Extracto
La nicotinamida fosforribosiltransferasa (NAMPT) juega un papel importante en la bioenergética celular. Es responsable de la conversión de la nicotinamida adenina dinucleótido de nicotinamida, una molécula esencial en el metabolismo celular. NAMPT ha sido ampliamente estudiado en la última década debido a su papel como un regulador clave de enzimas dinucleótido de nicotinamida-adenina consumir. NAMPT también se conoce como un objetivo potencial para la intervención terapéutica, debido a su implicación en la enfermedad. En el presente estudio, hemos utilizado un enfoque metabolómica basada en la espectrometría de masas global para investigar los efectos de FK866, un inhibidor de molécula pequeña de NAMPT actualmente en ensayos clínicos, en las perturbaciones metabólicas en las células cancerosas humanas. Se han tratado A2780 (cáncer de ovario) y HCT-116 (cáncer colorrectal) líneas celulares con FK866 en presencia y ausencia de ácido nicotínico. Se observaron cambios significativos en el metabolismo de los aminoácidos y de la purina y pirimidina metabolismo. También observamos alteraciones metabólicas de la glucólisis, el ciclo del ácido cítrico (TCA), y la vía de las pentosas fosfato. Para ampliar la gama de los metabolitos polares detectados y mejorar la confianza de los datos, se aplicó un metabolómica globales de perfiles mediante el uso de la plataforma tanto no específica y selectiva hidrófila (HILIC) -LC-MS análisis y GC-MS. Utilizamos Ingenuity Knowledge Base para facilitar la proyección de la metabolómica datos sobre las rutas metabólicas. Varias rutas metabólicas mostraron respuestas diferenciales a FK866 sobre la base de varios partidos a la lista de los metabolitos anotados. Este estudio sugiere que la metabolómica globales pueden ser una herramienta útil en estudios farmacológicos del mecanismo de acción de los fármacos a nivel celular
Visto:. Tolstikov V, Nikolayev A, S Dong, Zhao G, Kuo MS (2014 ) Análisis de la metabolómica efectos metabólicos de la nicotinamida fosforribosiltransferasa (NAMPT) La inhibición de células de cáncer humano. PLoS ONE 9 (12): e114019. doi: 10.1371 /journal.pone.0114019
Editor: Ramón Campos-Olivas, Centro Nacional del Cáncer Español, España |
Recibido: 24 Febrero, 2014; Aceptado: 4 de noviembre de 2014; Publicado: December 8, 2014
Derechos de Autor © 2014 Tolstikov et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por Eli Lilly and Company. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores son empleados de Eli Lilly and Company y, como tales, tienen afiliaciones, o participación financiera con Eli Lilly and Company. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
Como continuación a un estudio previo sobre la inhibición farmacológica de nicotinamida fosforribosiltransferasa (NAMPT) que describe el base metabólica de la inhibición NAMPT [1], Presentamos aquí los resultados de un análisis global de la metabolómica que revelaron las alteraciones metabólicas de la inhibición NAMPT en células cancerosas humanas. La adenina dinucleótido (NAD) cofactor nicotinamida es esencial para una variedad de procesos celulares. En los mamíferos, NAD puede sintetizarse a partir de nicotinamida, ácido nicotínico, o triptófano [2] - [5]. La concentración in vivo de ácido nicotínico es bajo debido a su rápida excreción y metabolismo, lo que sugiere que la utilización de ácido nicotínico para la biosíntesis de NAD en comparación con nicotinamida se limita en los mamíferos [3]. La biosíntesis de novo de NAD a partir de triptófano se produce principalmente en el hígado [4]. Por lo tanto, la ruta de recuperación de dos pasos que convierte nicotinamida de NAD representa la principal vía para la biosíntesis de NAD en los mamíferos [6] - [8]. NAMPT, originalmente identificado como un factor de colonias de mejora de células pre-B [9], es la enzima limitante de la velocidad que cataliza el primer paso en la biosíntesis de NAD a partir de nicotinamida [10], [11]. Estudios recientes han demostrado que NAMPT mediada por la biosíntesis de NAD en células de cáncer juega un papel crucial en diversos procesos fisiológicos, incluyendo el metabolismo, la generación de energía, la supervivencia, apoptosis, reparación del ADN, y la inflamación [2], [12] - [14]. Se demostró que NAMPT se sobreexpresa en varios tipos de tumores, incluyendo cáncer de mama, colorrectal, gástrico, de pulmón, de próstata, y otros carcinomas [15] - [18], y su expresión parece estar asociada con la progresión del tumor [19]. En la célula, NAMPT es abundante en el citosol y presente en el núcleo. Ha sido adecuadamente informado de que la rotación de NAD en el cáncer o células en proliferación se incrementa significativamente en las células sanas o no proliferativas [1], [7]. Estas observaciones sobre la posible participación de NAMPT en la enfermedad han sido apoyados por diversos enfoques en los estudios de células de cáncer [10] - [14]. La baja regulación de NAMPT suprime el crecimiento de células tumorales in vitro e in vivo y sensibiliza a las células al estrés oxidativo y agentes que dañan el ADN [8], [15], [18], [20] - [22]. La inhibición de la NAMPT también conduce a la atenuación del crecimiento tumoral y la inducción de la apoptosis debido a NAD agotamiento [8], [21] - [24]. Tomados en conjunto, NAMPT ejemplifica una diana terapéutica prometedora para el desarrollo de potenciales nuevos fármacos contra el cáncer.
