Extracto
Cada vez hay más pruebas de que Embelin, un componente activo de
Embelia Ribes
, induce la apoptosis en células de cáncer humano, pero los mecanismos detallados aún no están claros. Aquí, hemos investigado el efecto de Embelin sobre el crecimiento de células de cáncer de próstata humano. Embelin fuertemente inhibe el crecimiento celular, especialmente en líneas celulares humanas de cáncer de próstata, incluyendo PC3, DU145, LNCaP-LN3 y normal de las células epiteliales de próstata, RWPE-1 en comparación con el cáncer de mama (MDA-MB-231, MCF-7, y T47D), hepatoma (HepG2, Hep3B y Huh-7), o coriocarcinoma (JEG-3). Hemos observado que la apoptosis inducida Embelin de las células PC3 de manera dependiente del tiempo correlacionado con una disminución de la expresión de Bcl-2, Bcl-xL, y MCL-1, el aumento de la translocación de Bax en la mitocondria, y una reducción en el potencial de membrana mitocondrial. Además, Embelin inducida dependiente de voltaje canal de aniones (VDAC) 1 expresión y la oligomerización, que puede promover el citocromo
c
y liberación AIF. Debido Embelin fue capaz de inhibir la activación de Akt y de la ciclooxigenasa-2 expresión, se determinaron los efectos sobre la señalización /β-catenina Wnt. Embelin activa la glucógeno sintasa quinasa -3β (GSK) mediante la prevención de la fosforilación y la expresión de β-catenina suprimida. Atenuación de la actividad transcripcional mediada por TCF-β-catenina y la transcripción de genes, tales como la ciclina D1, c-myc, y metaloproteinasas de matriz (MMP) -7, se muestra en las células Embelin tratados. Los cambios en los niveles de β-catenina en respuesta a Embelin fueron bloqueados por cloruro de litio, un inhibidor de GSK-3, lo que indica que Embelin puede disminuir la expresión de β-catenina a través de la activación de GSK-3β. Además, la exposición de las células PC3 a Embelin resultó en una disminución significativa en la migración celular y la invasión. En conclusión, estos resultados sugieren que la inhibición de la señalización Akt y la activación de GSK-3β contribuye en parte al efecto pro-apoptótica de Embelin en células de cáncer de próstata
Visto:. Parque N, Baek SA, Chun YJ (2015 ) la apoptosis inducida por Embelin de células de cáncer de próstata humana está mediada a través de la modulación de Akt y β-catenina. PLoS ONE 10 (8): e0134760. doi: 10.1371 /journal.pone.0134760
Editor: Geun Seok-Lee, de la Universidad de Kyung Hee, República de Corea
Recibido: Marzo 4, 2015; Aceptado: July 13, 2015; Publicado: 7 Agosto 2015
Derechos de Autor © 2015 Park et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) subvención financiado por el gobierno de Corea (MSIP) (núm 2015R1A5A1008958). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Embelin (2, 5-dihidroxi-3-undecilo-1, 4- benzoquinona), aislado como el componente activo de la fruta de la
Embelia Ribes
Burm (Myrsinaceae), ha sido utilizados para tratar la fiebre y que han demostrado tener anti-inflamatorios, anti-cancerígenos [1], anti-oxidante [2], anti-convulsivo [3], y anti-bacterianas actividades [4,5]. Embelin es conocido por ser un inhibidor de molécula pequeña potente de la ligada al X inhibidor de la proteína de apoptosis (XIAP) que anula la unión de XIAP a procaspasa-9 [1]. Embelin actúa como un potente inhibidor de NF-
κ
B [6,7] y muestra efectos citotóxicos en una variedad de líneas celulares de cáncer [8]. Aunque Embelin es conocido para suprimir la proliferación celular e inducir la apoptosis en muchas células de cáncer humano, los mecanismos moleculares de estos efectos no están claros. La apoptosis desempeña un papel importante en el control de la integridad celular y está estrictamente regulado. Dos principales vías de apoptosis distintas se han desarrollado, las vías intrínseca y extrínseca. señales de iniciación de la vía intrínseca se generan por las señales del desarrollo o el daño celular que causa la pérdida de potencial de membrana mitocondrial y la liberación de proteínas pro-apoptóticas [9, 10]. Sin embargo, los mecanismos por los que los iniciadores apoptogenic cruzan la membrana mitocondrial externa (OMM) todavía no se han resuelto por completo. canal dependiente de voltaje de aniones (VDAC) 1 situado en la OMM se ha propuesto como un componente importante del poro de transición de permeabilidad (PTP), que conduce a la liberación de citocromo c y la apoptosis factor