Extracto
En algunos pacientes con cáncer de esófago, la radioterapia no puede prevenir la metástasis distante lo que resulta en una baja supervivencia. El mecanismo subyacente de la metástasis en estos pacientes no está bien establecida. En este estudio, hemos demostrado que la radiación ionizante puede inducir transición epitelio-mesenquimal (EMT) acompañado con un aumento de la migración celular y la invasión, a través de regulación a la baja de la fosfatasa y tensina homólogo (PTEN), y la activación de la señalización de Akt /GSK-3β /caracol. Hemos desarrollado un radioresistant (RR) línea celular de cáncer epidermoide de esófago, KYSE-150 /RR, por tratamiento con radiación ionizante fraccionado (IR), y confirmó su radioresistance usando un ensayo de supervivencia clonogénico. Se encontró que la línea celular /RR-150 KYSE muestra las características típicas morfológicos y moleculares de la EMT. En comparación con las células parentales, KYSE-150 células /RR mostraron un aumento de supervivencia de la colonia post-IR, la migración, y la invasividad. Además, se observó una disminución de PTEN en KYSE-150 células /RR. Postulamos que la sobre expresión de PTEN puede inducir transición mesenquimal-epitelial en KYSE-150 células /RR y restaurar aumento de la migración celular inducida por IR. Mecánicamente, fraccionado IR inhibe la expresión de PTEN, que conduce a la activación de la señalización /GSK-3β Akt y se asocia con los niveles elevados de proteína Snail, un factor de transcripción implicado en EMT. En consecuencia, el tratamiento con LY294002, un inhibidor de la fosfatidilinositol-3-quinasa, imitaba efecto sobreexpresión PTEN en KYSE-150 células /RR, lo que sugiere un papel para la Akt /GSK-3β /Snail señalización en los efectos mediados a través de PTEN. En conjunto, estos resultados sugieren fuertemente que fraccionado EMT IR mediada por células /RR KYSE-150 es a través de vías dependientes de PTEN, destacando un efecto proinvasive directa del tratamiento de radiación en las células tumorales
Visto:. Él E, Pan F, G Li, Li J (2015) fraccionado de la radiación ionizante Promueve la transición epitelio-mesenquimal de las células de cáncer de esófago humano a través de PTEN Deficiencia mediada por Akt activación. PLoS ONE 10 (5): e0126149. doi: 10.1371 /journal.pone.0126149
Recibido: October 27, 2014; Aceptado: March 29, 2015; Publicado: 22 de mayo de 2015
Derechos de Autor © 2015 He et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. la investigación fue apoyada por el general Financiera Beca de la Fundación de Ciencias de china Postdoctoral (a JL, la subvención No. 2013M542451) (http://jj.chinapostdoctor.org.cn/V1/Program1/Info_Show.aspx?InfoID=270124f8-9c55-4916-ab8d-1ee53c952329). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer esofágico es uno de los cánceres más difíciles de tratar con la octava tasa de mortalidad más alta entre todos los tipos de cáncer en todo el mundo. [1] es el cuarto tipo de cáncer más frecuentemente diagnosticado y la cuarta causa de muerte por cáncer en china. [2] el carcinoma de células escamosas de esófago (CECA) es el principal subtipo histopatológico de cáncer de esófago en china. La radioterapia es el pilar del tratamiento de la CECA, pero el fracaso local ha seguido siendo una de las principales preocupaciones, con enfermedad persistente o recurrente que se informa en aproximadamente el 40-60% de los pacientes. [3] Un subgrupo de pacientes con cáncer de esófago no responden a la radioterapia debido a la aparición de células radioresistant (RR) de tumores. El curso clínico de estos pacientes se caracteriza por recaídas frecuentes y lesiones metastásicas distantes. La investigación de los mecanismos subyacentes implicados en el desarrollo de las células tumorales RR es de primordial importancia para el estudio del efecto de la radioterapia en la CECA.
