Extracto
Antecedentes
Recientemente , una nueva variante de ER-α, fue identificado y clonado ER-α36. ER-α36 carece de actividad de transcripción intrínseca y principalmente media la señalización de estrógenos no genómico. A continuación, se estudió el papel de las vías de señalización de estrógenos no genómicos mediadas por ER-α36 en la acción agonista resistencia y tamoxifeno.
Metodología
La localización celular de ER-α36 se examinó mediante inmunofluorescencia en MCF 7 células y células Hec1A. MCF-7 de cáncer de mama, MCF-7 células que expresan ER-α36 recombinante (MCF-7 /ER36), las células de cáncer de endometrio Hec1A y células Hec1A con siRNA desmontables de ER-α36 (Hec1A /RNAiER36) fueron tratados con 17β-Estradial ( E2) y tamoxifeno (TAM) en ausencia y presencia de U0126 inhibidor de quinasa y LY294002. Se examinó la fosforilación de moléculas de señalización y la expresión de c-Myc por inmunotransferencia, y el crecimiento de células tumorales mediante el ensayo de MTT.
Conclusiones
variante ER ER-α36 aumenta la actividad agonista de TAM a través de la activación de la membrana inició en las vías de señalización cáncer de endometrio, y que ER-α36 está involucrado en
de novo Opiniones y adquirido resistencia de TAM en el cáncer de mama
Visto:. Lin SL, Yan LY, Zhang XT, Yuan J, Li M, Qiao J, et al. (2010) ER-α36, una variante de ER-α, promueve tamoxifeno agonista de acción en células de cáncer endometrial a través de la MAPK /ERK y PI3K /Akt Caminos. PLoS ONE 5 (2): e9013. doi: 10.1371 /journal.pone.0009013
Editor Syed A. Aziz, Health Canada, Canada |
Recibido: December 11, 2009; Aceptado: January 13, 2010; Publicado: 2 Febrero 2010
Derechos de Autor © 2010 Lin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación básica de China (2006CB504004, 2006CB944005). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el tamoxifeno es un modulador selectivo del receptor de estrógeno (SERM) con actividades de agonista /antagonista mixto que se ha utilizado ampliamente como un tratamiento eficaz de todas las etapas del receptor de estrógeno (ER), el cáncer de mama positivo [1]. El tamoxifeno suprime la recurrencia de cáncer de mama y reduce la incidencia de cáncer de mama contralateral en un 49% [2]. El tamoxifeno también se ha utilizado como un agente quimiopreventivo en mujeres que tienen alto riesgo de cáncer de mama [3]. Se cree que el tamoxifeno actúa como un antagonista al competir con los estrógenos para el dominio de ER de unión a ligando, inhibiendo de este modo mediada por ER mitogénica de señalización de estrógenos [4]. Sin embargo, el principal obstáculo para el uso de tamoxifeno es la resistencia a tamoxifeno, que se produce
de novo o puede ser adquirida después de su uso [5]. Además, el uso de tamoxifeno aumenta la incidencia de cáncer de endometrio en mujeres posmenopáusicas con el tratamiento a largo plazo [6]. Los mecanismos moleculares que subyacen a la
de novo y la resistencia adquirida tamoxifeno y su acción agonista en el tejido endometrial, son poco conocidos.
ER pertenece a la familia de hormonas esteroideas de la superfamilia de receptores nucleares. Se considera que predominantemente ER actúa como un factor de transcripción que se localiza principalmente en el núcleo de la célula [7]. Sin embargo, la acumulación de pruebas ha demostrado que ER también existe en la membrana plasmática y participa en la señalización de estrógenos rápida. Se ha informado de que ER es modificado por palmitoylation postraduccional en el dominio de unión a ligando que puede contribuir a su localización en la membrana [8]. Asociación de ER y caveolina-1 también se muestra para facilitar la localización ER en la membrana plasmática [9]. Caveolina-1 es una proteína estructural de caveolae y sirve como un andamio de proteínas para reclutar moléculas tales como los receptores del factor de crecimiento, proteínas G, Src de tirosina quinasas de la familia y la PI3K [10] de señalización. Se postuló que el estrógeno puede activar rápidamente diferentes vías de señalización, incluyendo MAPK /ERK, fosfolipasa C, PI3K /Akt y G vías de los receptores activados por acoplados a la proteína en la caveolae [11].