de inducción (AIF) [11,12]. Oligomerización de VDAC1 para formar una estructura de poros grandes en respuesta a varias señales pro-apoptóticas pueden ser necesarios para la liberación del citocromo c [13]. Por otra parte, la interacción de VDAC1 con Bax, una proteína de la familia Bcl-2 proapoptóticos puede formar complejo más grande que VDAC1 solo o Bax solo y promueve la apertura del PTP [14]. Sin embargo, las proteínas de la familia Bcl-2 anti-apoptóticas tales como Bcl-2, Bcl-XL, o MCL-1 impiden la apertura del PTP y se asocian con resistencia al tratamiento y la progresión de muchos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de próstata [15]. De acuerdo con estudios anteriores, MCL-1 es un regulador clave de la apoptosis y la diferenciación y se sobreexpresa en la mayoría de las células de cáncer de próstata [16]. Chen et al. informado de una nueva vía, que consta de Akt, la ciclooxigenasa-2 (COX-2), y MCL-1, por la resistencia adquirida a la apoptosis en células de cáncer [17]. Akt regula redes de señalización celular que están implicados en procesos ligados a la proliferación celular, la diferenciación y el metabolismo y activa una vía anti-apoptótica mediada por la COX-2 que implica MCL-1 [18,19]. La fosforilación de Akt en el residuo Ser 9 de GSK-3β conduce a su inactivación [20, 21], lo que resulta en la estabilización de β-catenina, que se correlaciona con aumento de la transcripción de genes diana corriente abajo [22]. Además, la inhibición de la fosforilación de GSK-3β suprime claramente la expresión de β-catenina y la resistencia a la apoptosis. El presente estudio muestra que Embelin induce la apoptosis mitocondrial dependiente y la supresión de la expresión de β-catenina a través de la inhibición de Akt y la activación de GSK-3β en las células de cáncer de próstata humano.
Materiales y Métodos
Cultivo celular
próstata humano líneas celulares de cáncer PC3, DU145, y LNCaP-LN3, próstata línea celular epitelial humana RWPE-1, el hígado hepatocelular línea celular de carcinoma humano HepG2, Hep3B y Huh-7 o la línea celular de cáncer de mama humano MDA- se obtuvieron células MB-231, MCF-7, y T47D del American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10% (v /v) de suero fetal inactivado por calor bovino (FBS), 100 penicilina U /ml, y 100 mg /ml de estreptomicina. La línea celular de coriocarcinoma humano JEG-3 se adquirió de la línea celular de Corea Banco y se cultivó en medio DMEM con 10% (v /v) FBS inactivado por calor, 100 U /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina. Las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2.
Reactivos
Embelin se adquirió de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Una solución 100 mM de Embelin fue preparado en sulfóxido de dimetilo, almacenada como pequeñas alícuotas a -20 ° C y después se diluyó, según sea necesario en medio de cultivo celular. Una solución 8M de cloruro de litio se obtuvo de Sigma-Aldrich y se diluyó según sea necesario en medio de cultivo celular. FBS y RPMI 1640 se adquirieron de HyClone (Logan, UT). El sistema de transfección de neón, JC-1 kit de ensayo y el anticuerpo COX-4 fueron de Life Technologies (Carlsbad, CA). El ácido bicinconınico (BCA) Kit de ensayo de proteínas y el kit ECL eran de Thermo Scientific (Rockford, IL). Los anticuerpos contra fosfo-Akt (Ser 473), GSK-3β, fosfo-GSK-3β, o Bcl-2 fueron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Los anticuerpos contra Total-Akt, VDAC1, Bcl-xL, Bax, β-catenina, ciclina D1, GAPDH o de cabra anti-IgG de conejo-Texas Red y Ultra Cruz medio de montaje eran de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). La ciclooxigenasa-2 (COX-2), MCL-1, citocromo
c
, los anticuerpos AIF, β-catenina, c-myc o histona H1 eran de Millipore Co. (Bedford, MA). Todos los demás productos químicos eran de la más alta pureza o de grado de biología molecular y se obtuvieron de fuentes comerciales.
viabilidad de las células de ensayo
Las células (1 × 10
4 células /pocillo) se añadieron a una microplaca de fondo redondo de 96 pocillos y se incubaron durante el tiempo designado a 37 ° C. Después del tratamiento durante el tiempo designado, las células se trataron con 10 l de EZ-CyTox (Service Lab Daeil, Corea) se añadió a cada pocillo. Después de 2 h de incubación a 37 ° C, se midió la absorbancia a 450 nm usando un lector de microplacas Pro GENios (TECAN, Suiza).
