Extracto
Antecedentes
El erizo (HH) y la vía ha sido implicado en la patogénesis del cáncer, incluyendo el adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC). Estudios recientes han sugerido que la función oncogénica de Hh en PDAC implica la señalización en las células del estroma de células en lugar de efectos autónomos sobre las células tumorales. Sin embargo, el origen y la naturaleza del tipo (s) de células del estroma que son sensibles a la señalización de Hh seguían siendo desconocidos. Desde señalización Hh juega un papel crucial durante la vasculogénesis embrionario y postnatal, especuló que Hh ligando puede actuar sobre la vasculatura tumoral se centra específicamente en la médula ósea (BM) -derivado células.
Metodología /Principales conclusiones
ciclopamina se utilizó para inhibir la vía Hh en líneas celulares humanas PDAC y sus xenoinjertos. Se emplearon los trasplantes BM, sistemas de co-cultivo de las células tumorales y derivados-BM células pro-angiogénicos (BMPCs) para evaluar el papel de Hh derivado del tumor en la regulación del compartimento BM y la contribución de las células derivadas de la BM a la angiogénesis en PDAC. administración ciclopamina atenuada de señalización Hh en el estroma en lugar de en las células cancerosas como se refleja por la disminución de expresión de la proteína de longitud completa Gli2 y mRNA Gli1 específicamente en el compartimiento. La ciclopamina inhibe el crecimiento de xenoinjertos de PDAC en asociación con la regresión de la vasculatura del tumor y la reducción de homing de células derivadas-BM al tumor. los niveles de Ang-1 e IGF-1 mRNA derivados de acoger fueron regulados a la baja por la ciclopamina en los xenoinjertos tumorales.
In vitro
co-cultivo y ensayos de enchufe matrigel demostraron que derivado de células PDAC Shh induce Ang-1 y IGF-1 en la producción BMPCs, lo que resulta en su actividad la morfogénesis y la migración capilar mejorada.
conclusiones /Importancia
identificó la BMPCs como objetivos estromales alternativas de Hh-ligando en PDAC que sugieren que la vasculatura tumoral es una atractiva diana terapéutica de Hh bloqueo. Nuestros datos son consistentes con el concepto emergente que las células derivadas-BM hacen importantes contribuciones a la tumorigénesis epiteliales
Visto:. Nakamura K, J Sasajima, Mizukami Y, Sugiyama Y, Yamazaki M, Fujii R, et al. (2010) Erizo Promueve la neovascularización en los cánceres de páncreas mediante el control de Ang-1 e IGF-1 en la expresión derivadas de médula ósea las células pro-angiogénicos. PLoS ONE 5 (1): e8824. doi: 10.1371 /journal.pone.0008824
Editor: Sudha Agarwal, de la Universidad Estatal de Ohio, Estados Unidos de América
Recibido: 11 Octubre, 2009; Aceptado: 1 Enero 2010; Publicado: 21 Enero 2010
Derechos de Autor © 2010 Nakamura et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de YM de la Nueva Energía y Tecnología Industrial Organización de Desarrollo de Japón (07A05010a). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
pancreático adenocarcinoma ductal (PDAC) es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en los Estados Unidos y el quinto en Japón, y su tasa de supervivencia global a los 5 años es sólo del 5,0 a 9,7% [1], [ ,,,0],2]. quimioterapia basada en gemcitabina para localmente avanzado o metastásico PDAC tiene solamente una actividad modesta con un pequeño beneficio en la supervivencia [3]. La identificación de nuevas dianas moleculares para el PDAC para superar el mal pronóstico, por lo tanto es necesario. Hasta el momento, una serie de terapias dirigidas contra EGFR [4], Ras /MEK [5] y VEGF [6] han logrado mejorar significativamente la supervivencia en los ensayos clínicos.
