Extracto
El extracto de jengibre (
Zingiber officinale Roscoe
) y su principal componentes picantes, [6] -shogaol y [6] -gingerol, se ha demostrado que tienen un efecto anti-proliferativo en varias líneas de células tumorales. Sin embargo, la actividad anticancerígena del extracto de jengibre en el cáncer de páncreas es poco conocida. Aquí, se demuestra que los materiales de etanol extraído de jengibre suprimen la progresión del ciclo celular y por lo tanto inducen la muerte de líneas celulares de cáncer de páncreas humano, incluyendo las células Panc-1. El mecanismo subyacente implicaba AutoSIS, una forma recientemente caracterizada de la muerte celular, pero no apoptosis o necroptosis. El extracto aumentó notablemente la relación de LC3-II /LC3-I, la disminución de proteína /p62 SQSTM1, y mejoró la vacuolización del citoplasma en células Panc-1. Se activa AMPK, un regulador positivo de la autofagia, y mTOR inhibe, un regulador negativo de la autofagia. Los inhibidores de la autofagia 3-metiladenina y cloroquina prevenir parcialmente la muerte celular. Morfológicamente, sin embargo, la rotura de membranas focal, la contracción nuclear, inflamación focal del espacio perinuclear y las mitocondrias densas de electrones, que son características morfológicas únicas de AutoSIS, se observaron. El extracto de especies reactivas de oxígeno mejoradas (ROS) de generación, y el antioxidante N-acetilcisteína muerte celular atenuada. Nuestro estudio reveló que la administración intraperitoneal diaria del extracto de supervivencia prolongada significativamente (P = 0,0069) en un modelo de diseminación peritoneal y suprimió el crecimiento tumoral en un modelo ortotópico de cáncer de páncreas (P & lt; 0,01) sin efectos adversos graves. Aunque [6] -shogaol pero no [6] gingerol mostraron efectos similares, cromatografía de análisis sugirió la presencia de otro constituyente (s) como sustancias activas. En conjunto, estos resultados muestran que el extracto de jengibre tiene actividad anticancerosa potente contra las células de cáncer de páncreas mediante la inducción de AutoSIS y garantiza ROS mediada por una mayor investigación con el fin de desarrollar un fármaco candidato eficaz
Visto:. Akimoto M, M Iizuka, Kanematsu R, M Yoshida, Takenaga K (2015) Anticancer Efecto del extracto de jengibre contra las células del cáncer pancreático Principalmente a través de especies reactivas de oxígeno mediada Autotic muerte celular. PLoS ONE 10 (5): e0126605. doi: 10.1371 /journal.pone.0126605
Editor Académico: Guillermo Velasco, Universidad Complutense, ESPAÑA
Recibido: 6 Enero, 2015; Aceptado: 5 Abril 2015; Publicado: 11-may 2015
Derechos de Autor © 2015 Akimoto et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones-en-Aid de: Proyecto de Shimane Universidad "SUIGANN" (http://www.shimane-u.ac .jp) (KT); Investigación Científica del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología, Japón (http://www.mext.go.jp) (sin 25.430.110 de KT.); y Japón Fundación de Investigación de Arteriosclerosis (KT). Este trabajo fue apoyado también por el apoyo para el Super Ciencia Escuelas Secundarias de la Agencia de Tecnología y Ciencia de Japón a la escuela secundaria Izumo (http://rikai.jst.go.jp) (KT). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es una neoplasia muy agresiva con muchas quimioterapia y radioterapia fenotipos resistentes. La incidencia de cáncer de páncreas aumenta anualmente en todo el mundo, convirtiéndose en la cuarta causa más común de muerte por cáncer en el mundo. De hecho, el número estimado de nuevos casos de cáncer de páncreas fue de 277.000 en 2008 y 338.000 en 2012, y hubo 266.000 muertes por cáncer de páncreas en 2008 y 331.000 muertes por cáncer de páncreas en 2012 [1, 2]. Como la mayoría de los pacientes con cáncer pancreático se diagnostica en una etapa inoperable [3, 4], la tasa de supervivencia relativa a 5 años en general es baja, y el tiempo de supervivencia media es de sólo 6 meses, incluso en pacientes que reciben tratamiento de calidad. Con el fin de obtener nuevos clientes potenciales para el desarrollo de estrategias preventivas y terapéuticas, muchos esfuerzos de investigación se han centrado en la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la progresión del cáncer de páncreas [3, 4].
