Extracto
El objetivo de este estudio es determinar si los pacientes con degeneración cerebelosa paraneoplásica (PCD) y el cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) tener un repertorio específico de anticuerpos, si los anticuerpos Sox1 (SOX1-ab) puede predecir la presencia de SCLC, y si los anticuerpos a antígenos de la superficie celular se producen en este síndrome. El análisis de anticuerpos se realizó mediante inmunohistoquímica en el cerebro de rata, inmunotransferencia con antígenos recombinantes, el cribado de bibliotecas de expresión de ADNc, y inmunomarcación de las neuronas vivas en 39 pacientes con DCP y SCLC. VGCC-ab se midieron por RIA, y SOX1-ab, Hu-AB y ab-ZIC4 por inmunoblot. El síndrome de Lambert-Eaton myastenic (LEMS) estuvo presente en 10 de 23 pacientes con estudios electrofisiológicos. Al menos un anticuerpo se detectó en 72% de los pacientes. Las frecuencias individuales fueron: 49% SOX1-ab, 44% VGCC-AB, el 31% de Hu-ab, y el 13% ZIC4-ab. SOX1-ab ocurrió en el 76% de los pacientes con VGCC-AB y el 27% de las personas sin VGCC-AB (p = 0,0036). SOX1-ab no se encontraron en 39 pacientes con esporádicos ataxia cerebelosa de inicio tardío, 23 con ataxia cerebelosa y los anticuerpos de la descarboxilasa del ácido glutámico, y 73 con PCD y el cáncer de tipos distintos de SCLC (31 sin anticuerpos onconeural, 25 con Yo-ab, 17 con Tr-ab). Cinco pacientes (13%) tenían anticuerpos contra antígenos de la superficie celular neuronal desconocidos pero ninguno de ellos mejoran con la inmunoterapia. Un suero immunoreacted contra el segmento inicial del axón de las neuronas y otro suero contra ELKS1, una proteína altamente expresado en el cerebelo que interactúa con el beta4-subunidad de la VGCC. En conclusión, el 72% de los pacientes con DCP y SCLC tenía uno o más anticuerpos que indican la presencia de este tumor. En estos pacientes, VGCC-AB y ab-SOX1 producen fuertemente asociada. SOX1-ab son predictores de SCLC en pacientes con ataxia con una especificidad del 100% y una sensibilidad del 49%. A diferencia de la encefalitis límbica con SCLC, los anticuerpos a los teléfonos antígenos de superficie que no sean VGCC-ab, son poco frecuentes y no predicen la respuesta al tratamiento
Visto:. Sabater L, R Höftberger, Boronat A, Saiz A, J Dalmau, Graus F (2013) Anticuerpo Repertorio en Degeneración cerebelosa paraneoplásica y cáncer de pulmón de células pequeñas. PLoS ONE 8 (3): e60438. doi: 10.1371 /journal.pone.0060438
Editor: Michael Platten, Hospital de la Universidad de Heidelberg, Alemania |
Recibido: 8 de noviembre de 2012; Aceptado: 27 Febrero 2013; Publicado: 25 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Sabater y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio ha sido apoyado en parte por el Fondo de Investigaciones Sanitarias. Madrid. España (#FIS PS09 /0193 FG), el Fonds zur Förderung der Forschung Científico, Austria, J3230 Proyecto (RH), y los NIH RO1NS077851, NCI RO1CA089054, Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS, 11/01780), y la Fundación La Marató de TV3 (JD). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Dr. Dalmau tiene una beca de investigación de Euroimmun, y recibe regalías de patentes para la utilizar de Ma2 y NMDAR como pruebas de autoanticuerpos. Él tiene intereses en competencia financieros tales como la propiedad de acciones o participaciones, empleo o consultoría pagados, los miembros del consejo, bolsas de viaje y honorarios por conferencias o participación en las reuniones, en el desarrollo de productos o productos comercializados, o regalos de cualquier tipo, etc. La relación de el Dr. Dalmau con la empresa Euroimmun no altera los autores, la adhesión a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales. Ninguno de los otros colaboradores tiene ningún conflicto de intereses.