epitelio-mesenquimal transición (EMT) es un proceso mediante el cual las células epiteliales diferenciadas sufren notables cambios morfológicos a partir de un fenotipo de adoquines epitelial a un fenotipo fibroblástico alargada [3], que se caracteriza por disminución de la expresión de marcadores epiteliales, tales como e-cadherina y aumento de la expresión de marcadores mesenquimales como la vimentina y N-cadherina. [4] en la actualidad, EMT ha sido implicado en dos de los procesos más importantes responsables de la mortalidad relacionada con el cáncer es decir, la invasión y la progresión a la enfermedad metastásica distante, y la adquisición de resistencia terapéutica. [5] estudios recientes sugieren que EMT juega un papel crucial en el desarrollo de radioresistance cáncer. La radiación mediada EMT ha sido ampliamente estudiada en varios tipos de tumores, tanto
in vitro
y
in vivo
, como el colorrectal, cervical, de mama y cáncer de pulmón. [6-10] Sin embargo , el papel preciso de la EMT y los mecanismos subyacentes implicados en el desarrollo de cáncer de esófago en radioresistance queda por esclarecer.
fosfatasa y homólogo de tensina (PTEN) es un importante gen supresor de tumores, que es un regulador negativo de la vía de -Akt fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K), participando así en la regulación del ciclo celular, la proliferación, la apoptosis, la adhesión celular, y EMT durante el desarrollo embrionario y el cáncer de progresión. [11, 12]. Se ha informado de que la disminución de expresión de PTEN, post-IR, induce radioresistance través de la promoción de la proliferación celular y la inhibición de la apoptosis celular en el cáncer de pulmón de células no pequeñas y el carcinoma nasofaríngeo. [13, 14] Directamente restauración de la función PTEN ha sido previamente notificado a ser un enfoque valioso para lograr radiosensibilización
in vitro
. [15] sin embargo, si PTEN participa en la radiación provocada EMT y metástasis tumoral en ESCCs aún no está clara.
por lo tanto, en el presente estudio, la hipótesis de la función de PTEN en el desarrollo de la EMT inducida por la radiación en CECA. Se examinó si (i) la irradiación podría mejorar la invasividad de ESCCs mediante la inducción de EMT, (ii) la deficiencia de PTEN participó en EMT inducida por radiación, y (iii) EMT inducida por la radiación fue a través de la activación de GSK-3β señalización Akt //Snail .
Materiales y Métodos
Materiales
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) se obtuvo de Gibco 1640 (Life Technologies Corporation, IN), suero bovino fetal (FBS) se adquirió de HyClone (Thermo, MA). Los anticuerpos para PTEN, E-cadherina, N-cadherina, Slug, Snail, vimentina, Akt, Akt fosforilada (p-Akt), GSK-3β, phosphorylatedGSK-3β (p-GSK-3β) y peroxidasa de rábano picante (HRP) y conjugado anticuerpo secundario se adquirieron de CST (Cell Signaling Technology, MA). El inhibidor de PI3K, LY294002, se adquirió de Sigma (Sigma-Aldrich, MO). GoScript inversa Sistema de Transcripción y GoTaq qPCR Master Mix Kit eran de Promega (Promega, WI).
línea celular y cultivo celular
línea celular humana CECA, KYSE-150 (JCRB1095, proporcionado por el Dr. . Fangfang Bu) [16, 17], se cultivó en medio RPMI 1640 con 10% de FBS y 100 unidades de penicilina-estreptomicina y se incubó a 37 ° C con 5% de CO
2 en un incubador humidificado. Antes de la cultura, la línea celular KYSE-150 fue autenticado por perfiles de repetición en tándem corto (Beijing MicroRead tecnología genética Co., China).