NAD es un sustrato para deshidrogenasas, poli (ADP-ribosa) polimerasas, las sirtuinas, mono (ADP-ribosil) transferasas, y ciclasas ADP-ribosilo [2], [4], [12]. En la mayoría de las células cancerosas, poli (ADP-ribosa) polimerasa, una proteína clave necesario para la reparación del ADN, que también está implicado en la apoptosis, se activa debido a daños en el ADN y la inestabilidad del genoma [2], [25] - [27]. La activación de poli (ADP-ribosa) polimerasa conduce al agotamiento de NAD en células de cáncer [2], [8], [25] - [27]. Como resultado de ello, la baja regulación de NAMPT sensibiliza las células cancerosas a los agentes que dañan el ADN y la apoptosis [10], [21]. Del mismo modo, la proteína Sir2 también sirve como un efector aguas abajo de clave NAMPT que regula una variedad de funciones celulares, incluyendo la supervivencia y la inflamación [28] - [30]. Estudios recientes han demostrado que las proteínas Sir2 regular la producción de citoquinas [30], que a su vez reduce los niveles de NAD a través de la inhibición de la NAMPT. Por otra parte, un inhibidor de NAMPT ha demostrado tener efectos anti-inflamatorios en modelos animales de inflamación [20], [30]. Por último, el mecanismo clave de la acción de la inhibición NAMPT es el bloqueo de la glicólisis en el paso deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato responsables del agotamiento de la adenosina trifosfato (ATP), la perturbación metabólica, y la inhibición del crecimiento tumoral posterior [1]. Sin embargo, la forma en la modulación de la actividad NAMPT en células de cáncer afecta el metabolismo celular, fuera del metabolismo de la energía como se informó anteriormente [1], sigue siendo desconocido. FK866, un inhibidor de molécula pequeña de NAMPT, ha sido objeto de amplios estudios [2], [21], [31]. La molécula ha sido co-cristalizado con y se encontró que estar ligado a la unión nicotinamida bolsillo de NAMPT, lo que demuestra su mecanismo como un inhibidor competitivo de NAMPT con respecto a nicotinamida [32]. Varios estudios también sugieren que la FK866 inhibe específicamente NAMPT en la célula y muestra actividad antitumoral en modelos de tumores preclínicos [11], [14], [20], [30], [32] - [35]. Por lo tanto, FK866 parece ser una molécula de herramienta ideal para la evaluación de la función fisiológica de NAMPT en la célula. En el presente estudio, hemos querido evaluar más a fondo los efectos globales de la inhibición NAMPT por FK866 sobre el metabolismo del cáncer mediante el uso de perfiles metabólicos basado en la espectrometría de masas global. Hemos elegido dos líneas celulares de cáncer humano que difieren en la forma en que usan ácido nicotínico y la nicotinamida para la formación de NAD, asumiendo que la adición de ácido nicotínico al medio de crecimiento puede abolir la inhibición NAMPT en una línea celular, pero no en la otra. Hemos encontrado que la inhibición de la NAMPT por los resultados de FK866 en la alteración de numerosas vías metabólicas mucho más allá de metabolismo de la energía. Por lo tanto, el enfoque de perfiles metabólicos basado en la espectrometría de masas global es una herramienta útil para estudios sobre el mecanismo de acción de drogas y para la identificación de posibles marcadores farmacodinámicos.
Materiales y Métodos
Diseño del estudio
Cada una de dos líneas de células fueron tratados con 5 y 50 nM de FK866 (en 0,1% de DMSO) y 0,1% DMSO con o sin ácido nicotínico (10 M) durante 24 horas. Cada grupo fue alimentado con 6 réplicas biológicas. Las líneas celulares que no fueron tratados con el fármaco y el ácido nicotínico sirvieron como controles.