Recientemente, hemos identificado y clonado una nueva variante de ER-α con un peso molecular de 36 kDa que fue nombrado como ER-α36 [12]. El original de 66 kDa ER-α fue nombrado ER-α66 [13]. ER-α36 transcripción se inicia a partir de un promotor situado en el primer intrón del gen de ER-α66 y se genera a partir de dos eventos de empalme alternativos. ER-α36 proteína así carece dependiente de ligando y dominio de transactivación -independiente (AF-1 y AF-2), pero conserva el dominio de unión de ADN y dominio de dimerización parcial y dominios de unión a ligando [12]. ER-α36 posee un dominio de 27 aminoácidos únicos en el C-terminal que sustituye a los últimos 138 aminoácidos codificados por los exones 7 y 8 del gen ER-α66. Nuestro informe anterior mostró que 17β-estradiol y los SERM como el tamoxifeno podía inducir la activación de la vía /ERK MAPK y estimular la proliferación celular a través de la membrana asociada ER-α36 [14]. por lo tanto la hipótesis de que ER-α36 puede estar asociada con la actividad agonista de tamoxifeno. En el presente informe, se estudió la función ER-α36 en las células MCF-7 de cáncer de mama ER-positivo y las células de cáncer de endometrio Hec1A, y se investigó la contribución de la MAPK /ERK y PI3K /Akt mediada por ER-α36 al agonista acción del tamoxifeno en el cáncer de endometrio.
resultados
ER-α36 se expresa en la membrana plasmática en las células MCF-7 y las células Hec1A
ER-α36 es una nueva variante de ER-α66 generada por el uso promotor alternativo y corte y empalme alternativo [12]. Para examinar la expresión de ER-α36 en células MCF-7 y las células Hec1A, análisis de transferencia de Western se realizó con anticuerpo específico ER-a36 contra los únicos 20 aminoácidos en el extremo C-terminal de ER-α36. ER-α36 se expresa en ambas líneas celulares (Fig. 1A, izquierda). Sin embargo, el análisis de Western blot no pudo detectar la expresión de ER-α66 en las células Hec1A (Fig. 1A, derecha), en consonancia con la Hec1A es una línea celular de cáncer ER-negativos [15]. Para examinar la localización celular de ER-α36, se realizó el ensayo de inmunofluorescencia. En ambas líneas celulares, la tinción de inmunofluorescencia reveló una intensa patrón de distribución de la membrana plasmática (Fig. 1B). Caveolae se invagina microestructuras en la membrana plasmática en la que la caveolina-1 sirve como un andamio de proteínas para formar el complejo de señalización. Como se muestra en la Fig. 1C, la caveolina-1 se expresa principalmente en la superficie celular (rojo). las imágenes fusionadas de ER-α36 y la caveolina-1 mostraron señales de co-localización sustanciales (amarillo) en la membrana plasmática.
, la expresión de ER-α36 y α66 proteína ER-A en las células MCF-7 y Hec1A . Los extractos de proteína se prepararon a partir de células MCF-7 y Hec1A y se utilizan para análisis de transferencia Western. B, La localización de ER-α36 en las células MCF-7 y Hec1A. Las células cultivadas en cubreobjetos se fijaron y tiñeron con immunofluorescently un anticuerpo anti-ER-α36 específica (verde). Las células fueron contrastados con Hoechst 33258 (azul). C, La co-localización de ER-α36 y la caveolina-1 en la membrana plasmática de las células Hec1A. Verde: ER-α36; Rojo: la caveolina-1; azul: nuclear; señales de color amarillo, co-localización. Bar, 10 micrómetros. D, el análisis de tiempo de transcurso de la expresión de ER-α36 en células Hec1A. células Hec1A fueron tratados con 2 mM Tam para los puntos de tiempo indicados. Los niveles de expresión de la proteína se normalizaron con el nivel de expresión de β-actina, y cada barra representa el valor medio ± SEM (n = 3). *, P & lt; 0,05 en comparación con las células no tratadas
A continuación, analizamos la expresión de ER-α36 inducida por ligandos.. Hec1A líneas celulares fueron tratadas con tamoxifeno durante diferentes momentos de la hora y la expresión de ER-α36 se evaluó mediante análisis de transferencia Western, revelando que la expresión de ER-α36 se incrementaron en las células tratadas con tamoxifeno (Fig. 1D).