Anexina V /PI ensayo de apoptosis
Las células se sedimentaron a 1200 rpm y se lavaron una vez con 1 ml de helado de solución salina tamponada con fosfato (PBS). El sedimento resultante se resuspendió en 1 ml de tampón de unión 1 ×. La mezcla resultante se mantuvo en hielo durante 60 min, después de lo cual las células se permeabilizaron con /ml anexina V-FITC y 50 mg /ml de yoduro de propidio en 1 x tampón de unión 50 g. Las muestras se mantuvieron a 37 ° C durante 60 minutos y se analizaron inmediatamente mediante un BD FACScan citómetro de flujo (Becton Dickinson, San Jose, CA).
Medición del potencial de membrana mitocondrial (Δ
ψ
m)
Las células cultivadas en cubreobjetos con poli-D-lisina se trataron durante 24 h con Embelin en medio de crecimiento, se lavaron rápidamente con PBS, y luego marcadas con 2 M de JC-1 durante 30 min a 37 ° C en un 5% de CO
2 incubadora. Después de lavar varias veces con PBS, los cubreobjetos se montaron en portaobjetos de vidrio utilizando Ultra medio de montaje Cruz. Las señales de fluorescencia se analizaron con un LSM 510 META microscopio de escaneo láser confocal (Zeiss, Jena, Alemania).
La transfección transitoria
Para la transfección transitoria, las células fueron transfectadas con pECE myr-Akt humana o la COX -2 construcciones de luciferasa promotor y vectores pRL-renilla (Promega) utilizando el sistema de transfección de neón según lo recomendado por el fabricante. En resumen, un día antes de la transfección, aproximadamente 5 × 10
5 células por placa de 60 mm se sembraron en medio RPMI 1640 que contiene 10% de FBS. Las células se lavaron en PBS y luego se resuspendieron en medio libre de suero Opti-MEM. La transfección se realizó con 2 g de ADN plásmido durante 5 horas a 37 ° C. Después de la transfección, las células se mantuvieron en medio RPMI que contiene 10% de FBS durante 48 h.
Fraccionamiento subcelular
Después del tratamiento, se recogieron y se lavaron con PBS helado células. Fraccionamiento subcelular se realizó utilizando el kit de aislamiento de las mitocondrias de las células cultivadas y NE-PER nuclear y citoplasmática Kit de Extracción de Thermo Scientific. Western Blot se llevó a cabo usando anticuerpos contra los siguientes proteínas marcadoras de control:. GAPDH para la fracción citosólica, la COX-4 para la fracción mitocondrial o histona-H1for la fracción nuclear
análisis de transferencia de Western
Las células se solubilizaron con tampón de lisis enfriado con hielo (pH 7,4) que contiene mM HEPES 25, 1% de Triton X-100, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, PMSF 1 mM, y 1 mg /ml de leupeptina. Las proteínas extraídas (30 g) se separaron por electroforesis en dodecilsulfato de sodio en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) en 10% geles de poliacrilamida, y se transfirieron electroforéticamente a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon en 5% (w /v) de leche en polvo sin grasa en solución salina tamponada con Tris durante 2 horas a 4 ° C y luego se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios a una dilución de 1: 1000 en 5% (w /v) Tris- solución salina tamponada que contiene 0,1% de Tween-20. Después de la incubación con el anticuerpo secundario durante 2 h, las proteínas se visualizaron por ECL y la intensidad de la banda se analizaron mediante un densitómetro ChemiDoc XRS y se cuantificaron mediante un software Cantidad (Bio-Rad, Richmond, CA). Las concentraciones de proteína se calcula utilizando el método BCA de acuerdo con las recomendaciones del proveedor usando albúmina sérica bovina como estándar.