activación aberrante de la vía Hedgehog (Hh) más recientemente ha sido reconocido como uno de los mediadores del desarrollo PDAC y por lo tanto se considera que es un objetivo prometedor para la terapia [7], [8]. Hh es un morfógeno requerido para la formación de patrones adecuada durante la embriogénesis. La expresión elevada de proteínas relacionadas con Hh, Sonic hedgehog (Shh) o Indian hedgehog (Ihh), deteriora la morfogénesis de páncreas con el aumento de mesénquima y disminuye en el compartimiento epitelial [9], lo que indica que la regulación estricta del nivel general de actividad Hh es crucial para el desarrollo de páncreas normal. Desde Shh es misexpressed no sólo en PDAC sino también en las lesiones precursoras neoplasia intraepitelial pancreática (PanIN) [8] y la neoplasia papilar mucinoso intraductal [10], la desregulación de esta vía puede jugar un papel durante las primeras etapas de la tumorigénesis. Una serie de genes Hh objetivo, tales como BMP [11], FOXM1 [12], y PMP22 [13], se sobreexpresa en PDAC, y hay diafonía entre las vías oncogénicas incluyendo MAPK /ERK, PI3K /Akt [14 ], Wnt [15], TGF /BMP [16] y la señalización de Hh. Entre las moléculas que participan en la señalización Hh, Smoothened (Smo) ha sido reconocido como un mediador clave de la señalización; es uno de los componentes del receptor para el ligando de Hh y convierte Gli2 en un activador transcripcional [17]. Por lo tanto, Smo es un objetivo particularmente prometedora para la terapia contra el cáncer [18]. Ciclopamina, un alcaloide esteroide natural, tiene fuertes efectos inhibitorios contra Smo [18] y el tratamiento con ciclopamina en el entorno experimental inhibe el crecimiento de muchos tipos de cáncer [19], [20], [21]. derivados de ciclopamina con diversos motivos estructurales se han generado y son prometedoras para su posible uso clínico [22]
.
inhibición significativa del crecimiento Específicamente, varios estudios han demostrado de PDAC
in vivo fotos: por vía Hh bloqueo [ ,,,0],7], [23]. El mecanismo de inhibición del crecimiento del tumor se ha pensado que es mediado principalmente a través de bloqueo de un bucle autocrino que podrían ser necesarios para la proliferación [7], la supervivencia [8] y la motilidad [21] de las células cancerosas. Sin embargo, Smo deleción en el epitelio de páncreas no perjudica la tumorigénesis en un modelo de ratón de PDAC [24], y ligandos Hh no provocar el reporteros transcripcionales de la vía en las líneas PDAC. Además, la expresión transgénica de un alelo Smo activado en el epitelio de páncreas falla para inducir Smo genes diana vía o para inducir el cambio neoplásico [25]. En consecuencia, se ha especulado que la señalización de Hh podría desempeñar un papel paracrino dentro del microambiente del tumor, en los cánceres epiteliales que carecen de mutaciones en los componentes de señalización Hh. papeles cruciales hecho, los estudios realizados por nosotros y otros han definido de células de cáncer de Hh derivan de tipos de células dentro de los compartimentos del estroma del tumor [26], [27], [28]. A pesar de estos hallazgos, los mecanismos precisos por los que algunas células tumorales son insensibles a la inhibición Hh y el tipo (s) de células del estroma que son sensibles a la señalización de Hh sigue siendo desconocido. Por ello, realizó estudios para dilucidar estos mecanismos.
Métodos
Cultivo celular, el análisis de proteínas, ARN y análisis
PDAC líneas celulares humanas se obtuvieron a partir de ATCC, Recursos de Investigación de Ciencias de la Salud Banco (Osaka, Japón) y el Centro de recursos de la célula de Investigaciones Bioquímicas (Sendai, Japón). CMNMO aislamiento, ensayos de proliferación, co-cultivo, los ensayos de migración, inmunotransferencia, y qPCR se describen en los métodos S1. Primer secuencias se resumen en la Tabla S1.
se realizaron Animales, trasplante de médula ósea (TMO) e inmunohistoquímica
Los estudios terapéuticos con ciclopamina con xenoinjertos de ratones desnudos como se describe [7]. procedimientos de BMT se proporcionan en Métodos S1. Los protocolos para experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Asahikawa Medical Collage.
Los tejidos fueron procesados como se informó anteriormente [26]. Los anticuerpos y las condiciones para la inmunohistoquímica se presentan en Métodos S1.
Celular, Molecular y Análisis estadísticos
Las descripciones detalladas de los procedimientos se proporcionan en Métodos S1.