El jengibre (
Zingiber officinale Roscoe
), una planta perenne rizomatosa, se utiliza ampliamente como una especia en alimentos y bebidas y se utiliza principalmente como un remedio para trastornos digestivos, incluyendo dispepsia, náuseas, gastritis, vómitos, cólico y diarrea [5, 6]. Extracto de jengibre y sus componentes picantes, tales como [6] gingerol y [6] -shogaol, también se sabe que presentan muchos efectos biológicos incluyendo anti-inflamación, antioxidación y la actividad contra el cáncer [5, 6]. Debido a su fuerte actividad anti-inflamatoria, el jengibre ha elaborado recientemente la atención como un remedio para la osteoartritis y la artritis reumatoide [7, 8]. Con respecto a la actividad contra el cáncer, el jengibre y de sus componentes se ha demostrado que inhibe la proliferación de e inducir la apoptosis de una variedad de tipos celulares de cáncer
in vitro
[9-15]. Además, el uso de jengibre para la quimioprevención del cáncer colorrectal ha atraído la atención [16-18]. Sin embargo, la actividad anticancerígena de extracto de jengibre y de sus componentes contra el cáncer de páncreas ha sido poco investigado.
En este estudio, hemos examinado la actividad anticancerígena de extracto de jengibre contra las células del cáncer pancreático tanto
in vitro
y
in vivo
e investigado su potencial mecanismo. En este caso, nos informan de que el extracto de jengibre conduce a la reducción de la viabilidad celular y el crecimiento tumoral de las células Panc-1, principalmente a través AutoSIS mediada por ROS, una forma reciente caracterización de la muerte celular.
Materiales y Métodos
células y cultivo celular
células de cáncer pancreático humano, células de cáncer de páncreas de ratones Panc-1, ASPC-1, BxPC-3, Capan-2, CFPAC-1, MiaPaCa-2 y SW1990, y, Panc02 , se utilizaron en este estudio. Se obtuvieron células Panc-1 y MIAPaCa-2 de la RIKEN BRC Cell Bank (Tsukuba, Japón), y otras líneas de células pancreáticas humanas se adquirieron de ATCC (Manassas, VA). Panc02 células fueron amablemente proporcionados por el Dr. T. Hollingsworth, Universidad de Nebraska Medical Center [19, 20]. células Panc-1-Luc-ZsGreen y células Panc02-Luc-ZsGreen que expresan luciferasa de luciérnaga y ZsGreen fueron establecidas por transducción lentiviral del plásmido pHIV-Luc-ZsGreen, que se ha depositado con Addgene (http://www.addgene.org /Bryan_Welm /), y la posterior clonación. las células epiteliales alveolares pulmonares humanas (HPAEpiC) fueron adquiridos de Sciencell (Carlsbad, CA, EE.UU.) y se mantuvieron en medio de las células epiteliales alveolares (AEpiCM) suplementado con suero de 2% de bovino fetal (FBS), suplemento de crecimiento de células epiteliales (EpiCGS) y penicilina /estreptomicina. células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) se obtuvieron de Lonza Walersville, Inc. (Walkersville, MD, EE.UU.) y se cultivaron en EBM-2 suplementado con EGM SingleQuats (Lonza). Las mitocondrias de ADN menos P29 (ρ
0P29) las células y las células cíbrido P29mtP29 que se reintrodujeron con ADNmt P29 en ρ
se establecieron 0P29 células de carcinoma de pulmón de Lewis células P29 [21]. células de cáncer de colon (Colo320DM, HT29, LoVo, LS174T, SW480, SW620) [22], células de cáncer gástrico (MKN1, MKN45) [23], las células de cáncer de pulmón (A549, QG56, PC-10, PC-1) [24 ], células de cáncer de mama (MCF7, BT549, MDA-MB-231, MDA-MB-468) [25, 26], células de leucemia (THP-1, K562) [27], células de osteosarcoma (Saos-2) [28 también se utilizaron], células de cáncer cervical (HeLa) [29], células de hepatoma (HepG2) [30], células de fibrosarcoma (HT1080) [29], y las células LUM1 de carcinoma de colon de ratón derivadas de dos puntos 26 tumor [31] en este estudio . HT29, LS174T, SW480, SW620 y MDA-MB-468 se adquirieron de ATCC. células MCF7 y HT1080 se obtuvieron del Banco de Células JCRB. células THP-1 y K562 fueron amablemente proporcionados por el Dr. Y. Honma, Shimane Facultad de Medicina de la Universidad. líneas celulares de cáncer gástrico fueron suministrados por el Departamento de Patología (Dr. S. Morikawa), Shimane Facultad de Medicina de la Universidad. Otras líneas celulares fueron suministrados por el Dr. A. Nakagawara, Chiba Centro del Cáncer del Instituto de Investigación. Características de las líneas celulares utilizadas en este estudio se describen en otra parte [19 a 31]. líneas celulares de leucemia se cultivaron en medio RPMI1640 que contiene suero 10% inactivado por calor bovino fetal (FBS) y 40 mg /ml de gentamicina. Otras líneas celulares se cultivaron en medio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) que contiene 10% de FBS y 40 mg /ml de gentamicina en una atmósfera humidificada con 21% O
2/5% de CO
2 (normoxia) o 1% O
2/5% de CO
2 (hipoxia). condiciones de cultivo hipóxicas se lograron en una junta automática humidificado
2 /CO
2 incubadora (Wakenyaku, Kyoto, Japón).