inmunofluorescencia
Las células cultivadas en cubreobjetos-lisina d poli fueron tratadas durante 24 h con Embelin en medio de crecimiento, se lavó rápidamente con PBS, y después se trató con medio de crecimiento incluyendo 100 nM sondas Mitotracker (Invitrogen). Después de 1 h, las células se fijaron con 3,7% (w /v) de paraformaldehído en PBS, pH 7,4, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS, las células se bloquearon durante 15 min en PBS que contenía 5% de suero de cabra y 0.2% de Triton X-100, a continuación, se incubaron con el anticuerpo primario (1: 1000) durante 1 h, se lavaron extensamente, y se tiñeron durante 1 h con de cabra anti-IgG de conejo-Texas Red (1: 500). Después de lavados adicionales, los cubreobjetos fueron montados en portaobjetos de vidrio usando medio de montaje ultra Cruz. Las señales de fluorescencia fueron analizados mediante el uso de un LSM 510 META microscopio de escaneo láser confocal (Carl Zeiss, Alemania).
Tras el tratamiento con Embelin, se añadió
La reticulación de VDAC
sulfo-EGS en DMSO a una concentración final de 250 mM. Después de 25 min de incubación a 30 ° C, el agente de reticulación se interrumpió mediante la adición de 1 M Tris-HCl (pH 7,5) a una concentración final de 20 mM. Las muestras fueron luego solubilizados en 1% NP-40 y se sonicaron durante 7 s cinco veces con un pulso de 30% usando un sonicador Vibra-Cell (Sonics y Materiales, Newtown, CT).
fragmentación del ADN de ensayo
fragmentos de ADN se extrajeron con el Exgene Cell SV sistema de purificación de ADN genómico (GeneAll, Corea) según el protocolo del fabricante. Los fragmentos de ADN se separaron mediante electroforesis en gel en un gel de agarosa al 1%. ADN cargado fue visualizado por ChemiDoc XRS (Bio Rad).
reportero de luciferasa Dual ensayo
Las células (1 × 10
6 células /pocillo) se cotransfectaron con 2 g de COX-humana constructos de promotor de luciferasa 2 y vectores pRL-Renilla (Promega) o 2 g de vectores de luciferasa TOPFLASH con los sitios de tipo salvaje TVC de unión y FOPFLASH luciferasa vector con el mutante de TCF sitios de unión de acuerdo con el protocolo del fabricante usando el sistema de transfección de neón. Después de 48 h, las células se trataron con 30 Embelin mu M durante los tiempos indicados, y se lisaron con tampón de lisis pasivo, y las actividades de luciferasa se midieron consecutivamente utilizando el Sistema Dual Luciferase Assay (Promega) con un lector de microplacas FilterMax F3 (Molecular Devices, CA) .
cicatrización de heridas ensayo
Las células (1 × 10
6 células /pocillo) se sembraron en placas de cultivo celular de 6 pocillos. Las células se dejaron crecer hasta la confluencia en medio RPMI 1640 que contiene 10% de FBS. Las células se lavaron con PBS y se incubaron con 25 mg /ml de mitomicina C durante 30 minutos. A1-cero mm de ancho se hizo a través de la capa de células usando una punta de pipeta estéril. Las placas se fotografiaron después de la hora indicada.
ensayo de invasión
invasión celular se midió usando el kit de ensayo de invasión celular (Chemicon, Temecula, CA) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células fueron sembradas en un inserto de la cámara de invasión que contiene un tamaño de poro de membrana de policarbonato 8 micras recubierto con una fina capa de colágeno polimerizado. células invasoras en la parte inferior de la membrana de inserción se tiñeron y se fotografiaron.
Gelatina Zymography
Los medios acondicionados se analizaron para gelatinasas por zimografía de gelatina. Para gelatinasas, las muestras se separaron en condiciones no reductoras en SDS al 10% geles de poliacrilamida que incorporan 0,1% de gelatina. Después de SDS-PAGE, el gel se incubó con tampón de renaturalización de 15 min tres veces. A continuación, los geles fueron sustituidos en tampón de desarrollo a 37 ° C durante la noche. Los geles se lavaron y se fotografiaron después de la tinción con solución de azul de Coomassie al 0,5% durante 30 min.
El análisis estadístico
Se realizó un análisis estadístico usando análisis unidireccional de la varianza, seguido de pares de comparación múltiple de Dunnett t-test con el software GraphPad Prism (GraphPad software Inc., CA) cuando sea apropiado. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a *
p Hotel & lt; 0.05.