Resultados
en Vivo
Efectos de la ciclopamina sobre KP-1N xenoinjertos
con el fin de dilucidar los mecanismos por los que la señalización de Hh podría apoyar la progresión del tumor de una manera no autónoma de las células tumorales, se evaluaron el papel de la señalización de Hh en el crecimiento del PDAC
in vivo
. Se seleccionó una línea celular, KP-1N, que exhibió una alta expresión de Shh, pero era insensible a la inhibición del crecimiento por ciclopamina
in vitro gratis (Figura S1, S2 y el cuadro S2). El tratamiento de KP-1N xenoinjertos con ciclopamina al día durante 7 días causó una reducción de 46 por ciento en peso del tumor en comparación con los tumores tratados con control de vehículo (Figura 1A). El análisis histopatológico reveló que los tumores tratados con ciclopamina tenían áreas abundantes de necrosis que resulta en una reducción del 59% en peso del tumor viable. De acuerdo con estos resultados, la tinción para Ki-67 y TUNEL demostró que el tratamiento con ciclopamina reduce la proliferación en un 14% y un aumento de la muerte celular en un 9%
in vivo gratis (Figura 1B); por el contrario, no hubo un efecto significativo de la ciclopamina sobre la proliferación /cinética de muerte celular
in vitro gratis (Figura S2).
(A) CD-1 ratones desnudos portadores de xenoinjertos de KP-1N fueron tratados con o sin ciclopamina (50 mg /kg /día; sc) al día durante 7 días (10 xenoinjertos para cada grupo). Los resultados se muestran el peso del tumor ± SEM como media (mg). H-E tinciones de secciones de xenoinjerto se muestran y se midió% área necrótica (N). Las barras de escala; 200 micras. (B) tejidos de xenoinjerto se tiñeron con anti-Ki-67 (barras de escala; 200 micras) y el ensayo de TUNEL (Barras de escala; 500 micras) se llevó a cabo. La cuantificación de la proliferación /apoptosis se muestra como porcentaje de células positivas en 5 campos viables a partir de 10 secciones. (C) Se extrajo ARN de tejidos de xenoinjerto y los niveles de ARNm para Ptch1 y Gli1 se cuantificaron por TaqMan qPCR.
Con el fin de determinar qué células se vieron afectados por el tratamiento con ciclopamina, que mide la expresión de Ptch1 y Gli1 ARNm, objetivos transcripcionales de la señalización de Hh, tanto en las células de tumores humanos xenoinjertados, así como el compartimiento del estroma de ratón. Para ello, hicimos uso de sondas específicas de especie. Hemos observado que Ptch1 humana y en los tejidos de xenoinjerto Gli1 fueron sólo modestamente disminuyó por tratamiento con ciclopamina (Figura 1C). Se observaron disminuciones comparables, de menor importancia en la expresión
in vitro gratis (Figura S3). En comparación, los niveles de ARNm de ratón Ptch1 y Gli1 mostraron una regulación a la baja notablemente más pronunciada, lo que indica que las células estromales son objetivos importantes de Hh bloqueo. En conjunto, estos resultados indican que el efecto anti-tumor de ciclopamina en el crecimiento de xenoinjerto está mediada principalmente a través de una regulación a la baja de la señalización de Hh en el estroma asociado al tumor.
Efectos de la ciclopamina en la vasculatura tumoral
entre los componentes del estroma en xenoinjertos PDAC, estábamos especialmente curiosos sobre la vasculatura del tumor, ya que hemos demostrado que deriva BM-pro-angiogénicos células (precursores) son sensibles a ligandos Hh durante la neovascularización [26], [29]. Por lo tanto, se investigó el efecto de la ciclopamina sobre la vasculatura tumoral en xenoinjertos de KP-1N. La inmunotinción para el marcador de células endoteliales CD31 reveló que la densidad microvascular se redujo significativamente (42,6%) cuando los ratones fueron tratados con ciclopamina (Figura 2A). La vasculatura del tumor resultante se redujo y fragmentada, y la reducción en el área media recipiente fue dramático (64,8%). La inhibición de la angiogénesis por ciclopamina también se observó en Traje-2 xenoinjertos (Figura S4)
.
(A) xenoinjertos KP-1N tratados con o sin ciclopamina se tiñeron con CD31. Las barras de escala; 500 micras. Los datos se muestran como media ± SEM MVD y el área del vaso significan. (B) tinción de inmunofluorescencia doble con α-actina de músculo liso (SMA) con CD31 o CD31 con NG2. Las barras de escala; 200 micras. Se muestra el número de CD31
+ microvasos cubiertas de α-SMA o NG2 pericitos positivos.