Introducción
La célula de Purkinje es uno de los objetivos más comunes de la respuesta inmune que algunos pacientes con cáncer construido contra antígenos compartidos por el el sistema nervioso tumor y [1]. La muerte de las células de Purkinje resultados en un síndrome llamado pancerebeloso degeneración cerebelosa paraneoplásica (PCD) [1]. cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) es uno de los tumores más comunes que se asocian con PCD [2]. Mientras que muchos pacientes (& gt; 80%) con otros síndromes neurológicos paraneoplásicos y anticuerpos SCLC puerto Hu (Hu-ab), la frecuencia de Hu-ab en la DCP es baja (23%) [3]. Aproximadamente, el 40% de los pacientes con CPCP PCD tienen anticuerpos contra canales de calcio dependientes de voltaje (VGCC), y algunos también presentan evidencia clínica o neurofisiológico del síndrome miasténico de Lambert-Eaton (LEMS) [3]. Hasta el 60% de los pacientes con LEMS y SCLC tiene SOX1-ab, un marcador serológico de SCLC [4].
Debido a la frecuente asociación de PCD con SCLC, y en ocasiones con LEMS, que razonó que la determinación de SOX1-ab también podría ser útil para predecir si los pacientes con sospecha de PCD tienen un SCLC subyacente. Por otra parte, los pacientes con encefalitis límbica y SCLC, pero sin anticuerpos onconeural menudo tienen anticuerpos contra receptores de la superficie neuronal, si este paradigma también se aplica a la CPD es desconocido [5].
En el presente estudio hemos analizado el repertorio de anticuerpos en una serie de pacientes con SCLC y PCD, centrado en la frecuencia de SOX1-ab y la presencia de nuevos anticuerpos a los antígenos de la superficie celular neuronal.
Métodos
los pacientes
Hemos seleccionado nuestra base de datos, los pacientes con el diagnóstico de DCP y SCLC. Nos específicamente excluyó a los pacientes que se presentaron con la ataxia pero los síntomas más allá de la disfunción cerebelosa desarrollaron rápidamente. Estos pacientes se considera que tienen la encefalomielitis paraneoplásica, que en contraste con PCD casi siempre se asocia con Hu-ab [6]. La discapacidad neurológica se evaluó mediante la escala de Rankin modificada como se describe [6], [7]. La información clínica se obtuvo de impresos cumplimentados por los neurólogos referencia y entrevistas telefónicas.
estándar del protocolo de aprobaciones, registros y paciente dé su consentimiento
Las muestras de suero y LCR utilizados en el estudio se depositan en el colección de muestras biológicas con nombre "neuroinmunología" registrada en el biobanco del Institut d 'Investigació Biomèdica Pi Sunyer Augusto I (IDIBAPS), Barcelona, España. Teniendo en cuenta que muchos pacientes estaban muertos en el momento en que se realizó el estudio y el estudio es totalmente anónima, por lo que ninguna de las muestras se puede identificar a un paciente particular, se aceptó renunciar al consentimiento informado por escrito específica de los pacientes o los familiares por el Comité etic d'Investigació Clínica (CEIC) del hospital Clínico. procedimientos de manejo de animales fueron aprobados por el Comité de Ética local (99/1 Universidad de Barcelona) y la Generalitat de Catalunya (1094-1099), de conformidad con la Directiva 86/609 /UE de la Comisión Europea. El estudio como se ha explicado fue aprobado por el CEIC del Hospital Clínico.
La detección de anticuerpos anti-neuronales
El suero y el LCR, cuando esté disponible, se evaluó la presencia de onconeural (Hu, Yo, ri, CV2, anfifisina, Ma2, Tr), anti-neurópila (NMDAR, AMPAR, GABA
BR, CASPR2, LGI1, mGluR1 y mGluR5) o posibles nuevos anticuerpos mediante técnicas de inmunohistoquímica sobre secciones congeladas de paraformaldehído-perfundido o post-fija cerebelo de rata como se informó [8]. positividad de anticuerpos onconeural fue confirmado por un inmunoblot comercial (Ravo Diagnostika GmbH, Freiburg, Alemania) y anticuerpos anti-neuropilo por un ensayo basado en células utilizando células HEK293 transfectadas con los plásmidos apropiados, como [9] se describe anteriormente. Los anticuerpos contra la subunidad β4 y γ2 de VGCC se detectaron por inmunofluorescencia en células HEK293 transfectadas con los plásmidos (MC201619 y SC312948; Origene, Rockville, Maryland, EE.UU.). Los anticuerpos frente a P /Q tipo VGCC se midieron mediante un radioinmunoensayo comercial (sistema antibloqueo de frenos Diagnostica GmbH, Hamburgo, Alemania). SOX1-ab-ab ZIC4 y se determinaron utilizando filtros de nitrocelulosa con placas de fagos mixtos (50% de las placas de clones positivos y el 50% de los clones irrelevantes). Los filtros se cortan en trozos, cada uno incubaron con diferentes sueros de pacientes (dilución 1:1000) y se desarrolló mediante una técnica de inmunoperoxidasa avidina-biotina como se describe [4].