Reactivos
[6] -shogaol y [6 ] -gingerol fueron adquiridos de TOKIWA FITOQUÍMICO CO., Ltd. (Chiba, Japón).
Preparación de extracto de jengibre (SEEH)
polvo seco de las partes fundamentales de Syussai Shoga (jengibre en japonés), que se cultiva en la zona Hikawa en Izumo, la prefectura de Shimane, se extrajo con etanol (10: 1; volumen de peso) durante 20 minutos en un baño de agua sonicación. El etanol se evaporó a 80 ° C para producir un extracto de etanol crudo del jengibre (referido como SEEH). El extracto se pesó y se disolvió en etanol o dimetilsulfóxido (DMSO) a la concentración deseada.
crecimiento celular y ensayo de viabilidad
El crecimiento celular y la viabilidad se midió usando el MTT (3- (4 , 5-dimetiltiazol-2-il) bromuro) de ensayo -2,5-difeniltetrazolio. Brevemente, las células (2x10
4 células /pocillo) se cultivaron en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos y se trataron por triplicado en 100 l DMEM /FBS al 10% que contiene diferentes concentraciones de SEEH o disolvente solo durante el período indicado. Al final de la incubación, se añadieron 10 l de MTT (2,5 mg /ml) (Sigma-Aldrich Japan, Tokio, Japón) a los pocillos para permitir la formación de cristales de formazán de MTT durante 4 h. Después se retiró el medio, los cristales se solubilizaron en 100 l de DMSO. La absorbancia se registró a 550 nm. La viabilidad celular también se ensayó mediante un ensayo de exclusión de colorante azul de tripano.
ciclo celular análisis
células Panc-1 tratados con SEEH durante 20 h fueron fijadas en etanol al 70% y se almacenaron a -20 ° C hasta su uso. Las células fijadas se lavaron con PBS de Dulbecco (DPBS) y se incubaron con 100 mg /ml de RNasa A y 50 mg /ml PI (Sigma-Aldrich Japón). Las células se sometieron después a análisis de citometría de flujo utilizando un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ).
Medición del potencial de membrana mitocondrial
potencial de membrana Las mitocondrias se controló por la JC- 1 membrana mitocondrial Kit de ensayo de potencial (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). Para este ensayo, se añadieron 100 l /ml de la solución de tinción JC-1 a las células Panc-1 tratados con SEEH durante 20 h en placas de 6 pocillos, y se incubaron las células durante 15 min. Después, las células se separaron mediante tripsinización, se lavaron dos veces con el tampón de ensayo, y después se sometieron a citometría de flujo.
anexina V /yoduro de propidio (PI) tinción
La Anexina V-FITC Apoptosis Kit de detección (Beckman Coulter Inc., Pasadena, CA) se utilizó para detectar la anexina V y /o células de PI positivas. Brevemente, las células Panc-1 se lavaron con DPBS enfriado con hielo y después se tiñeron con Anexina V-FITC durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad y PI en helado de tampón de unión. células anexina V y /o PI-positivos se contaron usando un flujo FACS Calibur citómetro.
Medición de la generación de ROS
La producción de ROS se controló mediante citometría de flujo con 2 ', 7 pies diacetato dichlorodihydrofluorescein (H2DCFDA) (Molecular Probe-Life Technologies, Carlsbad, CA) y el indicador de dismutasa mitocondrial MitoSOX Roja (Invitrogen) como sondas. Brevemente, Panc-1 células tratadas con SEEH se incubaron con 10 M de H2DCFDA o 5 M de MitoSOX Red en DMEM libre de suero durante 10 min. Se retiró el medio, y las células fueron separadas con un breve tratamiento de 0,25% de tripsina en solución salina equilibrada de Hank. Después de la adición de medio de cultivo fresco, las células se recogieron por centrifugación, se lavaron una vez con DPBS y se suspendieron en DPBS. La fluorescencia se monitorizó utilizando el citómetro de flujo FACSCalibur o con un microscopio confocal láser (Fluoview FV1000, Olympus, Tokio).