Nuestros resultados sugieren que el bloqueo de la señalización de Hh "desestabiliza" los vasos del tumor. Hemos querido para confirmar esta hipótesis mediante tinción inmunohistoquímica para actina de músculo liso α-(SMA), NG2, y CD31. SMA y NG2 se expresan por pericitos, que son células que se asocian estrechamente con las células endoteliales CD31-positivo para estabilizar los vasos sanguíneos [30], [31]. Hemos observado 50,0% o 62,1% menos de CD31
+ microvasos cubiertas de SMA
+ o NG2
+ pericitos en los tumores tratados con ciclopamina (Figura 2B). Por lo tanto, la señalización de Hh es importante para la maduración y /o estabilización de la vasculatura tumoral.
derivado de un tumor Hh Promueve la incorporación de células derivadas del BM en la neovasculatura
La médula ósea (BM) -derivado se cree que las células que desempeñan un papel en el desarrollo del tumor [32], [33]. Por ejemplo, se han observado varios tipos de células hematopoyéticas derivadas de BM a asociarse estrechamente con la neovasculatura del tumor [34], [35], y, de hecho, un pequeño número de células progenitoras derivadas de la BM se demostró que incorporar en el lumen de un creciente vasculatura donde se diferencian en células endoteliales en un modelo de cáncer de pulmón de ratón [36]. Varios factores en el microambiente del tumor pueden modular el reclutamiento y la retención de las células derivadas de la médula ósea durante el desarrollo de la vasculatura del tumor [37]. Por lo tanto, hemos tratado de determinar si la señalización de Hh contribuye a este proceso en el PDAC. Con el fin de rastrear las células derivadas-BM, se implantó xenoinjertos KP-1N en ratones quiméricos con GFP marcado BM (modelo de trasplante de médula ósea GFP-; ver Métodos). Ciclopamina disminuyó significativamente el reclutamiento de células derivadas-BM en los xenoinjertos en un 60% en comparación con los tumores de control (Figura 3A).
(AD) ratones GFP-BMT-quiméricos que llevan xenoinjertos KP-1N fueron tratados con o sin ciclopamina. El reclutamiento de células derivadas-BM en el tumor fue localizado por inmunotinción con anti-GFP (A). Los datos se muestran como la media ± SEM de los números de las buenas prácticas agrarias
+ células. Las barras de escala; 100 micras. tejidos de xenoinjerto de KP-1N se inmunotiñeron con Gli2 (B), CD31, VE-cadherina o NG2 (C), en combinación con GFP. Las barras de escala; 100 micras. Que se muestran son la media ± SEM de GFP
+ células reclutadas para CD31
+ vasos del tumor (
panel superior
) y el número de GFP
+ células co-localizada con CD31, VE-cadherina
+, y NG2 (
panel inferior
).
Entre la familia de factores de transcripción Gli, el control de la degradación de Gli2 y transformación en su forma represor definir la señalización Hh la respuesta [38]. proteína Gli2 se procesa y se degrada en ausencia de ligando Hh, mientras que la presencia de ligando Hh promueve Smo enriquecimiento en cilios primarios [39], lo que resulta en la translocación nuclear de longitud completa, la proteína Gli2 transcripcionalmente competente [40]. Por lo tanto, se evaluó el efecto de ciclopamina en la proteína Gli2 a través de análisis de inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo contra la forma de longitud completa de Gli2 [41] (Figura S5A). células derivadas-BM expresan longitud completa de proteínas Gli2 y ciclopamina disminuyó tanto el número absoluto y la proporción relativa de células derivadas-BM positivos GLI2 (Figura 3B), lo que indica que la señalización de Hh se activa en células derivadas-BM en un ciclopamina sensible (Smo -dependiente) forma. proteína Ptch1 también se observó en células derivadas-BM, así como en las células cancerosas y la ciclopamina redujo la expresión Ptch1 en el compartimiento del estroma (Figura S5B). Pero no hemos podido demostrar la expresión de proteínas Gli1 fuerte en el tejido de xenoinjerto (datos no mostrados).