radiación ionizante fraccionado tratamiento (FIR) [18]
El KYSE -150 células fueron cultivadas en 25 cm
2 frascos. Al alcanzar aproximadamente 75% de confluencia, las células se irradiaron con 1 Gy de rayos X a temperatura ambiente usando el Hitachi MBR-1520-R irradiador (Hitachi Medical Corporation, Tokio, Japón) a una tasa de dosis de 4.73Gy /min, y las células se devolvieron a la incubadora inmediatamente después de la irradiación. Las células fueron sub-cultivadas en nuevos matraces a aproximadamente 90% de confluencia. Este proceso se repitió con el fin de lograr la exposición a la radiación a una dosis de 1 Gy, 3 veces; 2 Gy, 3 veces; y 4 Gy, 7 veces, y cada exposición fue en un intervalo de tres días; con la dosis total es de 37 Gy durante un período de 2 meses. Varios clones se aislaron de las células RR y se cultivaron individualmente. Las células parentales fueron tratados usando el mismo procedimiento excepto que no se irradiaron. Se utilizaron ensayos por clonación para determinar el nivel de resistencia y un clon RR nombrado KYSE-150 /RR fue seleccionado para nuestro experimento.
se sembraron
supervivencia Clonigénicas ensayo
p>
Plásmido construcción y transfección
plásmido recombinante pcDNA3.0-PTEN se construyó mediante la inserción de PTEN de ADNc humano en el vector pcDNA3.0 (Invitrogen, CA ) con los cebadores de la siguiente manera: hacia adelante, 5 'cggggtaccccggccaccATGACAGCCATCATCAAAGAGATC 3' (subrayado Kpn1 + Kozak) y marcha atrás, 5 'ccgctcgagcggTCAGACTTTTGTAATTTGTGTATGC 3' (subrayado Xho 1). KYSE-150 células /RR fueron transfectadas con pcDNA3.0-PTEN o el control de vectores pcDNA3.0. Todas las transfecciones se llevaron a cabo utilizando el reactivo de transfección ScreenFectA (Incella, Egggenstein-Leopoldshafen, Alemania) según las instrucciones del fabricante. Las células transfectadas se analizaron mediante transferencia Western, o reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (RT-qPCR).
ARN interferencia en el ensayo
KYSE-150 células, que no fueron tratadas, fueron transfectadas con 100 nmol de pequeños ARN de interferencia (siRNA) -PTEN o nontargeting revueltos siRNA usando el reactivo de transfección ScreenFectA según las instrucciones del fabricante. siRNA-PTEN se sintetizó usando la siguiente secuencia: 5'-GGGCCAGGTCATAAATAAT-3 '; mientras que la secuencia revueltos-siRNA fue el siguiente: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 '
análisis de transferencia de Western
Las células se lisaron en dodecil sulfato de sodio (SDS) de tampón de lisis, y se homogeneizaron para. la extracción de proteínas. Cantidades iguales de proteína de cada lisado se separaron por SDS-PAGE (10% de acrilamida) y se transfirieron a PVDF membranas de transferencia de Western (Millipore Corporation, MA). Esto fue seguido por la incubación con anticuerpos primarios a PTEN, E-cadherina, N-cadherina, Slug, Snail, vimentina, Akt, p-Akt y gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH, como control de carga), y HRP-conjugado anticuerpo secundario . Las señales blot fueron entonces visualizadas con un aumento de quimioluminiscencia (Thermo, MA).
extracción de RNA y RT-qPCR ensayo
ARN total a partir de células cultivadas, después de varios tratamientos, se extrajo con el reactivo Trizol ( Life Technologies Corporation, IN) según las instrucciones del fabricante. Un microgramo de RNA total se usó para la transcripción inversa. Un microlitro del producto total de transcripción inversa se añadió a la mezcla-qPCR en tiempo real (20 l) que contiene 10 l 2 × GoTaq qPCR Master Mix y los cebadores (sentido y anti-sentido; 1μL) para determinar la expresión de ARNm de PTEN humano, E -cadherin, N-cadherina, caracoles, babosas, vimentina y β-actina. La expresión génica de ARNm a partir de cada muestra se calculó mediante la normalización con β-actina. Todos los cebadores fueron diseñados utilizando el software de IDT PrimerQuest de entrada (Tabla 1). Las muestras se amplificaron con un asimiento preciclado a 95 ° C durante 30 s, 40 ciclos de recocido y extensión a 60 ° C durante 34 s. Cada medición se realizó por triplicado con ApplidBiosystems 7500 del sistema StepOne PCR en tiempo real (Applied Biosystems, Inc., CA) y se analizaron usando Applied Biosystems 7500 v2.0.1 software.
