
Derechos de Autor © 2014 Ilgen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos se incluyen dentro del papel
Financiación:. Parte del trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft a través del Cluster de Excelencia "nanoescala Microscopía y Fisiología Molecular del Cerebro" y el proyecto de la UE IMAGINT (Salud-F5 -2.011-259.881) (ambos a SJ), así como a través de la KFO179 "Bases biológicas de la respuesta tumoral individual en pacientes con cáncer rectal." los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
se estima que el número de muestras de tejidos humanos almacenados en biorepositories (clínicos). en más de 300 millones de dólares que ya hace 15 años en los EE.UU. [1], [2]. Muchas de estas muestras han sido fijados con formalina y embebidos en parafina, un método de conservación clínica estándar que está en uso durante más de un siglo. En muchos contextos clínicos, tejido tomado de los pacientes de cáncer durante la cirugía oncológica se almacena en bloques de parafina para el diagnóstico, decisión sobre las estrategias de tratamiento postoperatorio y los estudios de seguimiento, lo que representa un recurso vasto y valioso para el estudio de la patología y la base funcional de muchos tumores malignos.
Para los análisis, el tejido incluido en parafina almacenada y anotada puede seccionarse, elimina la cera, y luego teñidas imágenes de microscopía de luz convencional. En la microscopía clásica (fluorescencia) la resolución alcanzable está limitado por difracción a aproximadamente 250 nm, lo que restringe la información extraíble de un espécimen. En la última década, varias técnicas de microscopía de super-resolución (nanoscopía) han sido desarrollados que permitan superar fundamentalmente el límite de difracción, lo que permite la microscopía de campo lejano con una resolución sustancialmente mejorada [3] - [5].
de estas técnicas, el agotamiento de la emisión estimulada (STED) microscopía se destaca como un enfoque que puede utilizarse en conjunción con muestras inmunomarcadas y que no requiere esfuerzos computacionales para generar la imagen final [6], [7]. En la microscopía STED, un patrón de luz se utiliza para inhibir la fluorescencia a la muestra bien definido coordina de tal manera que las características adyacentes emiten secuencialmente. La inhibición de la fluorescencia se logra mediante la emisión estimulada de fluoróforos excitados al estado fundamental. En una implementación típica microscopía STED los fluoróforos situados en el borde exterior de un punto focal de barrido de luz de excitación se transitoriamente apagados por de-excitación a través de la emisión estimulada con un STED de haz en forma de rosquilla con un cero central. Como consecuencia, sólo fluoróforos en un enfoque eficaz con un diámetro de son capaces de emitir fluorescencia. Aquí,
λ es la longitud de onda
,
I
s
es una característica del fluoróforo, y
I
max
indica la intensidad de la envolvente de pico el cero. Para
I
max
/
I
s Hotel & gt; & gt; 1, el enfoque efectivo es mucho menor que el límite de difracción. Como consecuencia de ello, a diferencia de los microscopios ópticos basados en lentes convencionales, la resolución ya no está limitada por la longitud de onda.
STED microscopía por lo tanto, se presta como una poderosa herramienta para abrir el régimen de nanoescala hasta ahora en gran parte sin explotar en archivado material de tejido humano. Anteriormente, diversas técnicas de super-resolución se han utilizado para localizaciones de proteínas imagen en secciones vibratome químicamente fijos o secciones de criostato de ratón o rata tejidos [8] - [10], así como en secciones de tejidos de plástico incrustado de roedores que expresan las proteínas fluorescentes como etiquetas [11], [12]. STED microscopía también se ha utilizado para el tejido imagen viva [13] - [15]. Ninguno de estos enfoques podría ser inmediatamente transferido a procedimientos clínicos establecidos que requieren procedimientos estandarizados y la posibilidad de que el almacenamiento de muestras a largo plazo.