Para confirmar la especificidad de SOX1-AB en el diagnóstico de DCP asociado con SCLC, SOX1-AB también se analizaron en el suero de 31 pacientes con DCP y diferentes tipos de cáncer, aparte de SCLC, que no albergan onconeural anticuerpos que podrían confirmar el diagnóstico de DCP, 25 con PCD, de mama o cáncer de ovario, y Yo-ab, 17 con PCD, enfermedad de Hodgkin, y Tr-ab, 39 pacientes con ataxia cerebelosa esporádica de inicio tardío, y 23 con la ataxia cerebelosa y anticuerpos ácido glutámico-descarboxilasa.
cultivo de células primarias e in vivo inmunocitoquímica
Las neuronas del hipocampo se obtuvieron de embriones de rata Wistar E18. Las células fueron enzimáticamente y mecánicamente interrumpidos y se resuspendieron en medio Neurobasal suplementado con B27 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) [9]. Se prepararon cultivos de células granulares de cerebelo diseccionado de 8 días de edad, las ratas Wistar y se procesan igual de las neuronas del hipocampo, pero utilizando Neurobasal-A medio que contiene 25 mM de KCl y se suplementó con B27 [10]. placas P24 pre-recubierto células se sembraron en poli-L-lisina y 10 mM citosina -D-arabinofuranósido (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) se añadió a los cultivos 20 h después de la siembra, para evitar la proliferación de la no células neuronales.
en los experimentos de inmunocitoquímica, las muestras (1:05 dilución CSF y dilución de suero 1:200) se incubaron en las neuronas vivas durante 1 hora, luego se fija con 4% de paraformaldehído y se permeabilizaron con 0,3% Triton TX -100. La tinción con el anticuerpo anti-MAP2 se realizó con el fin de confirmar la especificidad neuronal de las células positivas. Correspondientes anticuerpos secundarios fluorescentes y se aplicaron los cubreobjetos se montaron con Vectashield con DAPI montaje de los medios de comunicación (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.) y se visualizaron con un microscopio Axio Imager M2 ZEISS.
Proyección de bibliotecas de expresión de ADNc
bibliotecas Uni-ZAP XR de cerebelo humano y el cerebro fetal humano (Stratagene, La Jolla, CA) fueron immunoscreened con 10 sueros PCD SCLC (4 pacientes con SOX1-AB y ab-VGCC, 4 seronegativos, 1 con VGCC- ab y 1 con SOX1-ab), informó anteriormente utilizando técnicas [4]. Brevemente, immunoscreening de la biblioteca de ADNc con sueros (dilución 1:1000) se llevó a cabo para llegar a las placas positivas aisladas. Los clones de fagos se subclonaron en pBluescript plásmido utilizando el protocolo de rescate de fagos in vivo escisión (Stratagene, La Jolla, CA). El ADN de plásmido se purificó con el QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Santa Clarita, CA), y se secuenció con el secuenciador de ADN ABI 377 (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando el Big Dye terminator premezclado (Applied Biosystems). Los clones positivos se secuenciaron en ambas cadenas. Se utilizó el programa BLAST genoma humano (NCBI, NIH, Bethesda, MD) para buscar homologías.
Análisis estadístico
La correlación entre SOX1-ab-ab VGCC y se analizaron en una contingencia Se aplicaron mesa y la prueba exacta de Fisher de dos colas.