En los tumores de control, las células derivadas BM-GFP-positivas están estrechamente asociados con CD31
+ vasos tumorales, pero no son incorporado al lumen de las vasculaturas (Figura 3C). Por otra parte, un subconjunto de células derivadas-BM co-expresaron VE-cadherina que demuestra que las células derivadas-BM no sólo son reclutados al área peri-vasculares sino también dar lugar directamente al endotelio del tumor. El proteoglicano NG2 se expresa por pericitos nacientes durante las primeras etapas de la angiogénesis, y un subconjunto de células derivadas-BM en los tumores de xenoinjerto de co-expresado NG2. Estos resultados indican que las células derivadas-BM contribuyen al desarrollo de la vasculatura del tumor, no sólo por que da lugar a tipo específico de células, sino también mediante la asociación de diferentes maneras. Es de destacar que el tratamiento con ciclopamina disminuyó significativamente la integración de la GFP
+ BM derivados de células pro-angiogénicos (BMPCs) en CD31
+, VE-cadherina
+ o NG2
+ vasculatures tumorales. Se confirmó que BMPCs eran sensibles a Hh desde
in vitro
co-cultivos con células tumorales KP-1N dio lugar a una inducción ciclopamina sensible de Gli1 ARNm /Ptch1 en BMPCs, pero no en la línea de células endoteliales maduras EM -1 (Figura S6 y datos no presentados). Tomados en conjunto, estos resultados indican que la vía de Hh juega un papel en la neovascularización mediante la modulación de la incorporación de células pro-angiogénicos (precursor) BM-derivados en los vasos tumorales.
Tumor-Derivado Hh promueve la migración de BM- las células derivadas pro-angiogénicos
in vitro
y
en Vivo
especulamos que los números disminuidos de células derivadas-BM en los tumores tratados con ciclopamina podrían ser el resultado de movilización atenuada de las células de la BM. Sin embargo, el número de BMPCs circulantes, tal como se mide mediante el etiquetado cultivadas MNCs de sangre periférica con acLDL B4 /isolectina [42], no se redujo significativamente en presencia de ciclopamina (Figura S6). Este hallazgo sugiere que Hh podría regular directamente el reclutamiento, la diferenciación, o migración de precursores para BMPCs dentro del microambiente del tumor en lugar de afectar la movilización de los precursores de la médula ósea.
Dado que la inhibición de la señalización de Hh no afectó a la movilización de la BMPCs, tratamos de investigar los mecanismos por los que la señalización de Hh podría elevar su incorporación a la vasculatura tumoral. Para ello, se examinaron los efectos de la señalización Hh sobre la migración de los precursores. La migración de BMPCs través de una membrana transwell
in vitro
se midió en presencia de KP-1 N en el pocillo inferior. CMNMO cultivadas que expresan c-Kit, CD11b y VE-cadherina se utilizaron como los precursores de BMPCs (Figura S6). El número de la BMPCs la migración a la parte inferior de la membrana fue significativamente mayor cuando se co-cultivaron con KP-1 N en comparación con las células pro-angiogénicos sin KP-1 N, lo que implica que los factores secretados a partir de las células PDAC pueden mejorar la migración de los precursores (Figura 4A). Consistente con un papel de la ruta de Hh-Smo, el preacondicionamiento de la BMPCs con ciclopamina reducido drásticamente su capacidad de migrar de una manera dependiente de la dosis (Figura 4A). Para abordar directamente la función de señalización SMO-dependiente en las células pro-angiogénicos derivados-BM, hemos utilizado las células de MO infectados con una orientación lentivirus shRNA Smo (Figura 4B). Supresión del Smo atenuó significativamente su migración a las células tumorales KP-1N. El papel de Shh derivado de tumor en la migración de los precursores también se confirmó mediante el uso de un anticuerpo neutralizante Shh (Figura 4C).
(A-B) La migración de las células pre-angiogénicos BM-derivados (BMPCs) se evaluó. CMNMO cultivaron en medio EGM2-MV para 4 días y las células unidas fueron sembradas en transwell (5 micras de poro) recubiertas con 0,1% de gelatina, y las células KP-1N se sembraron en el pocillo inferior. Número de células migradas en la parte inferior de la membrana se cuantificó mediante tinción con DAPI después de 18 h de incubación. Los BMPCs se pretrataron con ciclopamina (A), shRNA lentivirus para Smo (B), y anti-Shh y /o anti-VEGF anticuerpo neutralizante (C) cuando se sembró en el pozo. Para un control positivo, se añadió VEGF humano (50 ng /ml) al pocillo inferior, y los BMPCs se cultivaron solo como control negativo.