Para investigar si la microscopía STED puede utilizarse para visualizar las distribuciones de proteínas en tejido incluido en parafina, se usada archivado el tejido del cáncer de recto que había sido extirpado durante la escisión total del mesorrecto (TME-cirugía) estandarizado y se almacenó a temperatura ambiente durante un máximo de 17 años en un repositorio de patología clínica. Este tejido fue elegido para este estudio debido a una incidencia creciente de forma continua, el cáncer colorrectal se ha convertido en uno de los tres tipos de cáncer más frecuentes en el mundo occidental [16]. Un tercio de los cánceres colorrectales son cánceres rectales y, a pesar de los avances en el diagnóstico y tratamiento multimodal utilizando preoperatoria (neoadyuvante) quimiorradioterapia seguida por oncológica TME-cirugía prolongada, el pronóstico a largo plazo de los pacientes con cáncer de recto localmente avanzado está limitada por la aparición de metástasis distantes en casi 30% de los pacientes [17] - [19]
la desregulación de la señalización a través del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (HER; también conocido como ERBB) la familia de proteínas tiene un papel complejo en. la patogénesis de numerosos cánceres humanos [20]. Recientemente, se ha demostrado que se sobreexpresa HER2 en ~ 30% de adenocarcinoma de recto localmente avanzado primaria, clínicamente por etapas como la Unión Internacional para el Control del Cáncer (UICC) etapas II y III [21]. Poco se sabe sobre la localización subcelular de HER2 en los tejidos tumorales.
En este manuscrito se determinó la viabilidad de visualizar la distribución a nanoescala de HER2 y otras proteínas usando microscopía STED de super-resolución en el tejido del cáncer rectal archivado. Se demuestra que incluso los tejidos almacenados durante más de una década en un repositorio clínico son susceptibles de formación de imágenes STED super-resolución.
Resultados
microscopía de fluorescencia de secciones delgadas
HER2 positivo tejido de carcinoma rectal, archivado después de la fijación con formalina y parafina-empotramiento, se seccionó en 2 micras rodajas gruesas. Las secciones de tejido se dewaxed y tratamiento térmico durante 45 min para la recuperación de antígenos [22]. Después de esto, las secciones fueron teñidas con DAPI para resaltar los núcleos y decoradas con antisueros contra la proteína de membrana integral HER2 y contra la proteína de membrana externa mitocondrial Tom20, una proteína esencial se expresa en todas las células humanas. La microscopía confocal demostró la fuerte expresión de HER2 en el tejido tumoral, mientras que las células del estroma circundantes normales no expresan una cantidad correspondiente de HER2 (Figura 1). masa mitocondrial fue mayor en las células malignas y, como consecuencia Tom20 fue más abundante, aunque, como se esperaba, las señales Tom20 también fueron detectables en las células del estroma normales. También la señal DAPI era reconocible tanto en las células cancerosas y tejido normal. Llegamos a la conclusión de que el etiquetado multi-color de inmunofluorescencia y microscopía confocal es factible en tejido incluido en parafina clínica rutinaria procesado archivados.
Confocal imagen de la descripción de una región de una sección de tejido de cáncer rectal positivo HER2 marcado con DAPI (azul) a resaltar los núcleos y decorado con antisueros frente a Tom20 (fuego) y HER2 (verde). (A) de superposición, (B) Tom20, y (C) HER2. Las barras de escala:. 25 micras
preservación estructural a escala nanométrica
La resolución óptica de microscopía confocal convencional está limitada por la difracción de ~ 200 nm en el plano axial, a menudo ocultando información valiosa . tejidos incluidos en parafina supuestamente muestran autofluorescencia pronunciado [23] y, a pesar de la conservación estructural posible de tejido incluido en parafina es suficiente para microscopía de luz convencional (Figura 1; [24]), tejidos archivados pueden no ser adecuados para satisfacer las altas exigencias de difracción ilimitada de super-resolución microscopía. Para investigar si el tejido incluido en parafina almacenada de forma rutinaria procesado clínico en humanos es adecuado para microscopía STED, se decidió analizar las distribuciones de proteínas sub-mitocondrial en las mitocondrias. Estos orgánulos son un reto para las estructuras celulares de super-resolución microscopía debido a su pequeño tamaño, su compleja arquitectura organellar interior y el muy denso empaquetamiento de las proteínas en las membranas mitocondriales [25]. Con este fin, se utilizó el tejido de cáncer rectal embebido en parafina que se almacenó durante aproximadamente 1 año a temperatura ambiente en un archivo patología clínica. Las secciones de tejido que contienen una sección longitudinal de la capa muscular circular interior del recto (
muscular externa
) fueron decorados con antisueros frente a cuatro diferentes proteínas mitocondriales: Tom20, un receptor periférico de la translocasa TOM en la membrana externa mitocondrial; Mic60 (mitofilin), un componente del complejo MINOS localizada preferentemente en las uniones sus crestas en la membrana interna; aconitasa, una enzima de la matriz del ciclo del ácido tricarboxílico catalizar la isomerización de citrato a isocitrato; y ciclofilina D, una isomerasa peptidylprolyl localizada en la matriz mitocondrial.