La migración y la invasión de ensayo
Los ensayos de migración se realizaron en un 24 pocillos transwell cámara que contiene filtros de policarbonato con poros de 8 m (Corning, Acton, MA). Se añadió un total de 500 l de medio que contiene 20% de FBS como el factor quimiotáctico para el compartimiento inferior y luego 1 × 10
se añadieron 5 células de cada grupo en DMEM libre de suero para el compartimiento superior de la cámara y se incubaron durante 24 h. A continuación, la superficie superior de la cámara se raspó para eliminar las células no migratorias. Las células migradas se tiñeron con 0,1% de cristal violeta y se fotografiaron con un microscopio óptico (x 100). Las cámaras se lavaron con 100 l de ácido acético al 10% y la densidad óptica del eluyente células teñidas se midió a 560 nm. Cada grupo se preparó en tres pocillos por duplicado. Para el ensayo de invasión, un sistema transwell recubierto con 2 mg /ml se utilizó de la membrana basal, matrigel, (Corning, Acton, MA). El resto del procedimiento fue similar al ensayo de la migración como se ha descrito anteriormente
cicatrización de heridas ensayo
Las células fueron sembradas en placas de 12 pocillos y se cultivaron hasta 40% de confluencia.; la monocapa de células confluentes se rascó con una punta de pipeta de 20 l para producir una línea vertical a través del centro de los pozos. Se observó la propagación del cierre de la herida después del intervalo de 0 a 24 h, y fue fotografiado usando un microscopio de luz.
El análisis estadístico
Las diferencias fueron evaluadas por la prueba t de Student para la comparación de los dos grupos. Los datos se expresan como la media ± desviación estándar (SD). Un
P valor Red de & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
Efecto de la irradiación sobre la morfología celular y marcadores de EMT
Después de dos meses. de FIR con una dosis total de 37 Gy, subclones se aislaron y se nombran KYSE-150 células /RR, y su carácter RR se demostró mediante el ensayo clonogénico de supervivencia celular. La figura 1A muestra que 150 KYSE células /RR sobrevivieron durante un período más largo en comparación con las células parentales.
Las curvas de supervivencia de células de la radiación (A) y las figuras clonogénico del control KYSE-150 células sin irradiación y radioresistance subclón células /RR KYSE-150. (B) Morfología de las células /RR-150 KYSE KYSE-150 y se examinó con un microscopio de contraste de fase. (C) Expresión de marcadores de EMT (E-cadherina y vimentina) y represores de la transcripción de la E-cadherina (caracoles y babosas) fueron detectados por QRT-PCR, los datos se muestran como media ± DE, *
P Hotel & lt; 0.05. Los datos representan medios con desviación estándar de tres experimentos independientes. (D) transferencias Western representativos de E-cadherina, vimentina, caracoles y babosas se mostraron.
Las células RR demostrado cambios morfológicos. El control KYSE-150 células (KYSE-150 Ctrl) tenían una morfología epitelio similar, con la colaboración de célula a célula cerrada y la apariencia de adoquines similar (figura 1B izquierda). Las células /RR KYSE-150 desarrollaron una morfología de tipo huso, con el aumento de formación de pseudópodos y pérdida de contacto de célula a célula, que es característica de fenotipo mesenquimal (Fig 1B derecha). La ganancia de estas características morfológicas en sublíneas RR podría hacer alusión a sus características transformadas, como la migración y la invasión. [19]
Para confirmar si este cambio fenotipo se atribuyó a la EMT, el ARNm y la expresión de la proteína de la EMT- genes asociados fueron detectados por QRT-PCR y transferencias de Western. KYSE-150 células /RR mostraron la regulación a la baja epitelial de marcador de E-cadherina, y la regulación positiva de la vimentina mesenquimales marcador, cuando se compara con KYSE-150 células Ctrl (figura 1C y 1D). Caracoles y babosas, reguladores negativos de la E-cadherina, fueron críticos para la EMT. [19] En las células /RR KYSE-150, tanto para caracoles y babosas se incrementaron significativamente en el nivel de proteína (Figura 1D), pero no se han cambiado en el ARNm nivel (figura 1C). Estos resultados demuestran que la irradiación es suficiente para inducir EMT en la línea celular CECA.