ER-α36 mediador de estrógeno-Tamoxifen- y estimulada ERK activación
para sondear el mecanismo subyacente del efecto agonista del tamoxifeno en las células de cáncer de endometrio, hemos decidido examinar la función de ER-A36 en las células tratadas con tamoxifeno Hec1A. Examinamos primero los niveles de fosforilación de MAPK /ERK, una quinasa serina-treonina implicado en la proliferación celular [16]. Como se muestra en la Fig. 2A y Fig. 2B, E2 o tratamientos tamoxifeno dan como resultado una rápida fosforilación de ERK1 /2. Reprobing la membrana con un anticuerpo total de ERK1 /2 se indica que el contenido total de ERK1 /2 no se ha cambiado, lo que sugiere que el aumento de la fosforilación de ERK1 /2 no fue causado por el aumento de expresión de ERK1 /2.
A y B, células Hec1A se trataron con 10 nM E2 o 2 M Tam para los puntos de tiempo indicados. Los niveles de ERK1 /2 fosforilación se midieron en extractos de proteína con el análisis de transferencia Western. se utilizó total ERK1 /2 como control de carga. Cada barra representa el valor medio ± SEM (n = 3). *, P & lt; 0,05 en comparación con células no tratadas. C y D, la expresión de ER-α36 en Hec1A /V y las células Hec1A /ARNi. Cada barra representa el valor medio ± SEM (n = 3). *, P & lt; 0,05 en comparación con células Hec1A /V. E, Hec1A /V y las células Hec1A /RNAi tratados con 10 nM E2 o 2 M Tam se analizaron para los niveles de ERK1 /2 fosforilación con Western blot. se utilizó total ERK1 /2 como control de carga, y cada barra representa el valor medio ± SEM (n = 3). *, P & lt; 0,05 en comparación con las células no tratadas (-) frente a tratamientos. F, lisados de Hec1A células tratadas con DMSO (carriles 1, 2 y 3), 10 nM de E2 (carriles 2 y 5), 2 micras Tam (carriles 3 y 6) o pretratadas con 10 U0126 mu M (carriles 4, 5 y 6 ) durante 30 min se analizaron con análisis de Western blot.
para probar la participación de ER-α36 en las actividades de E2 y tamoxifeno observada en las células que carecen de expresión Hec1A ER-α66, decidimos llamad por la expresión de ER-α36 con el enfoque de siRNA. Establecimos líneas celulares estables que expresan vector de expresión de shRNA contra la ER-α36 (células Hec1A /ARNi) y examinó la expresión de ER-α36 (Fig. 2C y 2D). Como se muestra en la Fig. 2E, E2 y el tamoxifeno no lograron estimular la fosforilación de la ERK1 /2 en células Hec1A con ER-a36 derribados, lo que sugiere que ER-A36 es el receptor que media la actividad de los estrógenos y el tamoxifeno.
Quinasa
extracelular regulada quinasa (MEK) actúa aguas arriba de ERK1 /2 y podría fosforilar y activar ERK1 /2 [17]. El U0126 inhibidor específico de MEK inhibe eficazmente la ERK1 /2 activación estimulada por E2 y tamoxifeno (Fig. 2F).
También establecimos líneas celulares estables de células de cáncer de las células MCF-7 de mama positivos que expresan constitutivamente ER recombinante -α36 (MCF-7 /ER36 células) (Fig. 3A). En el control de las células MCF-7 transfectadas con el vector vacío, la fosforilación inducida por el tratamiento E2 de la ERK1 /2 (Fig. 3B), lo que podría ser abolido por tamoxifeno (Fig. 3C). Sin embargo, el tamoxifeno inducida por la fosforilación del ERK1 /2 en células MCF-7 /ER36 células (Fig. 3D). MEK U0126 inhibidor específico inhibe eficazmente la ERK1 /2 activación estimulada por E2 y tamoxifeno (Fig. 3E). Por lo tanto, estos resultados indican que ER-α36 media la vía Ras /ERK /MEK inducida por estrógenos y el tamoxifeno y sugirieron que ER-A36 puede estar implicado en la resistencia a tamoxifeno e incluso promover la acción agonista del tamoxifeno.