Cancer Cells
A2780 (NCI DCTD), una línea celular de cáncer de ovario y HCT-116 (ATCC), una línea celular de cáncer colorrectal, se cultivaron en RPMI 1640 (Invitrogen 30 a 2001) y McCoys 5A (Hyclone SH30200), respectivamente, en presencia de 10% de FBS. Las células se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos a una densidad de 1,0 × 10
6 células por pocillo y se incubaron a 37 ° C en 5% de CO
2 durante 24 horas y después se trató con FK866 en DMSO a varias concentraciones durante 24 horas. FK866 se sintetizó como se ha descrito anteriormente [36], [37]. Como parte del diseño del estudio, las células también se hicieron crecer y se trataron con ácido nicotínico (10 M) y FK866 durante 24 horas antes de la cosecha. La viabilidad celular se evaluó mediante la medición de contenido de proteína total usando un kit de CytoScan SRB Ensayo de citotoxicidad (Cat No. 786-213;. G-Biosciences, St. Louis, MO). Después de 24 horas de tratamiento, el medio se retiró y se pre-enfriado a -20 ° C; A continuación, se añadieron 500 l de metanol al 80% a cada pocillo. Las células se rasparon y se recogieron a -20 ° C en tubos de 1,5 ml Eppendorf. Después de 60 minutos, los tubos Eppendorf se centrifugaron durante 5 minutos a 14.000 revoluciones por minuto y se colocan sobrenadante a tubos nuevos para su posterior análisis.
metabolómica Análisis
Los análisis se realizaron con no específica y selectiva protocolos que utilizan una metodología GC-TOF-HRMS, hidrófila (HILIC) -LC-HRMS y HILIC-LC-MS /MS instrumentación La implementación se informó anteriormente [38] - [40]. Se inyectó una muestra de control de calidad estándar (QC) que contiene una mezcla de aminoácidos y ácidos orgánicos diariamente para controlar la respuesta del espectrómetro de masas. La muestra de control de calidad agrupado se obtiene tomando una parte alícuota del mismo volumen de todas las muestras del estudio. La muestra de control de calidad agrupado se inyecta diariamente con un lote de muestras analizadas y se utilizó para determinar la dilución óptima de las muestras del lote y para validar identificación de metabolitos y la integración de pico (S1 File). Los sobrenadantes de los extractos celulares se dividieron en tres partes: 75 mu l para el análisis de GC-TOF-MS, 175 l para HILIC-LC /MS análisis, y 175 l para HILIC-LC /MS /MS análisis
. la derivación de muestras y análisis GC-TOF-HRMS
los extractos se secaron usando SpeedVac Concentrador Savant DNA120 (ThermoScientific, San Jose, CA) con la temperatura del baño fijado por debajo de 30 ° C. muestras pre-refrigerados se secaron adicionalmente durante 1 hora usando una zona libre de liofilizador (Labconco, Kansas City, MO). derivatización muestra seca con hidrocloruro de metoxilamina en piridina y N-metil-N-trimetilsililtrifluoroacetamida se realizó como se describe por Tong et al. [37]. La cromatografía de gases se realizó utilizando un cromatógrafo de gases Agilent 7890A (Agilent, Palo Alto, CA) en interfaz con una alta resolución de tiempo de vuelo Pegasus GC-HRT espectrómetro de masas (Leco, St. Joseph, MI). automatizados inyecciones se realizaron utilizando un muestreador programable multiuso robótico MPS2 (Gerstel, Mühlheim an der Ruhr, Alemania). El sistema GC fue equipado con un inyector de temperatura programada Gerstel, sistema de inyección (modelo de CIS 4) enfriado. Un intercambio automatizado de revestimiento (ALEX) (Gerstel) fue utilizado para eliminar la contaminación cruzada de la matriz de la muestra que se estaba produciendo entre las corridas de muestra. Se utilizaron múltiples revestimientos desconcertado desactivados para la entrada del CG. El inyector Gerstel fue programado para la siguiente secuencia: temperatura inicial de 50 ° C, mantenida durante 0,1 minuto, aumentar la temperatura a una velocidad de 10 ° C-1 a una temperatura final de 330 ° C, y de detención de 15 minutos). Las inyecciones de 1 l se hicieron en el modo sin división. La cromatografía se realizó en una columna RTX 5Sil MS (longitud: 30 m; ID: 0,25 mm; df: 0,25 m) con una columna de Integra-Guard (Restek, Bellefonte, PA). gas portador helio se utilizó a un flujo constante de 1 ml min-1. La temperatura del horno GC fue programado para la siguiente secuencia: 50 ° C de temperatura inicial con un tiempo de retención de 1-minuto y luego el aumento gradual a 10 ° C por minuto hasta una temperatura de 140 ° C, a continuación, el aumento gradual a 4 ° C por minuto a una temperatura de 240 ° C y, a continuación, el aumento gradual en 10 ° C por minuto hasta una temperatura de 300 ° C con un tiempo de retención de 8 minutos. Tanto la línea de transferencia y las temperaturas eran de origen 250 ° C. fuente de iones funciona a -70 kV tensión de filamento. Después de un retraso de disolvente de 500 segundos, espectros de masas se adquirieron en el 2,4 espectros por segundo con una frecuencia de extracción de 2 kHz y un rango de masa de entre 60 y 520 m /z. Resolución se establece en 25 K. exactitud misa fue controlado con la sintonización PFTBA a un nivel sub-ppm durante todo el tiempo de ejecución. Los QC estándar y QC muestra combinada se utilizan para controlar la adquisición de GC-TOF-HRMS de datos (S1 File) [41] - [43]. la calibración del espectrómetro de masas se realizó en base diaria usando el protocolo del proveedor. exactitud de la masa se mantuvo rutinariamente en un nivel sub-ppm con una resolución de 30 a 40 K. El análisis de datos se realizó con el software del proveedor ChromaTof (LECO, St. Joseph, MI) y AnalyzerPro (SpectralWorks Ltd, Runcorn, Reino Unido) utilizando la última la base de datos NIST-MS (http://chemdata.nist.gov/).