Western blotting
Los extractos celulares se prepararon por lisis de las células con tampón RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 150 mM, 1% NP-40, 0,5% desoxicolato, 0,1% de dodecil sulfato de sodio, EDTA 2 mM, cóctel inhibidor de la proteasa y fosfatasa cóctel inhibidor) en hielo durante 20 min. Los lisados se centrifugaron a 12.000 ×
g
durante 10 min a 4 ° C, y los sobrenadantes se utilizaron para análisis posteriores. análisis de inmunotransferencia de electroforesis en gel y SDS-poliacrilamida se realizaron como se describe anteriormente [32]. Los anticuerpos primarios utilizados fueron monoclonal de conejo anti-SQSTM1 /p62 (D5E2, dilución 1: 1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), policlonal de conejo anti-LC3B (dilución 1: 1000, Cell Signaling), policlonal de conejo anti-fosfo mTOR (S2481) (1: 1000 dilución, Señalización celular), monoclonal de conejo anti-mTOR (7C10, dilución 1: 1000, Cell Signaling), monoclonal de conejo anti-fosfo-AMPKα (T172) (40H9, dilución 1: 1000, Cell Señalización), y monoclonal anticuerpo de conejo anti-AMPKα (23A3, 1: 1000 dilución, Señalización celular). Los anticuerpos secundarios fueron conejo conjugado con HRP o anti-IgG de ratón (dilución 1: 3000, Cell Signaling). Para los controles de carga, anticuerpo anti-β-actina (sc-47778, dilución 1: 3.000, Santa Cruz Biotechnology) se utilizó. Las señales se visualizaron utilizando ECL plus (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido). Las membranas fueron escaneados con un Analizador de Luminoimaging LAS4000 (GE Healthcare).
Inmunofluorescencia tinción
células Panc-1 tratadas con disolvente solo o SEEH se fijaron con 4% de sacarosa formaldehído /5% en DPBS durante 20 minutos, se aclaró con DPBS, y se permeabilizaron con 0,5% Triton X-100 en DPBS para 4 min. En algunos experimentos, las células se tiñeron con 100 nM de MitoTracker Red CMXRos (Invitrogen) durante 10 minutos antes de la fijación. Las células se bloquearon con 3% de BSA /0,1% de glicina en DPBS durante 1 h, se enjuagaron, y después se incubaron con anticuerpo monoclonal de conejo anti-AIF (D39D2, dilución 1: 200, la señalización celular) o anticuerpo anti-LC3B policlonal de conejo (1: 200 dilución) durante 1 h. Después de un extenso lavado con DPBS, las células se incubaron con Alexa Fluor 488 cabra conjugado con IgG anti-conejo (dilución 1: 300, Invitrogen) durante 1 h. Las células se contratiñeron con DAPI y se observaron bajo un microscopio confocal de barrido láser.
microscopía electrónica de transmisión (TEM) análisis
no tratados células Panc-1 y las células tratadas con 200 mg /ml para SEEH 28 h se colocaron en 2% de paraformaldehído y 2% glutaraldehído en tampón 30 mM HEPES (HEPES 30 mM, NaCl 100 mM, CaCl 2 mM
2, pH 7,4) durante 2 horas a 4 ° C y post-fijaron con 1 % OSO
4 durante 1 hora a 4 ° C. Las muestras se deshidrataron con alcohol graduado y se embebieron en resina TAAB812 (TAAB Laboratorios Equipment Ltd., Berkshire, UK). Ultrathin secciones se tiñeron durante 1 h en acetato de uranilo acuoso al 3%, se lavaron y se contratiñeron con 0,3% de citrato de plomo, y se examinaron en un microscopio electrónico de transmisión (EM-002B, JEOL Ltd., Tokio, Japón).
plásmido GFP-LC3 y transfección
plásmido de fusión EGFP-LC3B (pCMX-SAH /Y145F-LC3B-GFP) se construyó clonando cDNA LC3B, que fue amplificado por PCR, en un pCMX-SAH /Y145F-GFP vector [33]. La construcción se verificó por secuenciación de ADN. Panc-1 ells fueron transfectadas transitoriamente con el plásmido usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen-Life Technologies, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. Después de 24 h, las células fueron expuestas a SEEH y se examinan bajo un microscopio confocal de barrido láser.