, análisis de transferencia de Western de la expresión de ER-α36 en MCF-7 /ER36 células MCF-7 /V y. Los niveles de expresión se normalizaron a los niveles de β-actina, y cada barra representa el valor medio ± SEM (n = 3). *, P & lt; 0,05 en comparación con MCF-7 /V células. B y C, MCF-7 /V células tratadas con 10 nM E2 solo o con 2 M Tam juntos para los puntos de tiempo indicados. Los extractos de proteína se analizaron con análisis de transferencia de Western. se utilizó total ERK1 /2 como control de carga. Cada barra representa el valor medio ± SEM (n = 3). *, P & lt; 0,05 en comparación con las células control. D, MCF-7 /ER36 células tratadas con 2 mM Tam para diferentes puntos de tiempo fueron analizados para ERK1 /2 fosforilación con Western blot. Los niveles de expresión se normalizaron a los niveles de la ERK1 Total /2, y cada barra representa el valor medio ± SEM (n = 3) *, P & lt;. 0.05 en comparación para las células no tratadas. E, los lisados se prepararon a partir MCF-7 /ER36 células tratadas con DMSO (carriles 1, 2 y 3), 10 nM de E2 (carriles 2 y 5), 2 M de Tam (carriles 3 y 6) o pretratadas con U0126 10 M (calles 4, 5 y 6) durante 30 min y a inmunotransferencia con anticuerpos contra pERK1 /2 o total ERK1 /2.
ER-α36 y media la estrógeno-tamoxifeno estimulada por PI3K /Akt activación
es bien sabido que la serina /treonina quinasa Akt, o la proteína quinasa B, desempeña un papel importante en la proliferación celular y la supervivencia mediante la inhibición de la apoptosis [18]. Hemos probado si E2 y el tratamiento con tamoxifeno también induce la activación de la vía Akt en células Hec1A. El tratamiento de E2 y tamoxifeno dio lugar a una rápida fosforilación de Akt (Fig. 4A y 4B), mientras que tanto E2 y el tamoxifeno no inducir la fosforilación de Akt en células Hec1A /RNAi (Fig. 4C). El tamoxifeno también indujo la fosforilación de Akt en células MCF-7 que se expresa altamente ER-α36 recombinante (Fig. 4E). El pretratamiento con el inhibidor de PI3K LY294002 abrogó la fosforilación de Akt estimulada por E2 o tamoxifeno en ambas líneas celulares (Fig. 4D y 4F), lo que indica que ER-α36 media tamoxifeno inducida por la fosforilación de Akt a través de la vía PI3K en estas células. Por lo tanto, nuestros datos sugieren que activaton de la vía PI3K /Akt ER-α36-mediada también pueden estar involucrados en la acción agonista de la resistencia y del tamoxifeno.
Hec1A células fueron tratadas con 10 nM E2 (A) o 2 M Tam (B) para los puntos de tiempo indicados y los lisados se inmunotransfirieron con un anticuerpo contra Akt fosforilada. Los niveles de fosforilación se normalizaron con la proteína Akt total y cada barra representa el valor medio ± SEM (n = 3). *, P & lt; 0,05 en comparación con células no tratadas. C, análisis de transferencia de Western de la fosforilación de Akt en Hec1A /V y las células Hec1A /RNAi ER36 tratados con 10 nM E2 o 2 M Tam para 10 min. Los niveles de fosforilación se normalizaron con la proteína Akt total y cada barra representa el valor medio ± SEM (n = 3). *, P & lt; 0,05 en comparación con células no tratadas. #, P & lt; 0,05 en comparación con S2- o células Hec1A /V tratados con Tam. D, las células Hec1A previamente con 50 mM inhibidor de PI3K LY294002 (LY, carriles 4, 5 y 6) durante 2 h y después se trató con 10 nM E2 (carriles 2 y 5) o 2 mM Tam (carriles 3 y 6) para 10 min . E, Western blot de la fosforilación de Akt en MCF-7 /ER36 células tratadas con 2 mM Tam para los puntos de tiempo indicados. La expresión se normalizó a Akt total, y cada barra representa el valor medio ± SEM (n = 3) *, P & lt;. 0.05 en comparación para las células no tratadas. F, los lisados se prepararon a partir MCF-7 /ER36 células tratadas con DMSO (carriles 1 y 2), 2 M de Tam (carriles 2 y 4) o tratados previamente con 50 mM inhibidor de PI3K LY294002 (LY, carriles 3 y 4) para 2 h, y la inmunotransferencia con anticuerpos contra Akt fosforilada o Akt total.