Resultados
los pacientes
Se identificaron 39 pacientes con SCLC y PCD. La mediana de edad de los pacientes fue de 64 años (rango: 47 a 85 años) y 34 eran varones. PCD precedió al diagnóstico de SCLC en 36 pacientes con un tiempo medio de 2 meses (rango: 0,5 a 42 meses). En el momento del diagnóstico PCD 10 pacientes tenían LEMS y 13 no (confirmadas por los potenciales de al menos normales de acción muscular compuesto en la electromiografía (EMG) estudios [11]). El resto de los 16 pacientes no se refirió síntomas de LEMS, pero no se realizaron estudios de EMG. Veintisiete pacientes recibieron al menos un ciclo completo (inmunoglobulinas intravenosas o esteroides, o ambos) de la inmunoterapia (6 pacientes), quimioterapia (14) o ambos (7). No hay mejoría o estabilización con disfunción cerebelosa moderada-grave (puntuación Rankin & gt; 3) ocurrieron en 13 de los 21 pacientes (62%) que tuvieron un seguimiento adecuado. Tres pacientes mejoraron y 5 se mantuvieron estables, con una puntuación de Rankin de 3 o menos
VGCC y anticuerpos onconeural:. Asociación con anticuerpos Sox1
El setenta y dos por ciento de los pacientes tenían al menos uno de los indicados anticuerpos. Las frecuencias individuales de los anticuerpos fueron: 49% SOX1-ab, 44% VGCC-ab, 31% Hu-ab, y 13% ZIC4-ab. Veintiocho sueros presenta al menos un anticuerpo, y 11 fueron negativos (Figura 1). Hubo una clara correlación entre SOX1-AB y ab-VGCC. SOX1-AB se encuentra en el 76,5% de los pacientes con VGCC-ab, pero sólo en el 27,3% de las personas sin VGCC-ab (prueba exacta de Fisher p = 0,0036) (Figura 2). Positivo VGCC-ab se encontraron en 9 (90%) de los 10 pacientes con LEMS y en 7 (54%) de la 13 sin evidencia clínica o EMG de LEMS. Del mismo modo, SOX1-ab estaban presentes en el 80% de los pacientes con LEMS y el 38% de las personas sin LEMS. No se observaron asociaciones entre VGCC-ab-ab o SOX1 y Hu-ab. Ninguno de los pacientes fueron positivos para anticuerpos onconeural, aparte de Hu, o presenta anticuerpos anti-neuropilo bien caracterizados. SOX1-ab no se detectaron en la serie de control de 73 pacientes con DCP y diferentes tipos de cánceres distintos de SCLC, 32 pacientes con ataxia cerebelosa esporádica de inicio tardío, y 23 con la ataxia cerebelosa y anticuerpos ácido glutámico-descarboxilasa.
Distribución de SOX1-, VGCC-, Hu-y-ab ZIC4 en nuestra cohorte de pacientes. Cada fila representa un paciente y positiva cuando la célula se llena de color. Representación
Gráfico de barras de la correlación entre SOX1-AB y ab-VGCC. (Exacta de Fisher test, p = 0,0036).
Identificación de nuevos anticuerpos
Un suero con SOX1-AB también mostró inmunorreactividad robusta contra el segmento inicial del axón de las neuronas en los estudios de inmunohistoquímica de rutina ( Figura 3A). Cribado de una biblioteca de expresión de ADNc de cerebelo humano con este suero no pudo identificar el antígeno putativo. Otro nuevo anticuerpo se identificó durante el cribado de bibliotecas de ADNc con un suero con VGCC-ab. La proteína diana, llamado ELKS1, es muy abundante en el cerebelo. Se realizó un ensayo de selección de fagos específicos para la detección de ELKS1 pero no hemos podido encontrar otra sueros positivos. PCD sueros tampoco mostró inmunorreactividad con células HEK293 transfectadas con el β4 o gamma 2 subunidades auxiliares de VGCC. Cinco pacientes (12,8%) tenían anticuerpos contra antígenos de superficie celular expresados en neuronas vivas, no permeabilizadas hipocampo (Figura 3B), pero sólo 1 de ellos reaccionaron con las neuronas granulares de cerebelo.
A. Los anticuerpos contra la loma de las neuronas del cerebelo de rata. La inmunohistoquímica en secciones de cerebelo de rata sagital. Tenga en cuenta la fuerte reactividad de un suero atípica PCD SCLC contra el axón loma de las neuronas, principalmente en las células de Purkinje. Los núcleos se counterstained con hematoxilina. B. Inmunofluorescencia en las neuronas del hipocampo en vivo. Las neuronas del hipocampo se incubaron con CSF 1/5 diluida de un paciente PCD SCLC. Reactividad del paciente contra la membrana de la neurona se ve en la tinción de verde y MAP2 en rojo para asegurar el linaje neuronal. Los núcleos se ven azul con DAPI. (Aceite objetivo 100x) guía empresas
Discusión
En el presente estudio hemos querido determinar si los pacientes con DCP y SCLC tenían anticuerpos distintos de VGCC-ab que podrían explicar la ataxia cerebelosa o por lo por lo menos para ayudar en el diagnóstico de DCP. La determinación aislada de VGCC-ab en un paciente con ataxia cerebelosa con o sin LEMS casi siempre confirma un origen paraneoplásico porque la asociación clínica de ataxia cerebelosa y LEMS muy rara vez se producen en ausencia de cáncer [12], [13]. Además, si la ataxia cerebelosa paraneoplásica es y el paciente tiene VGCC-ab el tumor subyacente es siempre un SCLC [14].