efectos de la irradiación sobre la migración celular y las células tumorales invasión
que se someten a EMT han aumentado la capacidad de migración celular y la invasión. Para investigar si las células KYSE-150 /RR muestran tales características, se evaluó la capacidad de migración e invasión de KYSE-150 Ctrl y células /RR KYSE-150
in vitro
. Cicatrización de heridas ensayo mostró que KYSE-150 células /RR tenían significativamente más rápido cierre del área de la herida en comparación con KYSE-150 células Ctrl (Figura 2A). se encontró la migración celular y la invasión de células /RR KYSE-150 para ser aumentado en un 50% y 33% respectivamente, en comparación con KYSE-150 células CTRL (Fig 2C). Imágenes representativas de la capacidad de migración y la invasión de cada una de la línea celular se muestran en la figura 2B
.
KYSE-150 células (A) se sometieron a un ensayo de cicatrización de heridas con o sin radiación a un aumento de 100x. Imágenes representativas fueron fotografiados a la derecha y 24 h después de la cero. (B) Imágenes representativas de ensayo de la migración y la invasión de ensayo de KYSE-150 células con o sin radiación fueron fotografiados después de 24 h con colorante cristal violeta. (C) los gráficos de resumen para la migración y la invasión (datos que se muestran como media ± DE, *
P Hotel & lt; 0,05).
Es necesaria la deficiencia de PTEN para la irradiación inducida EMT
se ha informado de que la expresión de PTEN se reduce en las células tumorales RR. [13, 14] se determinó la expresión de ARNm y proteína de PTEN en KYSE-150 Ctrl y células /RR KYSE-150. Nuestros resultados muestran que la radiación redujo significativamente la expresión de PTEN tanto en el ARNm y los niveles de proteína (Fig 3A). Para determinar los efectos de la deficiencia de PTEN en la migración celular y EMT, la orientación de PTEN se utilizó siRNA (Fig 3B izquierda). Migración y ensayo de invasión demostraron que la caída de PTEN resultó en un fenotipo migratorio claro en KYSE-150 células en comparación con las células transfectadas de vehículos (figura 3D). Las transferencias Western mostraron que las células KYSE-150-siPTEN pérdida de adhesión celular marcador de E-cadherina y elevación de la vimentina mesenquimales diferenciación marcador exhibieron (Fig 3C izquierda).
(A) de la radiación disminuye significativamente la expresión de PTEN en el Kese-150 células /RR no importa en el nivel de ARNm (datos que se presentan como media ± SD, **
P Hotel & lt; 0,01) y el nivel de proteína (transferencias Western representativas). (B) La eficiencia transfectadas de siPTEN en KYSE-150 (izquierda) y pcDNA-PTEN en 150 KYSE células /RR (derecha) (datos que se presentan como media ± SD, **
P Hotel & lt; 0,01) . (C) Análisis de transferencia de Western Representante mostró expresión de PTEN, E-cadherina y vimentina en células KYSE-150 transfectadas con siPTEN o vehículo, o KYSE-150 células /RR transfectadas con pcDNA-PTEN o pcDNA3.0. Los datos mostrados representan tres experimentos diferentes. (D) Imágenes representativas de ensayo de migración e invasión de células KYSE-150 transfectadas con siPTEN o vehículo después de 48 h (izquierda); gráficos de resumen es para la migración y la invasión (a la derecha, los datos muestran como media ± desviación estándar, *
P Hotel & lt; 0,05). (E) Imágenes representativas de ensayo de migración y el ensayo de invasión de células /RR KYSE-150 transfectadas con pcDNA-PTEN o pcDNA3.0 se fotografiaron después de 24 h con la tinción de cristal violeta (izquierda); gráficos de resumen para la migración y la invasión (a la derecha, los datos muestran como media ± desviación estándar, *
P Hotel & lt; 0,05). siPTEN es la abreviatura de siRNA-PTEN.