Con el fin de dilucidar los efectos de la modulación de la vía Smo sobre la migración de la BMPCs
in vivo
, hemos realizado ensayos de enchufe matrigel. Cuando sobrenadante concentrado de células KP-1N mezclados con matrigel se implantó por vía subcutánea en ratones desnudos, el número de células huésped que migran en el matrigel se incrementó significativamente, y las células forma una estructura similar a un cordón, imitando la morfogénesis capilar
in vivo
(Figura 5A). Con el fin de distinguir las células derivadas de BM de otras células del estroma, se repitió el experimento mediante la utilización de otros ratones quiméricos que fueron sometidos a BMT. Desde que se observó significativa expresión Tie2 mRNA en las células pro-angiogénicos derivados-BM utilizados en
in vitro
(datos no presentados), los ratones Tie2 /LacZ se utilizaron ensayos como donantes para el trasplante de médula ósea [42]. Una gran fracción de las células dentro de matrigel originó a partir de BM como se refleja por la inmunotinción positiva para β-gal (Figura 5B). La migración de células huésped en tapones de Matrigel fue significativamente atenuada cuando se añadió a la ciclopamina matrigel. Un resultado similar se obtuvo también el uso de un anticuerpo anti-Shh (datos no mostrados).
ensayo de tapón de Matrigel utilizando Tie2 /LacZ-BMT ratones desnudos quiméricos. el factor de crecimiento reducido Matrigel mezclado con medio concentrado acondicionado de KP-1N (CM
KP-1N) fue trasplantado en los ratones quiméricos. En los grupos experimentales, matrigel también se mezcló con ciclopamina. (A) la morfogénesis capilar dentro de la matrigel se cuantificó por el número de puntos de ramificación en las secciones de H-E. (B) Matrigel se immunostained con β-gal. Se muestra son la media ± SEM de células positivas β-gal.
En conjunto, nuestros resultados demuestran que la inhibición de la señalización de Hh derivado del tumor conduce a la inhibición de la angiogénesis tumoral y la desestabilización de la vasculatura con una disminución concomitante en el reclutamiento de BMPCs en el estroma tumoral.
Reglamento de pro y anti-angiogénicos factores de señalización Hh
Para identificar las bases moleculares de la alteración vascular mediante el bloqueo de Hh, que cuantifica los niveles de expresión de ARNm de factores pro y anti-angiogénicos en xenoinjertos PDAC utilizando especies específicas de los conjuntos de cebador /sonda para qPCR. En concreto, teníamos curiosidad por conocer los niveles de VEGF y SDF-1, que se consideran factores pro-angiogénicos, debido a sus efectos demostrados sobre el reclutamiento y la retención de las células precursoras de pro-angiogénicos en los sitios de formación de tumores [34], [ ,,,0],43].
Hemos encontrado que VEGF humano y SDF-1 la expresión de ARNm se redujeron en 31% y 33%, respectivamente, en los tumores tratados con ciclopamina (Figura S7). Estos resultados están en contraste con la modesta regulación a la baja de VEGF y SDF-1 mRNA en células KP-1N tratadas con ciclopamina
in vitro
, ya sea en condiciones de normoxia o hipoxia (Figura S8). Del mismo modo, la estabilidad de HIF-1α no se vio afectada en condiciones hipóxicas
in vitro
. Por otra parte, el bloqueo de Shh mediante la neutralización de anticuerpo no causó una reducción en ARNm de VEGF en las células KP-1N, lo que sugiere que la señalización de Shh autocrina no imparte un fenotipo angiogénico directamente en la KP-1 N (Figura S8). En lugar de ello, estos resultados colectivos sugieren que la señalización Hh incide sobre el estroma y que los factores estromales derivados podría contribuir a la expresión de VEGF y SDF-1 en las células tumorales
in vivo
.
se ha demostrado que el cáncer asociado fibroblastos secretan SDF-1 para reclutar células precursoras endoteliales derivadas de la médula ósea en el estroma del tumor con el fin de mediar la angiogénesis [44]. Por lo tanto, el próximo cuantificó la expresión de estos factores pro /anti-angiogénicos por el estroma tumoral murino. Ratón de VEGF y los niveles de SDF-1 no fueron afectados por la ciclopamina
in vivo
(Figura 6A), lo que indica que Hh no está involucrado en la modulación de estos factores pro-angiogénicos por estroma tumoral.