Resultados
Embelin inhibe la proliferación de células de cáncer de próstata humano
Varias líneas celulares de cáncer humano, incluyendo las células de cáncer de próstata (PC3, DU145 y LNCaP-LN3), humana de células de próstata epitelial (RWPE-1), células de cáncer de mama (MDA-MB-231, MCF-7, y T47D), células de hepatoma (HepG2, Hep3B y Huh-7), y células de coriocarcinoma (JEG-3) fueron tratados con diversas concentraciones de Embelin para determinar los efectos de Embelin sobre la proliferación celular (Fig 1). Embelin inhibió significativamente el crecimiento de células de cáncer de próstata humano en comparación con sus efectos sobre otras células cancerosas. La viabilidad celular se redujo en Embelin en líneas celulares de cáncer de próstata humano y células epiteliales de próstata incluyendo PC3, DU145, LNCaP-LN3 y RWPE-1 con IC
50 valores de 23,6 m, 11,0 m, 32,0 m, y más de 200 M, respectivamente cuando las células se cultivaron durante 24 h (Fig 1E). líneas celulares de cáncer de próstata fueron claramente inhibidas por Embelin, pero las células normales de la próstata no se vio afectada por Embelin en baja concentración durante 24 h. Para estudios posteriores, se seleccionó la concentración de 30 mM de Embelin para el tratamiento de las células PC3.
Las células fueron tratadas con Embelin a diversas concentraciones durante los tiempos indicados. La viabilidad celular se midió por CCK. la formación de formazán se cuantificó por espectrofotometría a 450 nm. Se calculó el porcentaje de células supervivientes en cada grupo en relación con el control. (A) de células PC3. (B) de células DU145. de células (C) LNCaP-LN3. (D) RWPE-1 celular. (E) IC
50 valores de Embelin en diversas líneas celulares de cáncer humano. El IC
50 valores fueron analizados utilizando el software GraphPad Prism. Los valores representan la media ± S.D. de tres determinaciones independientes. *, Significativamente diferente de las células de control no tratados (
p Hotel & lt; 0,05).
La inducción de la apoptosis por Embelin
Para dilucidar si Embelin induce la apoptosis en PC3 células, el análisis de citometría de flujo se realizó con V- anexina y yoduro de propidio (PI), las células teñidas. El tratamiento con 30 Embelin mu M hasta 48 h causó un fuerte aumento de la tasa de apoptosis. Las células tratadas con 30 Embelin mu M durante 12 h y 24 h mostraron un aumento de 15,6 veces y 17,2 veces en la apoptosis en comparación con las células no tratadas (Fig 2A). Después de 48 h de incubación, se observó un aumento significativo en la necrosis en las células Embelin tratados. El tratamiento con Embelin también indujo fragmentación del ADN cromosómico de una manera dependiente del tiempo (Fig 2B). Debido a que la transición de permeabilidad mitocondrial puede conducir a la apoptosis, se determinó el efecto de Embelin en el potencial de membrana mitocondrial (Δ
ψ
m). La figura 2C mostró que Embelin disminuyó fuertemente Δ
ψ
m, indicada como la relación de fluorescencia roja /verde de una manera dependiente del tiempo. Estos resultados sugieren que Embelin es capaz de inducir apoptosis mediante el cambio de la permeabilidad de la membrana mitocondrial.
Las células (A) se incubaron durante los períodos de tiempo indicados con Embelin (30 mM), y se tiñeron con anexina V-FITC y PI . La apoptosis se midió por citometría de flujo. Las poblaciones de células fueron discriminados en cada cuadrante células viables en la parte inferior izquierda (anexina V negativo /negativo PI), las primeras células apoptóticas en la parte superior izquierda (anexina V positivo /negativo PI), a finales de células apoptóticas en la parte superior derecha (anexina V células positivas /PI positivo), y necróticas en el cuadrante inferior derecho (anexina V negativo /positivo PI). (B) La inducción de la fragmentación del ADN en células PC3 por Embelin. Las células fueron incubadas durante los períodos de tiempo indicados con Embelin. El ADN cromosómico se aisló y se determinó la fragmentación del ADN. M, marcador de ADN; P, paclitaxel (1 M). (C) Después de las células PC3 se incubaron con Embelin por períodos de tiempo, las células se marcaron con 2 M de JC-1 durante 30 min y Δ
ψ
m se determinó por microscopía confocal. La relación de JC-1 agregado (rojo) al monómero de intensidad (verde) se calculó con el software Image J. Los valores representan la media ± S.D. de tres determinaciones independientes. *, Significativamente diferente de las células de control no tratados (
p Hotel & lt; 0,05).