Los experimentos con animales
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales para el cuidado y uso de la investigación con animales. El protocolo fue aprobado por el Comité IZUMO Campus Animal Cuidado y Uso de la Universidad de Shimane (Número de Permiso: IZ26-7). Todos los animales fueron alojados en el Centro de Animales de Shimane University Facultad de Medicina bajo condiciones específicas libres de patógenos a una temperatura controlada de 23 ± 2 ° C, humedad relativa de 55 ± 10%, y con 12 h de luz /12 h oscuridad ciclos. Se les dio comida y agua
ad libitum
. Los ratones fueron controlados para su salud durante todo el período experimental, al menos, una vez al día después de la inyección del tumor. Toda la cirugía se realizó bajo la medetomidina (0,3 mg /kg) /midazolam (4,0 mg /kg) /butorfanol (5,0 mg /kg) la anestesia. Los ratones fueron sacrificados por normalmente CO
2 de inhalación en el extremo de un estudio. Se inyectaron para el modelo de diseminación peritoneal, células Panc02-Luc-ZsGreen (5x10
5 células /ratón) por vía intraperitoneal como una suspensión de células en ratones C57BL 6 ratones 7 semanas de edad, macho /(CREA Japón, Tokio, Japón), y los ratones se aleatorizaron y se agrupan en el control (n = 8) y los grupos de SEEH (n = 8). Los regímenes de tratamiento se iniciaron el día después de la inoculación del tumor. Los ratones fueron sacrificados en un CO
2 cámara cuando estaban moribundos, medida por la falta de respuesta con propósito sostenida a los estímulos suaves. Se hicieron todos los esfuerzos que incluyen la administración subcutánea de meloxicam (5 mg /kg) para minimizar el sufrimiento. El experimento se realizó dos veces, y los datos combinados se sometieron a análisis. Para el modelo ortotópico de cáncer de páncreas, las células Panc-1-Luc-ZsGreen (1x10
6 células /ratón) fueron implantadas con 50% de Matrigel en el páncreas de 6 semanas de edad ratones desnudos hembra (BALB /c nu /nu, Japan SLC, Shizuoka, Japón) [32]. Una semana después de la inyección, se asignaron al azar y se agrupan en el control (n = 6) y los grupos de SEEH (n = 6). Los regímenes de tratamiento se iniciaron una semana después de la inyección del tumor. Para los experimentos de carcinoma de colon de ratón, células LUM1 (3 x 10
5 células) fueron implantados subcutáneamente en ratones Balb /c macho (n = 6 para el control y el grupo SEEH). Los volúmenes de los tumores LUM1 se evaluaron mediante la medición de dos diámetros perpendiculares con pinzas. El volumen del tumor (V) se calculó mediante la siguiente ecuación: V =
(un
2
xb) /2
, donde
a
es el pequeño diámetro y
b
el diámetro grande. En el grupo de SEEH, los ratones se les administró por vía intraperitoneal 80 mg /kg una vez al día SEEH. En el grupo control, los ratones se les administró disolvente solo en DPBS.
Bioluminiscente de imágenes
En vivo
bioluminiscente de imágenes se realizó utilizando el sistema de imágenes IVIS (Caliper Life Sciences, Hopkinton , MA). Todos los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal con 150 mg /kg d-luciferina (Promega, Fitchburg, WI) y se anestesiaron con 2,5% de isoflurano. Diez minutos más tarde, los fotones de cuerpos enteros de los animales fueron imágenes utilizando el sistema de imágenes IVIS (Caliper Life Sciences) según las instrucciones del fabricante. Los datos fueron analizados por vivir la imagen del software 2.50 (Caliper Life Sciences).
hematología y bioquímica de la sangre de prueba
Los ratones fueron anestesiados, y se recogió la sangre del corazón. perfiles de sangre periférica fueron analizadas por el analizador de hematología automatizado Sysmex KX-21NV (Sysmex, Kobe, Japón). Los niveles de glóbulos blancos (WBC), glóbulos rojos (RBC), plaquetas (PLT), hemoglobina (HGB), el hematocrito (HCT), volumen corpuscular medio (VCM), hemoglobina corpuscular media (MCH), y la media de hemoglobina corpuscular se examinaron la concentración (MCHC). La glucosa (Glu) los niveles de colesterol total (T-cho), los niveles de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST), y nitrógeno de urea en sangre los niveles (BUN) se analizaron con un analizador automático de química clínica, Spotchem EZ SP- 4430 (ARKRAY, Inc., Kyoto), utilizando Spotchem II tiras reactivas.
cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (HPLC)
se lograron separaciones de cromatografía líquida utilizando una fase inversa C -18, 3 m, 2,4 x 250 mm de columna (COSMOSIL. Nakarai TESQUE, Inc., Kyoto, Japón) a una velocidad de flujo de 1 ml /min. La fase móvil fue 70% de metanol. El perfil de elución se controló mediante espectrofotometría UV a 228 nm.