expresiones (A) de ARNm de pro- murino /factores anti-angiogénicos en xenoinjertos fueron cuantificados por qPCR. (B, C) ensayo de co-cultivo se realizó utilizando trenswell. células pro-angiogénicos derivados BM-(BMPCs) se infectaron con un control que expresa lentivirus shRNA o Smo shRNA y co-cultivo con células PK-1N sembradas sobre transwell (0,4 micras). El ARN se extrae de la BMPCs 12 h después de qPCR (normalizado a las células sin KP-1 N). (D) ensayo de formación de tubo se realizó por cultivo de MS-1 en Matrigel en presencia o ausencia de BMPCs GFP marcado. se observó la morfogénesis capilar después de 8 h de incubación con o sin anti-IGF-1 de anticuerpos neutralizantes. Barra de escala, 500 micras. Se cuantificó el número de puntos de ramificación y la incorporación de los BMPCs en el tubo.
A continuación examinó la expresión de factores que modulan la estabilidad vascular. En los tumores de los ratones tratados con ciclopamina, se observó una marcada reducción en murino Ang-1, IGF-1, y PDGF-B mRNA, factores conocidos para estabilizar la neovasculatura. Ang-1 juega un papel crucial durante la angiogénesis para estabilizar los neovasos [30], y sus afines receptor Tie2 se expresa en ECs, monocitos pro-angiogénicos, así como precursores de pericitos de origen mesenquimal [45]. La reducción de Ang-1 se acopló con 86,3% upregulation de Ang-2, un antagonista natural para Tie2, que conduce a la disociación del recubrimiento de células mural para iniciar la angiogénesis [46] (Figura S9). En un esfuerzo por comprender la regulación de estos factores de señalización Hh, se compararon sus niveles de mRNA en BMPCs que fueron co-cultivadas con células PK-1N. se observó Ang-1 y IGF-1 pero no PEDF-B mRNA se upregulated en más de 2 veces de una manera ciclopamina sensible (Figura 6B), y la regulación por disminución simultánea de Ang-2 mRNA en los precursores. La expresión alterada de Ang-1 y Ang-2 fue cancelada por la ciclopamina, y el efecto sobre Ang-1 /relación de Ang-2 fue dramático (reducción del 54,3%; Figura S9). De conformidad resultados se observaron cuando nos centramos en Smo en los precursores derivados-BM por lentiviral shRNA, lo que confirma que la alteración de Ang-1 la expresión génica mediante ciclopamina era debido al bloqueo de la vía SMO-dependiente (Figura 6C). Por lo tanto, depende de señalización Hh-Ang-1 /Tie2 parece ser uno de los posibles mecanismos por los cuales estabilizan BMPCs neovasos.
IGF-1 es un blanco de Hh señalización en las células pro-angiogénicos derivados BM-
La reducción en el ARNm de IGF-1 que hemos observado en los xenoinjertos tratados con ciclopamina (Figura 6A) también fue recapitulado en los ensayos de co-cultivo; es decir, la fuerte inducción de IGF-1 en BMPCs por factores derivados de KP-1N se bloqueó de manera significativa, ya sea por la ciclopamina o shRNA contra Smo (Figura 6B, C). Para verificar el papel de IGF-1 durante la neovascularización, un ensayo de formación de tubo se realizó mediante MS-1 (madura de ratón línea CE) con derivados de BM precursores pro-angiogénicos GFP-etiquetados (Figura 6D). morfogénesis capilar por MS-1 fue inducida por la BMPCs, y el efecto se potenció cuando fueron acondicionados previamente en la presencia de células KP-1N. Sorprendentemente, el efecto sobre la formación de capilares se redujo significativamente tras el tratamiento con un anticuerpo neutralizante anti-IGF-1. Por lo tanto, el IGF-1 es un objetivo importante de la señalización de Hh en células derivadas-BM, y la regulación a la baja de IGF-1 en xenoinjertos tumorales mediante el tratamiento con ciclopamina podría contribuir a la alteración de la angiogénesis.
Discusión
En el presente estudio, se identificaron las células pro-angiogénicos derivados-BM (BMPCs) como uno de los objetivos paracrinos de Hh, que desempeña un papel fundamental para promover la angiogénesis tumoral y la progresión tumoral. La vasculatura tumoral desestabilizado que hemos observado tras el tratamiento con ciclopamina primera nos lleva a especular que podríamos observar una reducción en el estroma de Ang-1 e IGF-1, factores que se sabe están regulados por vía de Hh [47], [48].