ER-α36 participa en la regulación de c-Myc expresión de proteínas en células Hec1A
protooncogén c-Myc tiene profundas efectos mitógenos de las células cancerosas a través de su capacidad para promover la progresión del ciclo celular [19]. Los oligonucleótidos antisentido a c-Myc pueden inhibir las células del cáncer de mama proliferación [20]. El tamoxifeno inhibe la expresión de c-Myc inducida por estrógenos en células de cáncer de mama ER-α66-positivo. Sin embargo, c-Myc juega un papel importante en la acción agonista de tamoxifeno [21]. Medimos los niveles de expresión de c-Myc en las células tratadas con E2 Hec1A o tamoxifeno. Como se muestra en la Fig. 5A, el tratamiento con E2 o tamoxifeno inducida por la expresión de c-Myc en células Hec1A /V pero no en células ER-α36 /ARNi Hec1A, que podrían ser abrogaron efectivamente por el inhibidor de MEK U0126 (Fig. 5B) y el inhibidor de PI3K LY294002 (Fig. 5C).
a, Western blot de la expresión de c-Myc en Hec1A /V y las células Hec1A /RNAi tratados con 10 nM E2 o 2 M Tam durante 12 h. Los niveles de expresión se normalizaron a los niveles de β-actina, y cada barra representa el valor medio ± SEM (n = 3). *, P & lt; 0,05 en comparación con las células no tratadas (-) frente a tratamientos. #, P & lt; 0,05 en comparación con células Hec1A /V tratados con Tam. B y C, Hec1A células se trataron durante 12 h con 10 nM E2 o 2 M Tam o junto con 10 M de MEK U0126 inhibidor o 50 mM inhibidor de PI3K LY294002. Los niveles de expresión de c-Myc se normalizaron a los niveles de β-actina, y cada barra representa el valor medio ± SEM (n = 3). *, P & lt; 0,05 en comparación con las células no tratadas (-) frente a tratamientos. #, P & lt;. 0,05 en comparación con las células E2- y Tam tratados Hec1A /V
ER-α36 media la proliferación de células estimuladas con tamoxifeno en células Hec1A
Para estudiar más a fondo el papel de ER-α36 de la actividad agonista de tamoxifeno en células de cáncer de endometrio, Hec1A /V y las células Hec1A /ARNi fueron tratadas con tamoxifeno y su prolifaration se midió con el ensayo de MTT. MTT ensayo mostró que el tamoxifeno estimulan el crecimiento de las células Hec1A /V. Sin embargo, el tamoxifeno fue capaz de inhibir el crecimiento de células Hec1A /ARNi en una manera dependiente de la dosis (Fig. 6A). La proliferación celular inducida por el tamoxifeno fue inhibida por el inhibidor de MEK U0126 y PI3K inhibidor LY294002 (Fig. 6B), lo que sugiere que tanto la MAPK /ERK y PI3K /Akt estaban involucrados en E2 y tamoxifeno estimulan el crecimiento celular en células de cáncer de endometrio.
placas de 96 pocillos a, se sembraron células Hec1A transfectadas con el vector vacío expresión (Hec1A /V) o líneas celulares Hec1A en el que ERα36 había sido establemente derribado por la expresión de shRNA (Hec1A /ARNi) (3 × 10
3 células /pocillo). Las células se trataron con diferentes concentraciones de Tam en medio que contiene despojado carbón vegetal 2,5% de dextrano de FBS durante 72 h. ensayo de MTT se realizó como se describe en
materiales y métodos
. Los resultados de tres experimentos independientes se promediaron y se muestran valor medio ± SEM. *, P & lt; 0,05 en comparación con las células tratadas con Tam Hec1A /V, respectivamente. B, las células Hec1A se trataron con 10 nM E2 o 2 M Tam junto con 10 M de la inhibidor de MEK U0126 o 50 mM PI3K inhibidor LY294002 respectivamente durante 72 h, y se analizó mediante el ensayo de MTT. Los resultados de tres experimentos independientes se promediaron y se muestran valor medio ± SEM. *, P & lt; 0,05 en comparación con las células control. C, vector de expresión vacía transfectaron células MCF-7 (MCF-7 /V) o MCF-7 transfectadas con (MCF-7 /ER36 células) ERα36 vector de expresión se sembraron en placas de 96 pocillos (5 x 10
3 células /pocillo). Las células se trataron con diferentes concentraciones de tamoxifeno en medio que contiene 10% de FBS durante 72 h. Se realizó el ensayo de MTT. Los resultados de tres experimentos independientes se promediaron y se muestran valor medio ± SEM. *, P & lt; 0,05 en comparación con los tratados con Tam MCF-7 /ER36 células respectivamente. D, MCF-7 /V y MCF-7 /ER36 células fueron tratadas con 2 mM Tam junto con 10 M U0126 o 50 inhibidor de PI3K LY294002 mu M, respectivamente, para 72 h y se analizaron mediante el ensayo de MTT. Los resultados de tres experimentos independientes se promediaron y se muestran valor medio ± SEM. *, P & lt; 0,05 en comparación con el control MCF-7 /V células
Hemos observado que el tamoxifeno inhibe la proliferación de células fuertemente en las MCF-7 /V células, de acuerdo con informes anteriores que las funciones de tamoxifeno como una. potente antagonista en el cáncer de mama ER-positivo MCF-7 células [22]. Sin embargo, las células MCF-7 /ER36 células que expresan constitutivamente altos niveles de ER-α36 recombinante exhiben insensibilidad al tratamiento con tamoxifeno (Fig. 6C). El U0126 inhibidor y el inhibidor de PI3K LY294002 MEK además inhibe el crecimiento de ambas líneas celulares (Fig. 6D). Estos resultados sugieren que una vez elevado nivel de expresión de ER-α36 puede conferir resistencia al tamoxifeno.