A continuación, utiliza un vector que codifica PTEN (figura 3B derecha), para confirmar el papel de PTEN en EMT inducida por la radiación y la metástasis tumoral. Se encontró que la sobreexpresión de PTEN causada células KYSE-150 /RR para restaurar la expresión de E-cadherina y disminuir la expresión de vimentina (Fig 3C derecha). Por otra parte, el aumento de las capacidades de migración e invasión de células /RR-150 KYSE se inhibió significativamente por la sobreexpresión de PTEN (Figura 3E). Los datos indican que la deficiencia de PTEN es necesaria para la EMT inducida por la radiación y migratorias fenotipo /invasivo.
PTEN disminuyó la expresión de Snail través de la activación de PI3K /Akt /GSK-3β señalización
caracoles y babosas son represores de la transcripción que juegan un papel importante en la metástasis tumoral mediante la regulación negativa de e-cadherina. [19] Como se mencionó anteriormente, caracoles y babosas se upregulated en KYSE-150 células /RR a nivel de proteínas, pero no a nivel de ARNm. Para determinar si la expresión elevada de caracoles y babosas se debieron a la deficiencia de PTEN tras la irradiación, cambiamos la expresión de PTEN mediante la transfección con siRNA contra PTEN o vector de expresión de PTEN, y luego se realizaron transferencias de Western para determinar la expresión de Snail y Slug. Como se muestra en la figura 4A, la expresión de Snail aumentó significativamente en 150 KYSE células Ctrl-siPTEN en comparación con KYSE-150 células Ctrl-siCtrl, mientras que, se disminuyó en KYSE-150 células /RR-pcDNA-PTEN en comparación con KYSE-150 /RR-pcDNA células. En cambio, la expresión de Slug no mostró cambios significativos en la expresión de PTEN. Por otra parte, QRT-PCR no mostró ningún cambio significativo en los niveles de ARNm de Snail (Fig 4B). Estos resultados indican que la regulación al alza de caracol por la irradiación se debe a la disminución de los niveles de PTEN.
(A) Expresión de caracoles y babosas detectado por Western blot en células KYSE-150 transfectadas con siPTEN o vehículo, o células /RR KYSE-150 transfectadas con pcDNA-PTEN o pcDNA3.0. (B) La expresión de Snail se detectaron mediante QRT-PCR, los datos se muestran como media ± DE. (C) Análisis de transferencia de Western Representante mostró expresión de Akt, p-Akt, GSK-3β y p-GSK-3β. Los datos mostrados representan tres experimentos diferentes. siPTEN es la abreviatura de siRNA-PTEN. (D) Análisis de transferencia western Representante mostró expresión de Akt, p-Akt, GSK-3β, p-GSK-3β, Snail y E-cadherina en KYSE-150 células /RR con o sin la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) inhibidor, LY294002 (40 mM).
la activación de la vía PI3K /Akt /GSK-3β está emergiendo como una característica central de la EMT, con GSK-3β la regulación de la expresión de Snail través de la modificación postraduccional. [20, 21] Se postula si PTEN regula la expresión de Snail través de la vía PI3K /Akt /GSK-3β en las células CECA. Como se muestra en la figura 4C, la fosforilación de Akt y GSK-3β se upregulated en KYSE-150 células /RR pero no en KYSE-150 células Ctrl. Y el golpe de gracia de PTEN de hecho facilitó la fosforilación de Akt en KYSE-150 células Ctrl, acompañado por un aumento de la fosforilación de GSK-3β (figura 4C, medio). Por el contrario, la sobreexpresión de PTEN inhibe la fosforilación de Akt y GSK-3β en KYSE-150 células /RR (Figura 4C, derecha). Para proporcionar una prueba más de la inhibición de PTEN dependiente de la señalización de PI3K /Akt /GSK-3β, el inhibidor de PI3K, LY294002, se utilizó para imitar el efecto de PTEN sobreexpresión en KYSE-150 células /RR. LY294002 (40 M) inhibió la fosforilación de Akt y GSK-3β en KYSE-150 células /RR, y la expresión de Snail se downregulated y la de la proteína E-cadherina se upregulated (Fig 4D). Estos resultados sugieren que la deficiencia de PTEN activa Akt /GSK-3β /Caracol vía tras la irradiación.