La mitocondria en los
muscular externa
formar grandes túbulos alargados. Cuando los bloques de tejido se cortan a lo largo del eje longitudinal de la muestra de rectales resecados, la mayoría de los orgánulos se extendió dentro de la sección plana (Figura 2A). A través de una imagen grande STED de tamaño de 120 micras x 100 micras, Tom20 mostró una localización punctata distinto dentro de la mitocondria (Figura 2), que está totalmente de acuerdo con estudios anteriores que utilizan diversas formas de super-resolución de la microscopía en células de mamífero en cultivo [26] , [27]. La resolución alcanzada, como se determina en el fondo-clusters, fue consistentemente ~ 40 nm a lo largo de las secciones de tejido registrados (Figura S1). Mientras que en las grabaciones correspondientes confocal las distribuciones de Tom20, Mic60, aconitasa y la ciclofilina D eran prácticamente indistinguibles, la resolución más alta proporcionada por el microscopio STED demostró diferencias en las distribuciones de sub-mitocondriales de las proteínas respectivas (Figura 2B-E). Tom20, aconitasa y la ciclofilina D se encuentra generalmente en grupos distribuidos de manera uniforme, aunque en diferentes cantidades. Secciones decoradas con un antisuero contra la ciclofilina D exhiben la agrupación más denso (Figura 2E), mientras que un antisuero contra la aconitasa resultó en el etiquetado de los grupos dispersos (Figura 2D). Como se muestra previamente para Mic60 en células cultivadas [28], esta proteína parece tener también una distribución más ordenada en el tejido humano (Figura 2C). La distribución general sub-mitocondrial de las proteínas respectivas en el tejido era comparable a la localización observada en células humanas cultivadas (Figura S2).
STED grabaciones se realizaron en 2 micras secciones desparafinados gruesas cortadas a lo largo del eje longitudinal de el recto. (A) Izquierda: STED imagen de la descripción de una región de la capa circular interna de la rectal
muscular externa
decorado con un antisuero contra Tom20. Derecha: Aumentos de las áreas en las plazas de trazos indican que muestran la distribución de las agrupaciones TOM dentro de la mitocondria. (B-E) imágenes STED de secciones de tejido decoradas con antisueros contra Tom20 (B), Mic60 (mitofilin) (C), de la aconitasa (D), y la ciclofilina D (E). En cada panel de la imagen confocal STED correspondiente (arriba, izquierda) y (arriba, derecha) se muestra. En pocas palabras: la ampliación de la imagen STED según lo indicado por un cuadrado de trazos. Tenga en cuenta las diferentes distribuciones de los cuatro proteínas dentro de la mitocondria. Barras de escala: 20 micras (A, izquierda); 1 m (A, derecha) y (B-E, arriba); 200 nm (B-E, abajo).
En conjunto, estos datos sugieren una conservación estructural suficiente de la rutina clínica de tejido incluido en parafina calificarlo para su uso en STED super-resolución de la microscopía.
STED super-resolución de la microscopía de HER2 etiquetado tejido cáncer rectal
con el fin de evaluar el beneficio de la microscopía STED sobre microscopía convencional, visualizamos la distribución de HER2 en secciones de tejido de cáncer de recto que se calificó como HER2 -positivo basado en inmunoquímica y la hibridación in situ [21], [29]. Tres 2 micras de espesor secciones consecutivas del tejido incluido en parafina se cortaron y tratados de la misma para el desparafinado y la recuperación de antígeno. Las tres secciones cubren la misma región, lo que permite la comparación directa de las propiedades de los diferentes procedimientos de tinción. La primera sección se tiñó por un procedimiento clínico estándar de hematoxilina-eosina (HE). Como resultado, los núcleos se tiñeron de azul, mientras que el citoplasma y la matriz extracelular aparecieron en varios tonos de rosa (Figura 3A). Las otras dos secciones fueron decorados con un antisuero contra HER2, pero con diferentes anticuerpos secundarios. Para la inmunohistoquímica estándar, se utilizó un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa, que cataliza la oxidación de 3, 3'-diaminobencidina, dando como resultado un precipitado marrón (Figura 3B). Para la microscopía de fluorescencia, los anticuerpos secundarios marcados con el colorante fluorescente roja KK114 [30] se utilizaron (Figura 3C).