Discusión
El tamoxifeno es un SERM que ha sido ampliamente utilizado para tratar el cáncer de mama ER-positivo avanzado y para prevenir el cáncer de mama en alto riesgo pre y mujeres post-menopáusicas como agente quimiopreventivo [23], [24]. Sin embargo, el tamoxifeno también tiene actividad estrogénica parcial en el útero que puede conducir a la hiperplasia de endometrio [25]. el uso de tamoxifeno a largo plazo se asocia con un aumento de la incidencia de cáncer de endometrio [26]. Aquí se informó de que una nueva variante de ER-α, ER-α36, que es altamente expresado en la membrana plasmática de las células de cáncer endometrial Hec1A y en las muestras de cáncer de endometrio de pacientes que habían sido tratados con tamoxifeno durante al menos tres años. Tanto E2 y tamoxifeno induce la proliferación celular de las células Hec1A presumiblemente a través de los mediada por ER-α36 vías de señalización no genómicos.
Varias hipótesis se han postulado para explicar la acción agonista del tamoxifeno en la carcinogénesis endometrial. Se ha sugerido que los metabolitos reactivos de tamoxifeno forma de DNA de aductos y generar mutagenicidad en el tejido endometrial [27]. También se ha demostrado que el dominio AF1 de ER-α66, así como el reclutamiento del coactivador por células y-promotor específico están involucrados en la acción agonista de tamoxifeno [28], [29]. El papel del tamoxifeno en la carcinogénesis endometrial puede utilizar distinta actividad genómica [30]. Recientemente, la acumulación de evidencia sugiere que las vías de señalización de la membrana iniciada confieren resistencia tamoxifeno y la acción agonista a través de diferentes cascadas de quinasa y segundos mensajeros distintas [15].
La familia MAPK consta de ERK, JNK y p38. ERK juega un papel esencial en el crecimiento y la proliferación celular. JNK y p38 están implicadas en la diferenciación celular y la apoptosis inducida por estímulos de estrés, tales como la luz UV [31], la radiación γ [32], [33], que dañan el ADN y las drogas quimiopreventivos [34]. Muchas moléculas de señalización oncogénicas activan la vía MAPK /ERK [35]. expresión de ERK por lo general se incrementa y su actividad es regulada hasta en los tejidos de cáncer de mama en comparación con los tejidos normales vecinos [36]. Por otra parte, la resistencia a tamoxifeno
in vivo
está predominantemente mediada por mecanismos no genómicos. acción de los estrógenos genómico parece menos activo [37], [38]. En este estudio, se encontró que ER-α36 media tanto S2- y la activación inducida por tamoxifeno de la vía MAPK /ERK y la sobreexpresión ER-α36 en tamoxifeno células sensibles MCF-7 sensibilidad reducida a tamoxifeno. Además, ER-α36 media la activación inducida por tamoxifeno de la vía MAPK /ERK y también contribuye a agonista acción de tamoxifeno en células de cáncer endometrial Hec1A. tejidos de cáncer de endometrio que se expresa altamente ER-α36 también está representada altos niveles de la fosforilación de ERK.
La PI3K /Akt juega un papel importante en el crecimiento celular y la supervivencia [39]. Akt se activa por muchas vías de señalización, tales como la sobreexpresión de los receptores del factor de crecimiento, [40]. Introducción de un Akt constitutivamente activa en células MCF-7 podría inducir resistencia tamoxifeno mediante la protección de células de la apoptosis inducida por tamoxifeno [41]. Además, la actividad de Akt se incrementa dramaticaly en las células MCF7 resistentes tamoxifen- [18]. En pacientes Akt-positivas fosforilados, terapia endocrina tiene peor eficacia que en los pacientes Akt fosforilada-negativas [42]. En este estudio, encontramos la activación tamoxifeno estimulada mediada por ER-α36 de Akt en células con altos niveles de expresión de ER-α36 que sugieren que la activación de la vía PI3K /Akt mediada por ER-α36 contribuye a la acción de resistencia y agonista de tamoxifeno .