Discusión
La radioterapia es un tratamiento eficaz para el cáncer de esófago, incluso en una etapa avanzada. Sin embargo, la recurrencia y metástasis debido al desarrollo de radioresistance entre las células tumorales sigue siendo un reto importante. Estudios anteriores han demostrado que el fenotipo RR se correlacionó con varios factores, incluyendo las alteraciones en los puntos de control del ciclo celular, crecimiento más lento, y la disminución de la apoptosis. [22, 23] transición mesenquimal epitelial también se cree que está regulado por la exposición a la radiación. evidencias acumuladas indican que la radiación ionizante es uno de los inductores de la EMT, que se ha demostrado que se producen en el momento de la iniciación de la metástasis, lo que lleva a la progresión del cáncer, y se asocia con el desarrollo de resistencia a la radioterapia en oral, mama y cánceres de pulmón . [6, 7, 24]
para investigar radioresistance clínica, los regímenes de FIR se han utilizado
in vitro
para determinar los mecanismos moleculares subyacentes radioresistance. En este estudio, hemos desarrollado KYSE-150 células /RR derivados de clones que habían sobrevivido después del tratamiento FIR, [18] que imita la resistencia adecuada radioterapia en CECA. celular KYSE-150 es una línea celular de cáncer de esófago ampliamente utilizado para el estudio de la resistencia a la radiación en el carcinoma de esófago. [18, 25-27] KYSE-150 línea celular fue desarrollado por el Dr. Yutaka Shimada en 1991 de la CECA pobremente diferenciado resecado desde la parte superior del esófago de un 49 años de edad, mujer japonesa radioterapia que recibe. [16] por lo tanto, esta línea celular se puede modificar fácilmente en una línea celular de RR. Hemos encontrado que el fenotipo de KYSE-150 células /RR conmutado desde una morfología epitelial a mesenquimal una morfología después de la irradiación. Al mismo tiempo, se realizó ensayo de migración y la invasión y encontramos que la capacidad de migración y la invasión de células /RR KYSE-150 se incrementó en comparación con las células parentales, lo que sugiere que EMT está involucrado en el desarrollo de radioresistance y metástasis en CECA.
Un paso clave en la regulación a la baja de la EMT es la E-cadherina. E-cadherina está regulada ya sea por factores de transcripción, como relacionadas con el caracol de zinc-finger represores transcripcionales (caracoles y babosas), SIP-1 /ZEB-2 y básico factor de transcripción hélice-bucle-hélice, Twist, o inducida por la ubiquitinación- endocitosis. En nuestro estudio, encontramos FIR aumentó la expresión de ambos caracoles y babosas en el nivel de proteína y no cambió su expresión de ARNm. la sobreexpresión ectópica de caracol también conduce a la adquisición de aumento de la resistencia a las propiedades similares a las células de la apoptosis y madre de cáncer en diversas células epiteliales. [28] La activación de Snail y Slug puede ser uno de los mecanismos implicados en el desarrollo de radioresistance en CECA después de la radioterapia .
la activación de la proteína quinasa B (Akt) vía desempeña un papel central en las tres principales mecanismos radioresistance, que son radioresistance intrínseca; la proliferación de células tumorales y la hipoxia. PTEN, como un inhibidor de Akt, se informa a asociarse con la radiosensibilidad. Se ha informado de que la expresión de PTEN se redujo en las células RR de gástrico [15] y nasofaríngeo [14] carcinoma, por su parte, otros encuentran PTEN para ser esencial para la atenuación de la invasión y EMT. [11, 29] Se encontró la expresión de PTEN ser downregulated después de FIR, y la sobreexpresión de PTEN restaura el fenotipo de células /150 /RR KYSE de la morfología mesenquimal a la morfología epitelial, acompañado con una disminución de la migración y la invasión.