Para determinar si Embelin afecta a los niveles de las proteínas relacionadas con la apoptosis en las mitocondrias, que mide la cantidad de Bax (pro-apoptótica), Bcl-2, Bcl-xL, y MCL-1 (anti-apoptóticos). Como se muestra en la figura 3A y 3B, se encontró que Embelin (30 M) inducida fuertemente la translocación de Bax del citosol a las mitocondrias. Los niveles de expresión de proteínas de la familia Bcl-2 anti-apoptóticas tales como Bcl-2, Bcl-xL, y MCL-1 se redujo significativamente por Embelin. A las 24 h después del tratamiento Embelin, los niveles de Bcl-2, Bcl-xL, y MCL-1 fueron 15%, 58% y 28% del nivel de control, respectivamente. La liberación de citocromo
c de la mitocondria
a citosol también se mejoró en presencia de Embelin (figura 3C). A las 24 h después del tratamiento Embelin, el citocromo
c
nivel se redujo a 45% en las mitocondrias, sino en el citosol citocromo
c
nivel se incrementó a 1,8 veces del nivel de control. análisis microscópico confocal también mostró que mejora Embelin Bax translocación a la mitocondria y el citocromo
c
liberación al citosol (Figura 3B y 3D). También se encontró que Embelin induce la translocación del factor inductor de apoptosis (AIF) de las mitocondrias, a través del citosol, y finalmente al núcleo (Fig 3E). análisis microscópico confocal indica que el tratamiento con Embelin mejora AIF translocación al núcleo (Fig 3F). Para determinar si Embelin induce oligomerización de VDAC para promover cambios en Δ
ψ
m, y la liberación de citocromo
c
y FIA, las células fueron tratadas con sulfo-EGS para generar cruzada la vinculación entre VDAC, y oligomerización de VDAC se determinó por transferencia de Western usando un anticuerpo anti-VDAC1. Cuando las células se trataron con Embelin (30 mM) durante hasta 24 h, Embelin indujo claramente la expresión y la dimerización de VDAC1 de una manera dependiente del tiempo (Fig 3G). Estos resultados sugieren que VDAC1 podría ser un mediador de la apoptosis inducida por Embelin y que oligomerización VDAC inducida por Embelin potencialmente podría determinar su capacidad gating para el flujo de salida de las proteínas mitocondriales, tales como citocromo
c
y AIF.
(A), (C), (e) La translocación de proteínas pro-apoptóticos (Bax), citocromo
c
, AIF, y el nivel de proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2, Bcl-xL , MCL-1) se analizaron por transferencia de Western. Las células fueron tratadas con Embelin para los períodos de tiempo indicados. Después de la incubación, las células fueron cosechadas y la citosólica y las fracciones mitocondriales fueron aislados. proteínas extraídas fueron resueltas por SDS-PAGE (10%) y Western blot se llevó a cabo. nivel de GAPDH se determinó como controles de carga para el citosol y los lisados totales. nivel de COX-4 se determinó como control de carga para las mitocondrias. nivel de la histona H1 se determinó como control de carga para la fracción nuclear. C, fracción citosólica, M, fracción mitocondrial, N, fracción nuclear. Los números entre las manchas son los cocientes de la intensidad de las bandas después de normalizado con el control. (B), (D), (F) La translocación de Bax (B), el citocromo
c
(D), y AIF (F). Las células se cultivaron en portaobjetos de microscopio y se trataron con Embelin durante 24 h. Después del tratamiento, las células se fijaron, permeabilizaron y posteriormente se tiñeron utilizando el anticuerpo específico. Las células fueron teñidas con el anticuerpo secundario marcado con rojo Texas. La fluorescencia se determinó usando microscopía confocal. G, la expresión de VDAC1 y oligomerización de VDAC1. Se recogieron las células tratadas con Embelin y después se incubaron con sulfo-EGS (250 mM) durante 25 min a 30 ° C. Después de proteínas se resolvieron mediante SDS-PAGE (8%), VDAC1 proteínas se midieron utilizando un análisis de transferencia Western. Una banda de 33 kDa representa monómeros VDAC1 mientras una banda a 65 kDa representa el dímero VDAC1. fracción mitocondrial se aisló y se resolvió por SDS-PAGE (12%) y análisis de transferencia de Western se llevó a cabo. nivel de la COX-4 se determinó como control de carga de las mitocondrias.