La proteína c-Myc es un factor de transcripción nuclear que juega un papel esencial en el crecimiento celular [43]. Estudios anteriores han demostrado que MAPK /ERK y las vías PI3K /Akt regulan c-Myc expresión de la proteína [44], [45], [46]. Encontramos tanto E2 y tamoxifeno expresión de c-Myc inducida por la activación mediada por ER-α36 de ERK y Akt. La incubación de las células con Hec1A inhibidor de MEK U0126 y el inhibidor de PI3K LY294002 bloqueado S2- y tamoxifen- indujo la expresión de c-Myc. Por lo tanto, el tamoxifeno ejerce una acción agonista través de la vía no genómico ER-α36 mediada.
En resumen, Presentamos aquí que la ER-α36 se expresa en la membrana plasmática y en el citoplasma de las células de carcinoma endometrial. Además, demostró que tanto E2 y tamoxifeno promovió la proliferación de células de cáncer de endometrio mediante la activación ER-α36-mediada de la MAPK /ERK y PI3K /Akt y la sobreexpresión ER-α36 llevado a la resistencia a tamoxifeno en células MCF-7. Nuestros resultados proporcionan información nueva importante para entender mejor los mecanismos moleculares que subyacen a la acción agonista del tamoxifeno.
Materiales y Métodos
Materiales y Reactivos
Todos los productos químicos y reactivos fueron adquiridos de Sigma indicado a menos que de otro modo. Policlonales anti-ERK1 2 /anticuerpo, policlonal anti-fosfo ERK1 2 de anticuerpo /(Thr
202 /Tyr
204), anticuerpos policlonales anti-caveolina-1 -TRITC anticuerpo, anticuerpo anti-c-Myc monoclonales, policlonales anticuerpo anti-Akt, monoclonal anti-ER-α66 anticuerpo (D-12) y el anticuerpo anti-β-actina monoclonal se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Policlonales anti-fosfo-Akt (Ser
473) de anticuerpos se obtuvo de Signalway de anticuerpos (Pearland, TX). El anticuerpo específico ER-α36 contra los 20 aminoácidos únicos en el C-terminal de ER-α36, plásmido de expresión de ER-α36, vector de expresión de ER-α36 shRNA y el vector de expresión vacío se describió antes [12], [14]. U0126 se adquirió de Calbiochem (La Jolla, CA).
Cultivo de células y líneas celulares
células MCF-7 de cáncer de mama humano se obtuvieron de ATCC (Manassas, VA) y de endometrio humano Hec1A se obtuvieron células cancerosas del Dr. Li-Hui Wei (Pekín hospital Popular de la Universidad, Pekín). Ambas líneas celulares se mantuvieron a 37 ° C con 5% de CO
2 en medio de cultivo apropiado. Para establecer MCF-7 células que expresan ER-α36 recombinante, las células se sembraron a una densidad de 1 × 10
5 células por placa de 60 mm y se transfectaron 24 horas más tarde con un vector de expresión impulsado por el cytomagalovirus (CMV) en el vector de expresión de mamífero pCB6 + como se describe en otra parte [14], utilizando el Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). El vector de expresión contiene el cDNA ER-α36 de longitud completa. El vector de expresión vacío también se transfectó en células para servir como un control. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se re-chapada y seleccionaron con 500 g /ml de G418 durante dos semanas. El medio se cambió cada tres días hasta que aparecieron las colonias. Los clones se expandieron para su posterior análisis. Los clones con alta expresión de ER-α36 eran una mezcla de más de veinte clones y se denominan células MCF-7 /ER-α36. Una línea celular con clones agrupados transfectadas con el vector de expresión vacío fue nombrado MCF-7 /V y se utilizó como control.