El análisis estadístico
Todos los datos se presentan como la media ± desviación estándar. La significación estadística entre los conjuntos de datos fue probado por
t
de Student no pareada. La supervivencia de los ratones se analizó usando la prueba de log-rank. P & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
SEEH inhibe la progresión del ciclo celular e induce la muerte de las líneas celulares de cáncer de páncreas
El tratamiento de células Panc-1 con SEEH para 20 h dieron como resultado una detención en la fase G0 /G1 del ciclo celular (Fig 1A). Un aumento en la fracción de subG1, una característica de apoptosis, era marginal. SEEH finalmente indujo la muerte de las células Panc-1 y otras líneas celulares de cáncer de páncreas humano y de ratón (Fig 1B). Las células normales, tales como HUVEC y HPAEpiC eran más resistentes a SEEH en comparación con Panc-1 células (Fig 1C). En las últimas etapas de la muerte celular de las células Panc-1, focal ruptura de la membrana plasmática y la contracción del núcleo fueron evidentes (Fig 1D). Cabe señalar que la fragmentación del núcleo, otra característica de la apoptosis, se observa raramente en esta etapa. SEEH también fue eficaz en la inducción de la muerte de las células Panc-1 bajo condiciones de hipoxia (Figura 1E). También causó un retraso en el crecimiento significativo y la muerte en una variedad de líneas de células tumorales adicionales, tales como cáncer de colon, cáncer gástrico, cáncer de pulmón, cáncer de mama, leucemia, osteosarcoma, hepatoma, cáncer cervical y fibrosarcoma (S1 Fig).
ciclo celular
(A). células Panc-1 se trataron con vehículo solo, 100 mg /ml SEEH o 200 mg /ml para SEEH 20 h, se fijaron, se tiñeron con PI, y después se sometieron a citometría. (B) La viabilidad celular. líneas celulares de cáncer de páncreas fueron tratados sólo con vehículo o varias concentraciones de SEEH durante 42 h. La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de MTT. Barras; DAKOTA DEL SUR. (C) Efecto de SEEH sobre las células normales. HUVEC, HPAEpiC y Panc-1 células se trataron con vehículo solo o 100 mg /ml SEEH para 38 h. La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de MTT. Barras; DAKOTA DEL SUR. (D) Morfología. células Panc-1 se trataron con vehículo solo (izquierda) o 200 mg /ml SEEH durante 40 h (derecha). (E) Efecto de SEEH en células Panc-1 bajo condiciones de hipoxia. Panc-1 células fueron tratadas con vehículo solo o varias concentraciones de SEEH durante 42 horas. La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de MTT.
SEEH induce la muerte celular autotic lugar de la apoptosis en las células o necroptosis Panc-1 |
Para investigar el mecanismo por el cual SEEH indujo la muerte de Panc células -1, se investigó diversos marcadores de células apoptóticas. El ensayo de JC-1 reveló una reducción marcada del potencial de membrana mitocondrial después del tratamiento SEEH (Fig 2A). Anexina V /PI tinción también mostró un aumento en el porcentaje de células con anexina V-positivos y /o PI-positivo, dependiendo de la concentración de SEEH (Fig 2B). Sin embargo, el inhibidor pan-caspasa zVAD- FMK no aminorar la supervivencia celular (Figura 2C). Además, se escindió la caspasa 3 era apenas detectable después del tratamiento con 200 mg /ml SEEH durante 24 h. Después del tratamiento SEEH, casi el 30% de las células fueron positivas PI, mientras que el tratamiento de las células con pifithrin-μ y TRAIL activa la caspasa-3 (Figura 2D), que coincide con un informe anterior [34]. Sobre la base de los datos que sugieren que SEEH no aumentó el porcentaje de la fracción subG1 (Figura 1A), ni indujo la fragmentación de los núcleos (Fig 1D), no pudimos obtener pruebas concretas de la apoptosis en las células Panc-1 tratados con SEEH. Además, la translocación del factor inductor de apoptosis (AIF), un efector de muerte mitocondrial caspasa-independiente, en el núcleo no fue aparente (S2 Fig), y necrostatin-1, un inhibidor de RIP1 necroptosis quinasa mediada, no pudo impedir SSHE- la muerte celular inducida (Fig S2). Así pues, ni la apoptosis mitocondrias-independiente ni necroptosis estuvo involucrado en la muerte celular inducida por SEEH.