Tenga en cuenta que las tres secciones consecutivas cubren la misma región en el tejido. Las imágenes fueron tomadas con campo amplio de difracción limitada (A, B) o microscopía confocal (C). (D, H) y (E, I): aumentos correspondientes de (B) y (C), respectivamente, en los sitios indicados por las flechas. (F, G, J, K): comparación de difracción limitada microscopía confocal con STED super-resolución microscopía en tejido tumoral almacenado seccionada. Se muestran los aumentos de las áreas indicadas por las plazas de trazos. esquinas superior derecha: imagen confocal. zona inferior izquierda: imagen STED. Las flechas señalan las estructuras de vesículas como HER2 positivos que se resuelven en las imágenes STED. Las barras de escala: 1 mm. (A-C), 50 micras (D, E, H, I), 2 micras (F, J) y 500 nm (G, K) guía empresas
La tinción HE ofrece una visión general de los tejidos, mientras que las imágenes de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia muestran expresión de HER2 fuerte en las células tumorales, pero no en el tejido de estroma no maligno circundante. A continuación, se comparó la tinción inmunohistoquímica con el etiquetado de inmunofluorescencia según lo registrado por confocal y microscopía STED (Figura 3B-K). Con este fin, se seleccionaron las regiones correspondientes de las dos secciones de tejido marcados de forma diferente. Considerando que las imágenes confocales de la inmunofluorescencia etiquetado proporcionan un mayor contraste y las membranas se delinean más bruscamente como en las imágenes de la tinción inmunohistoquímica, el contenido total de información aparece comparable (Figura 3D, E, H, I). Presumiblemente, la imagen aparece nítida inmunofluorescencia, porque en caso de inmunohistoquímica la resolución alcanzable es limitada en última instancia por la difusión del precipitado marrón. Ambos enfoques demuestran que HER2 se encuentra predominantemente en la membrana plasmática de las células de cáncer rectal. La microscopía STED permite la visualización de detalles adicionales, que están oscurecidas en las imágenes confocal de difracción limitada (Figura 3F, G, J, K; Figura S3). La imagen muestra claramente STED ~450 estructuras nm de tamaño HER2 positivos vesículas similares, que puedan deberse a la internalización de HER2. Las imágenes STED incluso sugieren la existencia de grupos de proteínas HER2 individuales, que están completamente ocultos en las imágenes convencionales de difracción limitada.
Llegamos a la conclusión de que la distribución subcelular de HER2 puede ser visualizado en las secciones de parafina archivado clínica -embedded tejidos de cáncer rectal. STED microscopia revela detalles estructurales, incluyendo las estructuras vesiculares-como HER2 positivos en el material almacenado que se han difuminado utilizando microscopía de luz convencional del estado de la técnica.
STED super-resolución de la microscopía de material clínico archivado después de un largo almacenamiento -term
el potencial de super-resolución microscopía de tejido incluido en parafina sólo puede ser explorado ampliamente si el método podría ser utilizado en muestras clínicas estándar, ya que se almacenan en numerosos archivos clínicos en todo el mundo. Para determinar la influencia del almacenamiento prolongado en la usabilidad del tejido archivado para microscopía STED, se utilizó incluido en parafina, tejidos de cáncer de recto que fueron almacenados a temperatura ambiente en un archivo de patología clínica habitual durante un máximo de 17 años. Los tejidos incluidos en parafina se trataron previamente como antes y se marcaron con anticuerpos contra la proteína mitocondrial Tom20 (Figura 4). Hemos encontrado que incluso los 17 años de edad tejido podría ser utilizado para el marcaje de inmunofluorescencia, aunque con el aumento de almacenamiento de tiempo el brillo de las secciones marcadas se redujo, presumiblemente refleja una disminución de epítopos accesibles en las muestras envejecidas. Sorprendentemente, incluso en la muestra de tejido mayor, racimos Tom20 individuales podrían ser resueltos por STED microscopía, que no fueron discernibles en las respectivas imágenes confocales de difracción limitada correspondientes, evidenciando que incluso décadas tejidos humanos embebidos en parafina son susceptibles para STED super-resolución microscopía.