para investigar más a fondo el papel de se estudió PTEN en EMT, vía /Snail Akt /GSK-3β radiación provocada, que ha sido implicado anteriormente en el desarrollo de cáncer de pulmón inducida por radiación. [10, 30] la hipótesis de un papel para PTEN que conduce al aumento de la E -cadherin expresión a través de la vía de Akt /GSK-3β /Caracol. Activo GSK-3β puede fosforilar caracol para facilitar su degradación, [20, 21] por el contrario la inactivación de GSK-3β, puede estabilizar Caracol. [30] Nuestros datos muestran que la sobreexpresión de PTEN puede atenuar la expresión inducida por la radiación de caracol a través de la desfosforilación de la Akt en células /RR KYSE-150, que se aceleró la regulación a la baja de p-GSK-3β y promueven la degradación del caracol. Caracol, como uno de los represores de la transcripción de la E-cadherina, al llegar downregulated causó la regulación positiva de la expresión de E-cadherina. Para demostrar aún más la participación de la señalización de PI3K /Akt /GSK-3β en una forma dependiente de PTEN, inhibidor de PI3K, LY294002, se utilizó para imitar el efecto de PTEN sobreexpresión en KYSE-150 células /RR. LY294002 inhibe la fosforilación de Akt y GSK-3β en KYSE-150 células /RR, y la expresión de Snail se downregulated y se reguló la proteína E-cadherina. Considerado en conjunto, los datos sugieren que la regulación a la baja de PTEN está vinculado con la inactivación de GSK-3β, y la señalización de PI3K PTEN dependiente /Akt /GSK-3β es necesario regular al alza del caracol por EMT inducida por la radiación a desarrollarse en ESCCs.
la vimentina, un componente importante del citoesqueleto de las células mesenquimales, se utiliza a menudo como un marcador de la EMT durante la progresión metastásica. Se ha informado de que el bloqueo de PI3K /Akt señalización expresión de vimentina atenuada en células de carcinoma oral. [31] En nuestro estudio, vimentina fue hasta reguladas en 150 KYSE células /RR (Figura 1D) y la sobreexpresión de PTEN inactivada PI3K /Akt de señalización que conduce a la regulación por disminución de la expresión de vimentina en estas células (Fig 1C). Esto sugiere que se requiere la deficiencia de PTEN para EMT inducida por radiación. Es de destacar que Slug, otro represor de la transcripción E-cadherina, es hasta reguladas en la radiación (Figura 1D); sin embargo, no se encontraron niveles Slug de ser afectados por la expresión de PTEN (Fig 4A). Este hallazgo indica que la EMT inducida por la radiación es un proceso complejo y otras vías también pueden estar involucrados.
Nuestro estudio ha elucidado los detalles de la ruta de la EMT en la radiación provocó la CECA (figura 5). Este estudio pone de relieve la importancia de PTEN como una posible diana terapéutica. La regulación a la baja de PTEN y la regulación positiva de la vía PI3K provocada por la radiación evoca las cascadas que conducen a la EMT. Todos estos efectos contribuyen en conjunto a la metástasis del tumor y la recidiva después de la radioterapia. Por lo tanto, se sugiere que la deficiencia de PTEN posterior a la radioterapia para el cáncer de esófago juega un papel importante en el desarrollo de la metástasis tumoral RR. Por lo tanto, la sobreexpresión de PTEN puede llegar a ser una estrategia útil para impedir la invasión de células del cáncer y la metástasis que puede desarrollarse después de la radioterapia en CECA.
PTEN actúa como un regulador aguas arriba de la PI3K /Akt /GSK-3β señalización red para evocar las cascadas de EMT. Slug regula la expresión de E-cadherina en una forma independiente de PTEN.