Para superar esta limitación, se analizó la presencia de SOX1-ab, un marcador serológico de SCLC [15]. En nuestra serie de PCD y SCLC, se encontró que SOX1-ab estaban presentes en casi el 50% de estos pacientes. Por el contrario, SOX1-ab no se encontraron en el suero de los pacientes con PCD y otros tipos de tumores, con o sin anticuerpos onconeural y en pacientes con ataxia cerebelosa sin cáncer. Nuestros datos indican que SOX1-ab son buenos predictores de un SCLC subyacente en pacientes con ataxia cerebelosa. La frecuencia de SOX1-ab fue aún mayor (76,5%) en los pacientes con CPCP PCD que también tenían VGCC-ab. Esta frecuencia es similar a la reportada en pacientes con LEMS y SCLC (67%) [16]. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que en pacientes con DCP y SCLC, la co-ocurrencia de VGCC-AB y SOX1-AB se asocia fuertemente a pesar de que el 41% de los pacientes PCD con VGCC-ab de la serie actual no tiene proble-.
estudios anteriores mostraron que todos los pacientes con SCLC LEMS y que tenían Hu-ab también tenían SOX1-ab [16]. Por lo tanto, las pruebas adicionales para Hu-ab no mejoró el diagnóstico de paraneoplásico LEMS [16]. Sin embargo, el hallazgo de este estudio tiene implicaciones diferentes. Mientras que SOX1-ab, se produjo en el 48,7% de los pacientes con DCP, un 20% adicional de los pacientes tenían Hu-ab-ab o VGCC. En general, la combinación de la prueba de los 3 anticuerpos (todos disponibles comercialmente) identificará casi el 70% de los pacientes con DCP y SCLC. Algunos pacientes pueden tener otros anticuerpos onconeural como ZIC4, CV2 o anfifisina y todos menos ZIC4 son rutinariamente con los mismos kits comúnmente utilizados para detectar Hu-ab.
No se encontró otros anticuerpos potencialmente útiles en esta serie . El suero de un paciente mostró reactividad con el segmento inicial del axón de las neuronas grandes. Este anticuerpo se informó previamente en un paciente con encefalomielitis y SCLC que desarrolló convulsiones severas y la ataxia de la marcha [17]. Hemos identificado previamente esta inmunorreactividad en un paciente con SCLC sin síntomas neurológicos que sugieren que el anticuerpo puede ser un marcador de la SCLC subyacente (no publicado). Otro paciente tenía un anticuerpo contra ELKS1, una proteína predominantemente expresado en células de Purkinje [18]. Aunque ELKS1 co-inmunoprecipitados con la subunidad β4 VGCC, que no pudieron identificar anticuerpos que reaccionan directamente con β4 o γ2, que son subunidades VGCC que son altamente expresado en el cerebelo [18], [19]. Nuestro estudio no descarta la posibilidad de que el suero de estos pacientes podría tener anticuerpos contra otras subunidades VGCC o proteínas que interactúan. Por ejemplo, los sueros de pacientes con LEMS no paraneoplásicos reaccionar con mayor frecuencia con el dominio IV de la alpha1A de VGCC en comparación con los pacientes con LEMS y SCLC [20].
El reciente descubrimiento de anticuerpos contra antígenos de superficie neuronales tiene cambiado el concepto de que los anticuerpos en el SNC síndromes paraneoplásicos son sólo marcadores sustitutos del tumor subyacente. Mientras que en los pacientes con encefalitis límbica y SCLC aproximadamente el 50% tienen Hu-AB y el otro 50% tienen anticuerpos contra las proteínas sinápticas (principalmente GABA
B receptor) [5], nuestro estudio muestra que en los pacientes con DCP y SCLC la ocurrencia de anticuerpos contra proteínas de la superficie de la célula que no sean VGCC-ab, es raro.
La implicación práctica de nuestro estudio es que en pacientes con ataxia cerebelosa, SOX1-ab son buenos predictores de un SCLC asociado con una especificidad del 100 % y una sensibilidad del 49%. Además, la combinación de pruebas para SOX1-, VGCC-, y Hu-ab identifica casi 70% de los pacientes con PCD y SCLC. Teniendo en cuenta que la CPD se desarrolla generalmente antes del diagnóstico del tumor, este repertorio de anticuerpos es útil para establecer que el síndrome cerebeloso paraneoplásico es, el tumor subyacente es SCLC, y las posibilidades de recuperación neurológica es baja.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Mercé Alba y Eva Caballero por su excelente apoyo técnico. Los autores agradecen también el Dr. Xavier Xifró para proporcionar el protocolo de cultivo de células granulares del cerebelo.