imágenes representativas de los tejidos tumorales almacenados a temperatura ambiente durante menos de 1 año (a), 11 años (B) o 17 años (C), se seccionaron, desparafinado, decorado con un antisuero contra Tom20 y fotografiado. Izquierda: confocal de imágenes representativas. La misma tabla de colores se utilizó para las tres imágenes con el fin de visualizar las eficiencias de tinción relativas. Medio /Derecha: Comparación de STED (centro) y confocal (derecha) microscopia de secciones de tejido de diferentes edades. Aquí, las tablas de color se ajustaron a las intensidades de señal obtenidos. Las barras de escala: 10 m. (izquierda) y 1 m (media, a la derecha) guía empresas
Discusión
El tejido canceroso extirpado durante la cirugía oncológica es muy importante para el diagnóstico. Para el análisis de rutina, los niveles de expresión de proteínas clave específicas se determinan generalmente en el tumor o el nivel celular. Las proteínas, sin embargo, ejecutar sus funciones de forma local, y por lo tanto la distribución a nanoescala de proteínas clave podrían contener firmas valiosos, que no han sido considerados hasta ahora para el diagnóstico clínico. En este estudio se muestra que STED microscopía de super-resolución es adecuado para revelar las distribuciones de proteínas a nanoescala en los tejidos almacenados durante décadas en biorepositories, abriendo así la nanoescala en estas muestras.
Hay una cantidad enorme y de rápido crecimiento de muestras de tejidos almacenados en diversos bancos de datos genéticos. la calidad de muestras biológicas se considera como un problema crítico [2], [31] y la calidad de la muestra también será fundamental para los datos que se pueden extraer de super-resolución de la microscopía. No obstante, debido a limitaciones prácticas, la conservación estructural de la pieza resecada durante la cirugía de rutina es poco probable que tenga el nivel de calidad que se puede lograr en condiciones de laboratorio estrictamente controladas. Hay un mayor potencial, aunque presumiblemente superable, desafíos, incluyendo la calidad y la disponibilidad de anticuerpos adecuados y el desafío para combinar los datos de imagen con, por ejemplo, las firmas metabólicas de las muestras. Nuestra idea es que los futuros desarrollos en el campo de super-resolución, incluyendo la paralelización de adquisición de imágenes [32], [33], así como el análisis de imágenes automatizado permitirá el análisis a gran escala de tejidos biobanked utilizando técnicas STED y otros super-resolución.
Materiales y Métodos
ética Declaración
el estudio fue aprobado por el comité de ética médica de la Universidad de Göttingen (28 de junio de 2006;#9/8/08). El origen de las muestras específicos utilizados en este estudio se ha descrito en una publicación anterior [21].
La fijación del tejido y la incrustación de
tejido resecado recién se fijó en 4,5% de formalina tamponada (Th. Geyer, Renningen, Alemania) a temperatura ambiente durante 12 a 24 h. El tejido fijado se incorpora automáticamente en parafina (Süsse Labortechnik, Gudensberg, Alemania), utilizando un procesador de tejido (Leica ASP 300; Leica Biosystems, Wetzlar, Alemania). Los bloques de parafina se almacenaron en la oscuridad a temperatura ambiente.
Preparación de las placas de tejido
Los bloques de parafina se enfriaron hasta -10 ° C en una placa de refrigeración (PFM Medical AG, Colonia, Alemania ). Los bloques de parafina enfriados se cortaron en 2 micras secciones de tejido de espesor en un microtomo (HM 430, MICROM Internacionales, Walldorf, Alemania) y se transfirieron con un cepillo en agua a temperatura ambiente antes de ser montado en portaobjetos de vidrio. Para estirar las muestras de tejido seccionados, los portaobjetos de vidrio se colocaron en una mesa de calentamiento (MEDAX, Kiel, Alemania) a 37 ° C y se secaron en una incubadora de calentamiento a 37 ° C durante la noche.