La inhibición por Embelin de Akt activación y β-catenina vía
Anteriormente Chen et al. informado de una nueva vía que consta de Akt, y la COX-2 para la resistencia a la apoptosis adquirido en células de cáncer [17]. Debido a que se encontró que suprime Embelin se determinó la fosforilación de Akt y la COX-2 de expresión. Las células se trataron con 30 Embelin mu M durante 6, 12, o 24 h y los niveles de fosfo-Akt (Ser 473), Akt total, y la COX-2 se midieron por análisis de transferencia Western. Como se muestra en la figura 4A, la fosforilación de Akt en Ser 473 y la expresión de COX-2 se redujo significativamente por Embelin, aunque los niveles totales de Akt no cambiaron significativamente. A las 24 h después del tratamiento Embelin, los niveles de fosfo-Akt y COX-2 se redujeron en 99% y 52%, respectivamente, desde el nivel de las células de control. Al mismo tiempo, se evaluó la inhibición de la activación de Akt en células PC3, la fosforilación de Akt y la viabilidad celular se redujo en un inhibidor de Akt IV (0,3 M) (Fig 4B). Cuando las células se transfectaron con el plásmido pECE-Myr-Akt para la expresión de Akt constitutivamente activa, Embelin mediada por disminución de la fosforilación de Akt en Ser 473 (Fig 4C). Por otra parte, se encontró que la disminución Embelin mediada en la viabilidad celular fue impedido por la expresión de Akt myristoylated. Embelin también inhibe COX-2 la actividad del promotor, tal como se determina por el ensayo de indicador de luciferasa, lo que indica que pueden inhibir Embelin MCL-1 expresión a través de bloqueo de Akt-COX-MCL-1 vía.
Las células (A) fueron tratados con se prepararon Embelin 30 mM para los períodos de tiempo indicados, y su conjunto de células lisados, y las proteínas extraídas se resolvieron mediante SDS-PAGE (10%) y análisis de transferencia de Western usando fosfo-Akt, Akt total y anticuerpos de la COX-2 se llevó a cabo. Los números entre las manchas son los cocientes de la intensidad de las bandas después de normalizado con el control. (B) Las células se transfectaron con Myr-Akt plásmido y luego tratados con 30 M de Embelin durante 24 h. La viabilidad celular se midió por CCK. Los valores representan la media ± S.D. de tres determinaciones independientes. *, Significativamente diferente de las células de control sin tratar (
p
& lt; 0,01) y **, significativamente diferentes de la Embelin células sólo tratadas con (
p
& lt; 0,001). Lisados de células enteras se prepararon y los niveles de Akt total y fosfo-Akt se determinaron por análisis de transferencia Western. (C) inhibidor de AKT IV tratado lisados celulares se prepararon y proteínas extraídas se resolvieron mediante SDS-PAGE (10%) y análisis de transferencia de Western usando fósforo-Akt, Akt total y se llevó a cabo anticuerpos GAPDH. Las células se trataron con 0,312 M de AKT inhibidor IV de 24 h. La viabilidad celular se midió por CCK. la formación de formazán se cuantificó por espectrofotometría a 450 nm. Se calculó el porcentaje de células supervivientes en cada grupo en relación con el control. (D) Las células fueron transfectadas con COX-2 vector de la luciferasa y el vector de renilla luciferasa durante 48 h. Las células se sometieron al ensayo de doble luciferasa. La actividad luciferasa de luciérnaga relativa, normalizada por la actividad de luciferasa de Renilla, se muestra. Los valores representan la media ± S.D. de tres determinaciones independientes *, significativamente diferente de los controles no tratados (
p Hotel & lt; 0,05)..