Ang-1 se desarrolla y se estabiliza el sistema vascular primitivo bajo señalización Hh en el pulmón morfogénesis [49] ramificación y Shh aumenta los niveles de mRNA de Ang-1 en fibroblastos, pero disminuyó Ang-2 [47], [50]. Nuestro experimento de co-cultivo demostró Ang-1 mRNA en BMPCs se upregulated por factores solubles de KP-1N de una manera Smo-dependiente, lo que sugiere un papel de los precursores como depósito de Ang-1 en el microambiente tumoral para estabilizar Tie2-expresión de ECs así como subconjuntos de células pro-angiogénicos. De hecho, una cierta fracción de células derivadas-BM también expresan Tie-2 receptor [51], el apoyo un efecto autocrina o paracrina alternativa en la su actividad angiogénica por el estroma circundante a través de Ang-1 ligando.
Hay diversas fuentes celulares de IGF-1 en el estroma del tumor, y la reducción en el estroma derivadas de IGF-1 que observamos puede explicar la inhibición del crecimiento de células PDAC
in vivo
cuando la señalización de Hh se bloqueó [27]. IGF-1 también puede mejorar la actividad de las células derivadas-BM para promover la neovascularización través de PI3K /Akt señalización [52]. En el estudio actual, la mejora de la morfogénesis de las células capilares MS-1 por las células estimuladas con BMPCs PDAC fue claramente atenuado por anti-IGF-1 (Figura 5D). Por lo tanto, IGF-1 parece ser uno de los objetivos fundamentales de la señalización de Hh en el BMPCs y media su efecto sobre la neovascularización. Hubo una reducción significativa en la expresión de PDGF-B en el estroma del tumor
in vivo
así como en BMPCs
in vitro
; Sin embargo, nuestro ensayo de co-cultivo de BMPCs con KP-1N no demostró la regulación positiva de PDGF B-ARNm, lo que sugiere que el ligando Hh derivados del cáncer es poco probable que juegue un papel importante en la inducción de PDGF-B. Sin embargo, la regulación a la baja de PDGF-B por la ciclopamina puede parcialmente explicar el reclutamiento reducido de pericitos en la red vascular de nueva formación en xenoinjertos.
Los mecanismos moleculares que hemos descubierto aquí demuestran claramente que la señalización de Hh juega un papel paracrino en la progresión del tumor. Recientemente se ha informado de que la inducción transcripcional de Gli puede mantenerse independiente de Smo [24], y la regulación no canónica de los genes Gli-diana está mediada en parte a través de TGF-β y la señalización de Kras. De hecho, la mayoría de las células, incluyendo PDAC KP-1 N, expresan Kras oncogénicos y se ha demostrado que la vía de TGF-β-Smad se activa en las células KP-1N [53]. Estas vías pueden dar cuenta de la modesta reducción de la transcripción por Gli1 ciclopamina que observamos. También es posible que el
inhibición del crecimiento in vivo por Hh bloqueo que se observó podría ser mediada a través de un efecto en la propiedad de auto-renovación de PDAC iniciar raras células [54]. Sin embargo, el cambio significativo en la cinética de proliferación /muerte que hemos observado en una gran proporción de las células cancerosas en los xenoinjertos tratados con cyclopaminewas claramente acompañados por la inhibición de la angiogénesis.
La ciclopamina no sólo atenúa la contratación de derivados BM- células al tumor, sino también a su incorporación en la vasculatura del tumor, el apoyo a una participación de Hh en la angiogénesis asociada a tumores. Nuestros datos no apoyan la idea de que la señalización autocrina de Hh en las células cancerosas contribuye a la angiogénesis tumoral, y más bien sugieren que Hh actúa exclusivamente en el estroma. Shh se ha demostrado para controlar directamente la actividad de las células BMPCs mediante la estimulación de su proliferación, la migración y la inducción de factores angiogénicos para promover la remodelación vascular [26], [29], [55]. Hemos demostrado que los factores secretados por las células PDAC pueden mejorar la migración de las células precursoras al menos en parte de una manera dependiente de Smo. Hubo un efecto adicional de la señalización de Hh en el conjunto de CE a través de una activación de los BMPCs junto con la brotación ECs maduro. Hemos demostrado anteriormente que Shh puede aumentar la actividad de los precursores para promover la morfogénesis capilar por HUVEC [26].