desparafinado
Los portaobjetos secos se desparafinaron con xilol (2 × 8 min) seguido de una serie de descender las concentraciones de alcohol (2 × 2 min 100% de EtOH, 2 × 2 min 96% de EtOH, 1 × 2 min 75% de EtOH) y finalmente enjuagado 3 veces en agua.
inmunohistoquímica automatizada
estandarizado tinción inmunohistoquímica se realizó en un punto de referencia Ventana XT Immunostainer (Ventana, Ventana Medical Systems, Mannheim, Alemania). Uso de la immunostainer, la recuperación del epítopo de calor se realiza de forma automática en las secciones de tejido en CC1 (Cell acondicionado 1 solución, Ventana Medical Systems, Mannheim, Alemania) Tampón de 60 min a 100 ° C. Posteriormente, las secciones de tejido se incubaron de forma automática con la vía anti-HER-2 /neu (4B5) anticuerpo monoclonal de conejo a 37 ° C durante 32 min. A continuación, las secciones fueron decorados con anticuerpos secundarios acoplados a peroxidasa de rábano picante y teñidas con 3,3 'diaminobencidina (DAB Kit de Detección ultraView universal; Ventana Medical Systems, Mannheim, Alemania). Como contratinción, se utilizó el reactivo de contraste hematoxilina II (Ventana Medical Systems, Mannheim, Alemania) para teñir los núcleos. Por último, los portaobjetos se deshidrataron objeto manualmente en una serie de concentraciones ascendentes alcohólicas (2 × 1 min 75% de EtOH, 2 × 1 min 96% de EtOH, 2 × 1 min 100% EtOH) con una incubación final de 2 min en xilol. Los portaobjetos se montaron en Vitro-Clud (Langenbrinck, Labor- und Medizintechnik, Emmending, Alemania). Este método se utilizó para la Figura 3B, D, H.
hematoxilina Manual y eosina (HE) tinción
HE tinción se realizó en secciones de tejido desparafinados. Las diapositivas de tejidos se enjuagan en agua y luego se sumergieron en una solución hemalum (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania) durante 10 minutos. Para permitir el desarrollo del color azul de los núcleos teñidos, los portaobjetos de tejidos se enjuagaron en agua del grifo durante 10 minutos. Posteriormente, las muestras se contratiñeron durante 30 segundos en una solución de eosina (1% de eosina en 37,5% de EtOH, Merck Millipore), se enjuagaron en pura H
2O y se deshidrataron en una serie de ascendente concentraciones alcohólicas (2 × 1 min 75% EtOH, 2 x 1 min EtOH al 96%, 2 x 1 min 100% EtOH) con un final de incubación de 2 min en xilol. Los portaobjetos se montaron en Vitro-Clud (Langenbrinck, Labor- und Medizintechnik, Emmending, Alemania). Este método fue utilizado para la Figura 3A.
Manual de recuperación de antígeno
Las secciones fueron transferidos a una cámara de diapositivas, sumergida en una solución CC1 (Cell acondicionado 1 solución, Ventana Medical Systems, Mannheim, Alemania) y después se calentó durante 45-60 minutos a 100 ° C en un barco de vapor (Multi Gourmet además, Braun, Kronberg, Alemania). Después de enfriar durante 20 min, los portaobjetos se enjuagaron en agua.