Informe anterior sugiere que β-catenina juegan un papel crucial en múltiples señales de crecimiento en células de cáncer de próstata humano [23]. Para determinar el efecto de Embelin sobre la expresión de β-catenina, las células PC3 se trataron con Embelin (30 mM) durante hasta 24 h y se realizó inmunotransferencia de tipo Western. Fig 5A mostró que Embelin es capaz de disminuir el nivel de β-catenina de una manera dependiente del tiempo. A las 24 h después del tratamiento Embelin, el nivel de β-catenina se redujo en un 40% desde el nivel en células de control. Se determinó la actividad de luciferasa TOP flash para medir el nivel de β-catenina translocación nuclear y la activación de la transcripción TCF. Embelin (30 mM) inhibió significativamente la actividad TOPflash a 19% del control a las 24 h de tratamiento (Figura 5B). análisis microscópico confocal también confirmó que el tratamiento con Embelin disminuye claramente el nivel de β-catenina en células PC3 (Fig 5C). La transcripción de los genes diana de β-catenina, como la ciclina D1, c-myc, o MMP-7 también se suprimió significativamente por Embelin (Fig 5D). Curiosamente, la transcripción del mRNA de MMP-7 fue casi completamente bloqueado después de 12 h de tratamiento con Embelin. El análisis de transferencia Western demostró también que Embelin disminuyó fuertemente ciclina D1, c-Myc, y MMP-7 niveles de proteína (Fig 5D).
(A) Lisados de células enteras se prepararon y proteínas extraídas se resolvieron por SDS-PAGE (10%) y análisis de transferencia Western utilizando β-catenina, fosfo-β-catenina, o anticuerpos GSK-3ß se llevó a cabo. Los números entre las manchas son los cocientes de la intensidad de las bandas después de normalizado con el control. (B) Ensayo de la luciferasa. TOPflash o transfección de células fueron tratadas con FOPFLASH Embelin. Se midió la actividad de luciferasa, y la actividad luciferasa de luciérnaga relativa, normalizada por la actividad de luciferasa de Renilla, se muestra. (C) Las células se sembraron en cubreobjetos de 24 h y se trataron con 30 mM Embelin hasta 24 h. A continuación, las células se tiñeron con anticuerpo β-catenina y la fluorescencia se determinó usando microscopía confocal. (D) Expresión de ciclina D1, c-Myc y MMP-7 se determinó mediante el uso de PCR cuantitativa y análisis de transferencia Western. Los valores representan la media ± S.D. de tres determinaciones independientes *,
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§, significativamente diferente de los controles no tratados (
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& lt; 0,05).. Los números entre las manchas son las proporciones de la intensidad de las bandas después normalizaron con el control.
Informe anterior sugiere que la GSK-3β modula los niveles de β-catenina por la fosforilación de β-catenina en Ser 33/37 y Thr 41 [24]. Hemos examinado si Embelin es capaz de mejorar la estabilidad y la actividad de GSK-3β. Como se muestra en la figura 6A, se encontró que Embelin impedido fuertemente la fosforilación de GSK-3β en Ser 9 por la activación de Akt. Embelin fuertemente inducida por la fosforilación de β-catenina en Ser 33/37 /Thr 41 y podría promover la degradación de β-catenina. La hipótesis de que el aumento Embelin mediada por la fosforilación de β-catenina puede ser causada por la activación de GSK-3β porque la disminución del nivel β-catenina por tratamiento Embelin fue casi completamente recuperado por tratamiento con LiCl (20 mM), un inhibidor de GSK-3β . LiCl también disminuyó la inducción Embelin mediada por fosforilación de β-catenina. A medida que el tratamiento con LiCl no se recuperó disminución Embelin mediada por la fosforilación de GSK-3β, LiCl puede inhibir la actividad de GSK-3β pero no cambiar la fosforilación de GSK-3β. Curiosamente, el nivel de MCL-1 se incrementó 1,4 veces por LiCl tratamiento y la disminución del nivel de Embelin MCL-1BY se recuperó de manera significativa por LiCl (Figura 6A). Estos resultados sugieren que MCL-1 de expresión está modulada por la actividad de GSK-3β. Maurer et al. informó de que la inhibición de la GSK-3β través de la activación de Akt inducida MCL-1 de expresión [25]. Nuestros datos también confirman que la activación de GSK-3β por la inhibición de Akt mediada por Embelin suprime MCL-1 de expresión. Por otra parte, LiCl indujo actividad TOPflash 2,5 veces de control y Embelin inhibió la activación de la transcripción TCF causado por el aumento inducido por LiCl en β-catenina (Fig 6B). análisis microscópico confocal mostró que el tratamiento con Embelin casi completamente inhibió la expresión β-catenina (Fig 6C). El tratamiento con LiCl recuperó disminución Embelin mediada por la expresión de β-catenina. Chen et al.