(A) el potencial de membrana mitocondrial. células Panc-1 se trataron con vehículo solo, 100 g SEEH /ml o 200 mg /SEEH ml durante 20 h y después se sometieron al ensayo de JC-1. Las células sanas con mitocondrias funcionales que contienen rojos JC-1 J-agregados y células apoptóticas o insalubres con mitocondrias colapsadas que contienen principalmente monómeros verdes JC-1 se detectaron mediante citometría. tinción (B) Anexina V /PI. células Panc-1 se trataron con vehículo solo, 100 mg /ml SEEH o 200 mg /SEEH ml durante 24 h y después se sometieron a la anexina V /tinción PI. (C) Efecto de zVAD- FMK (zVAD-) sobre la muerte celular inducida por SEEH. Se incubaron las células Panc-1 durante 42 horas. La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de MTT. Barras; DAKOTA DEL SUR. (D) la activación de la caspasa-3. células Panc-1 se incubaron con 200 mg /ml SEEH para varios períodos de tiempo o se trataron con 10 mM pifithrin-μ y 100 TRAIL ml /ng por 60 h (sirvió como control positivo). Los lisados celulares se sometieron a análisis de transferencia Western con anticuerpo anti-caspasa 3.
Por otro lado, SEEH aumentó notablemente la relación de LC3-II /LC3-I, un indicador de la formación de autophagosome, en la dosis y de manera dependiente del tiempo. SEEH también disminuyó SQSTM1 /p62 niveles de proteína, uno de los sustratos específicos degradadas a través de la vía de la autofagia-lisosomal, en células Panc-1 (Fig 3A y 3B). SEEH activa AMPK, un regulador positivo de la autofagia, y mTOR inhibe, un regulador negativo autophagic (Fig 3C y 3D). Los inhibidores de la autofagia 3-metiladenina y cloroquina prevenir parcialmente la muerte celular (Figura 3E). Morfológicamente, las células tratadas con SEEH mostraron vacuolización masiva del citoplasma aproximadamente 24 h después del tratamiento (Fig 4A). Estas vacuolas citoplásmicas eran probables autofagosomas debido puntos lagrimales GFP-LC3 apareció después del tratamiento con SEEH (figura 4B). Algunos puntos lagrimales LC3 se co-localizada con las mitocondrias MitoTracker-positiva en las células tratadas con 100 mg /ml SEEH durante 20 h, lo que sugiere la aparición de mitofagia (Fig 4C). Por lo tanto, la muerte celular inducida por SEEH parecía ser la muerte celular autofágica. Sin embargo, los análisis de TEM 28 h después del tratamiento mostró SEEH mitocondrias electrón-densos, vacuolas vacías y la hinchazón perinuclear focal (Figura 4D), que no se observan en la autofagia tipo clásico [35]. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que la muerte celular inducida por SEEH era independiente de caspasas y se parecía a la muerte celular autofagia. Esta forma de muerte celular coincide bien con AutoSIS, un Na caracterizado recientemente
+, K
+ - ATPasa forma regulada por la muerte celular [36]. Desafortunadamente, debido a que el glucósido cardiaco digoxina, un antagonista de Na
+, K
+ - ATPasa que se reporta para inhibir AutoSIS [36], era demasiado citotóxica para las células Panc-1, no pudimos evaluar su efecto en SEEH-indujo la muerte celular.
(a) Efecto de SEEH en la expresión de proteínas relacionadas con la autofagia. células Panc-1 se trataron con vehículo solo, 100 mg /ml SEEH o 200 mg /ml SEEH para 24 h. Los lisados celulares se sometieron a análisis de transferencia de Western con anti-SQSTM1 /p62 o el anticuerpo anti-LC3. ß-actina sirvió como control de carga. (B) de tiempo de transcurso de la conversión de LC3-I a LC3-II. células Panc-1 fueron tratados con 200 mg /ml SEEH durante los tiempos indicados. AMPK y mTOR expresión (C). células Panc-1 fueron tratados con 200 mg /ml SEEH durante diversos tiempos. Los lisados celulares se sometieron a análisis de transferencia de Western con anti-AMPK, el anticuerpo anti-fosfo-AMPK, anti-mTOR, o anti-fosfo-mTOR. ß-actina sirvió como control de carga. (D) la activación de AMPK y la inhibición de mTOR por SEEH. La intensidad de las bandas en (C) se cuantificó por software Image J. (E) Efecto de la 3-metiladenina (3-MA) y la cloroquina (CQ) sobre la muerte celular inducida por SEEH. células Panc-1 se trataron con SEEH a la concentración indicada en la ausencia o presencia de 10 mM 3-MA (izquierda) o 40 CQ mu M durante 42 h. La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de MTT. imágenes de Western blot (A-C) se han recortado para su presentación. imágenes del mismo tamaño se presentan en la Fig S13 Bares; SD.