immunolabeling Manual
Las secciones se bloquearon con 5% o 10% (peso /volumen) de BSA en PBS (NaCl 137 mM, 3 mM KCl, Na 8 mM
2HPO
4, KH 1,5 mM
2 PO
4, pH 7,4) durante 5 min y se incubaron durante 1 h con la vía de anticuerpo monoclonal primario de conejo anti-HER-2 /neu (4B5) (Ventana Medical Systems, Mannheim, Alemania; Número de catálogo: 790-2991) (dilución: 1: 50), los anticuerpos policlonales de conejo contra Tom20 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, EE.UU., sc-11415) (dilución: 1:200), anticuerpos policlonales de conejo contra Mic60 /mitofilin (Abcam, Cambridge, Reino Unido; ab48139) (dilución: 1:200), anticuerpos policlonales de conejo dirigidos contra aconitasa (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos; HPA001097) (dilución: 1:400), o anticuerpos monoclonales contra la ciclofilina D (también denominada ciclofilina 3 o ciclofilina F; Abcam, Cambridge, Reino Unido; ab110324) (dilución: 1:400), respectivamente, a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios se detectaron con anticuerpos secundarios (de oveja anti-ratón o de cabra anti-conejo; Jackson ImmunoResearch Laboratories) etiquetados de encargo con el colorante emisor de rojo KK114 [30] (dilución: 1:200) o un anticuerpo secundario (anti-ratón de oveja ; Dianova, Hamburgo, Alemania) etiquetado personalizado con el tinte amarillo que emite Atto532 (ATTO-TEC, Siegen, Alemania) (dilución: 1:100). Después de inmunomarcaje, las muestras de tejido se montaron en Mowiol suplementado con 0,1% (peso /vol) DABCO (1,4-diazabiciclo [2.2.2] octano; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) y 2,5 g /ml DAPI (4 ', 6-diamino-2-fenilindol; Sigma-Aldrich).
Microscopía
Todas las imágenes que se muestran representan imágenes representativas. Se analizaron las secciones de más de 10 bloques de parafina diferentes, proporcionando persistentemente resultados similares. Las secciones de inmunohistoquímica manchadas y del tejido teñido con HE se obtuvieron imágenes con una Imager Axio 2 equipado con un Axio-Cam RMC (Zeiss, Jena, Alemania). Para la microscopía confocal, se utilizó un microscopio Leica TCS SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania). Para la microscopía confocal STED y la correspondiente, se utilizó un microscopio STED hecha a la medida [26], [34]. Se consiguió una resolución de ~ 250 nm de las imágenes confocal y de ~ 40 nm en las imágenes STED. La resolución se determinó mediante la medición de la anchura total a la mitad del máximo (FWHM) en el X y el eje y en más de 100 grupos de fondo, que presumiblemente se derivan de anticuerpos secundarios precipitados. Imaging se realizó esencialmente como se describe anteriormente [26], [34]. A excepción de expansión de contraste sin tratamiento ulterior imagen se aplicó.
Apoyo a la Información
Figura S1.
diámetro medido de las agrupaciones de fondo tomadas de la Figura 2. (A) La anchura total a la mitad del máximo (FWHM) a través de la x y los ejes y de más de 100 grupos individuales se determinó. Tenga en cuenta que también se analizaron fondo racimos que eran físicamente más grande que la resolución del microscopio. Por lo tanto la FWHM promedio determinado puede ser peor que la resolución real del microscopio utilizado. (B) representativos grupos fondo. Barra de escala: 100 nm
doi:. 10.1371 /journal.pone.0101563.s001 gratis (TIF)
figura S2.
distribuciones de proteínas Sub-mitocondrial en células humanas cultivadas grabados con un STED (izquierda) y microscopio confocal (derecha). Detalle de las mitocondrias decoradas con antisueros contra Tom20 (A), de la aconitasa (B), Mic60 /mitofilin (C), o la ciclofilina D (D). fibroblastos primarios humanos (A, C) o U2OS (osteosarcoma células epiteliales ósea humana) (B, D). Las barras de escala: 500 nm
doi: 10.1371. /journal.pone.0101563.s002 gratis (TIF)
Figura S3. perfil de la línea a través de una región tomada de la Figura 3F. El super-resolución de imagen STED (A) revela estructuras vesiculares-como HER2 positivos que se han difuminado la imagen confocal correspondiente (B) en. (C) perfiles de intensidad de la señal de fluorescencia normalizada a lo largo de las líneas indicadas en el STED (rojo) y las imágenes confocal (negro). El gráfico de dispersión muestra las señales de fluorescencia media sobre 3 perfiles de intensidad adyacentes. Las líneas continuas representan los ajustes correspondientes usando una función de Lorentz. Barra de escala:. 500 nm
doi: 10.1371 /journal.pone.0101563.s003 gratis (TIF)
Reconocimientos
Estamos en deuda con Stefan W. infierno para los debates y apoyo. Agradecemos a Jaydev Jethwa para la lectura crítica del manuscrito y Birgit Jünemann y Hanna Styczen del Departamento de General, Cirugía Pediátrica y visceral, por su excelente asistencia técnica y análisis de coloraciones de tejidos estándar.