También establecimos líneas celulares a partir de células Hec1A transfectadas con un vector de expresión de shRNA ER-α36 (Hec1A /RNAi) y el vector de expresión vacía (Hec1A /V). Brevemente, ER-α36 shRNA vector de expresión pRNAT-U6.1 /plásmido Neo que contiene el shRNA contra ER-a36 (GenScript Corp. TX) y el vector de expresión vacío se transfectaron en células Hec1A con Lipofectamine 2000 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se re-chapada y seleccionadas con G418 (600 mg /ml) durante dos semanas. Los clones se expandieron para su posterior análisis.
inmunofluorescencia y microscopía confocal
La localización celular de la proteína se determinó por inmunofluorescencia indirecta. células Hec1A o MCF-7 cultivadas en cubreobjetos de vidrio estériles se fijaron en paraformaldehído al 4% en PBS durante 10 min. Después de ser permeabilizadas con 0,4% Triton X-100 a temperatura ambiente durante 10 min, las células fueron bloqueadas en 4% BSA-PBS suplementado durante 1 h y se incubaron durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo anti-ER-α36-específico. Después de tres lavados en PBS, las células se marcaron con el anticuerpo secundario conjugado con FITC. El tinte de ADN Hoechst 33258 se utilizó para la tinción nuclear.
Para la doble tinción de ER-α36 y la caveolina-1, después de la tinción ER-α36 y lavar en PBS, las células fueron bloqueadas en 4% BSA-PBS suplementado durante 1 h a temperatura ambiente. Después de la incubación con el anticuerpo anti-caveolina-1-TRITC durante la noche, las células se lavaron adicionalmente en PBS y se tiñeron con Hoechst 33258. análisis microscópicos se realizaron con un microscopio confocal láser de barrido (Zeiss LSM 510 META, Alemania).
Semi-RT-PCR cuantitativa
el ARN total se extrajo por el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. Se utilizó el ARN total (1,6 g) para la producción de la primera cadena de ADNc por transcriptasa inversa (Takara, Dalian, P.R.China). Los siguientes conjuntos de cebadores fueron diseñados para la amplificación de ER-α36 humana (BX640939, 1145-1434 pb): adelante, 5'-CAAGTGGTTTCCTCGTGTCTAAAGC-3 'y revertir, 5'-TGTTGAGTGTTGGTTGC CAGG-3'; ARNm de GAPDH humano fue amplificado por el cebador directo 5'-ACGGATTTGG TCGTATTGGG-3 'y el cebador inverso 5'-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3'.
Ensayo MTT
La proliferación celular se analizó utilizando la 3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5- difeniltetrazolio (MTT) ensayo [47]. Brevemente, las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una concentración final de 5 × 10
3 /bien para MCF-7 /V y MCF-7 /ER36 células o 3 × 10
3 /pocillo para Hec1A /células V y Hec1A /ARNi. MCF-7 /V y MCF-7 /ER36 células se incubaron en medio DMEM que contiene 10% de FCS con los tratamientos indicados. células Hec1A /V y Hec1A /ARNi se incubaron en medio libre de rojo fenol que contiene 2,5% de FCS despojado de carbón dextrano (Biochrom AG, Berlin, Alemania) con los tratamientos indicados. Las células se incubaron con MTT (0,5 mg /ml) durante 4 horas a 37 ° C. Después de la eliminación del medio que contiene el reactivo MTT, se añadieron 150 ml de DMSO a cada pocillo. Las placas se leyeron a la longitud de onda de 490 nm utilizando un lector de microplacas (Bioteck Powerwave ™, EE.UU.).
Análisis de transferencia Western
Las células fueron cultivadas en medio de fenol-libre de rojo con el 2,5% de dextrano carbón vegetal despojado de FCS durante 48-72 horas y luego se cambió a medio sin suero de 12 h antes de la estimulación por los agentes indicados. Las células se recogieron en PBS enfriado en hielo, y los extractos celulares se prepararon en tampón RIPA con el cóctel inhibidor de proteinasa de Sigma (St. Louis, MO). Los lisados celulares se hirvieron con tampón de carga de gel durante 5 minutos a 100 ° C, se resolvieron en 10% SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de PVDF, se sondearon con los anticuerpos apropiados y se visualizaron con un aumento de quimioluminiscencia (ECL) reactivos de detección (Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ).
análisis estadístico
el análisis estadístico se realizó con muestras relacionadas
t-test
, o ANOVA seguido de la prueba de Student-Newman-Keuls para determinar diferencias en las medias.
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Reconocimientos
Nos gustaría agradecer al Dr. Li-Wei Hui amablemente para proporcionar las células Hec1A.. También agradecemos al Dr. Yong-Feng Shang en la Universidad de Pekín y el Dr. Heide Schatten de la Universidad de Missouri por una cuidadosa lectura del manuscrito y sugerencias reflexivas.