(A) El contraste de fases. células Panc-1 se trataron con vehículo solo o 100 mg /ml SEEH para 40 h. Barras; 100 micras. (B) LC-3 puntos lagrimales. células Panc-1 transfectadas con pCMX-SAH /Y145F-LC3B-GFP vector se trataron con vehículo solo o 100 mg /ml SEEH para 24 h y se observaron con un microscopio láser confocal. Barras; 20 micras. (C) la tinción doble con MitoTracker y el anticuerpo anti-LC3. células Panc-1 se trataron con vehículo solo, 100 mg /ml o 200 mg /ml SEEH durante 24 h, se tiñeron con 100 nM de MitoTracker Red de 10 min, se fijaron, y luego se procesaron para inmunotinción LC3. Barras; 20 micras. (D) Ultraestructura. Panc-1 células tratadas con vehículo solo o con 200 mg /ml durante 28 h SEEH se procesaron para análisis TEM. Aumento original, x2,500. PC, el espacio perinuclear.
generación de ROS mitocondrial participa en SEEH inducida por la muerte celular
Los cambios en la generación de ROS, según la evaluación de la tinción H2DCFDA, después del tratamiento de las células Panc-1 con SEEH mostró un patrón bifásico. En las primeras etapas (aproximadamente 10 h), la generación de ROS fue inhibida por SEEH (S3 Fig). Sin embargo, el tratamiento prolongado resultó en un fuerte incremento de la ROS generación (Fig 5A y 5B). tinción MitoSOX Roja también mostró que el aumento de la producción de superóxido mitocondrial (Fig S4). El antioxidante N-acetilcisteína (NAC) atenuó significativamente la muerte celular inducida por SEEH como evaluadas por la tripán azul colorante prueba de exclusión (Fig 5C). Estos resultados sugieren la generación de ROS como una causa de la muerte celular inducida por SEEH
.
células (A) Panc-1 tratados con vehículo solo, 100 mg /ml SEEH o 200 mg /ml SEEH durante 20 h se tiñeron con 10 M H2DCFDA de 10 min e inmediatamente se observa bajo un microscopio láser confocal. células (B) Panc-1 tratadas como en A fueron sometidas a citometría. (C) Efecto de la NAC sobre la muerte celular inducida por SEEH. células Panc-1 fueron tratados con 200 mg /ml SEEH en presencia o ausencia de NAC 10 mM durante 42 h. La viabilidad celular se evaluó mediante un ensayo de exclusión de colorante azul de tripano. Barras; SD.
Las mitocondrias son reportados a ser la principal fuente de ROS necesaria para la inducción de la autofagia [37]. Para examinar si ROS mitocondrial juega un papel en la muerte celular inducida por autotic SEEH, se utilizó el ADN mitocondrial (ADNmt) -menos células ρ
0P29 que se derivan de las células de carcinoma de pulmón de Lewis P29 y células P29mtP29 que se establecieron mediante la reintroducción silvestre escriba ADNmt en ρ
0P29 células. Cuando ρ
0P29 células fueron tratadas con SEEH que apenas producen ROS, mientras que las células P29mtP29 suficientemente producen ROS (Fig S5). Curiosamente, ρ
0P29 células resultaron ser resistentes a la SEEH en comparación con las células P29mtP29 (S5) Fig.
SEEH retarda el crecimiento de tumores de cáncer de páncreas
Cuando las células Panc02-Luc-ZsGreen (5 x 10
5 células) por vía intraperitoneal trasplantaron en ratones C57BL /6, tendían a formar nódulos diseminados preferentemente en todo el páncreas y en la superficie peritoneal, y los ratones desarrollaron ascitis (aproximadamente 2,4 ml /ratón moribundos) ( S6 figura). Se examinó la eficacia terapéutica de SEEH en este modelo diseminación peritoneal. Bares, Dakota del Sur. DAKOTA DEL SUR. Bares, Dakota del Sur. DAKOTA DEL SUR.