HILIC-LC-MS /MS Análisis
Los extractos fueron utilizados sin ninguna derivatización adicional. HILIC-LC-MS /MS adquisición y procesamiento de datos monitorizados mediante círculos de calidad estándar [42], [43] y QC muestras reunidas (S1) de archivos. cromatografía líquida se realizó utilizando el sistema NEXERA UPLC (Shimadzu, Columbia, MD) junto con el Sistema de Triple Quad 5500 (AB Sciex, Framingham, MA). separaciones HILIC se lograron usando una columna de gel polimérico de poliamina-enlazado (apHera NH2 Polymer) con un tamaño de partícula 150 × 2 mm, 5-m, equipado con una columna de guarda (apHera NH2 Polymer) con un 10 × 2 mm, 5-micras tamaño de partícula (SUPELCO, Bellefonte, PA). Las fases móviles fueron acetonitrilo (A) y bicarbonato de amonio 50 mM (pH 9,4, ajustado con hidróxido de amonio) (B) en las tasas de flujo de 0,25 ml /min a 30 ° C. Después de 3 minutos barrido isocrático al 15% de B, un gradiente de 30% de B se concluyó a los 12 minutos y un gradiente de 60% de B se concluyó a los 15 minutos. Después de eso, un gradiente de 75% de B se concluyó a los 21 minutos y un gradiente de 98% de B se completó en 22 minutos. Después de lavar la columna, la carrera se concluyó con un 98% de B en 29 minutos. de equilibrado de la columna con un tampón de partida tomó 6 minutos antes de la siguiente inyección. La adquisición de datos se realizó mediante MRM programados. lista Total contenía más de 200 transiciones MRM generados con estándares auténticos en positivo y en los modos negativos [43] (S1) de archivos.
HILIC-LC-HRMS Análisis
Los extractos se utilizaron sin más derivatización. Los QC de normalización y QC muestra combinada se utilizan para controlar la adquisición HILIC-LC-HRMS de datos como se ha descrito previamente (File S1) [42] - [44]. cromatografía líquida se realizó usando el sistema Waters UPLC (Waters, Milford, MA) junto con el Sistema de Triple TOF 5600 (AB Sciex). separaciones HILIC se lograron usando los protocolos descritos anteriormente. El dependiente experimento de adquisición de información se utiliza para la adquisición de datos dentro de un intervalo de masa 70-800 m /z para iones positivos y negativos por separado. Los datos se procesaron utilizando la versión 1.2.1 del software MarkerView (AB Sciex). El clavar muestras mezcladas con patrones auténticos comercialmente disponibles permitieron la identificación de los componentes de la muestra. Los datos se recogieron para los iones positivos y negativos por separado dentro de un intervalo de masa 70-800 m /z, la aplicación de experimento destinado a fragmentar todos los iones superiores umbral seleccionado mientras se aplica energía de rodadura fragmentación. de calibración del espectrómetro de masas se realizó en base diaria utilizando el protocolo del proveedor para iones positivos y negativos. exactitud de la masa se mantuvo rutinariamente a las 5 ppm de nivel a una resolución de 20 a 30K. Identificación de los componentes se llevó a cabo con patrones auténticos clavar cuando esté disponible. Desconocido componentes se identificaron utilizando datos espectrales recalibrado con la ayuda de software Peakview versión 1.2.0.3 (AB Sciex). recalibración por lotes se realizó utilizando componentes previamente identificados que tienen diferentes masas y tiempos de retención como estándares internos. Este protocolo permitió la realización rutinaria de un 2 a 5 ppm desviación precisión la masa de los iones matrices y sus fragmentos (S1) de archivos. METLIN (http://metlin.scripps.edu/index.php), HMDB (http://www.hmdb.ca/), MASSBANK (http://www.massbank.jp/), NIST-MS (http : //chemdata.nist.gov/), IDEOME (http://mzmatch.sourceforge.net/ideom.php), mzCloud (https://mzcloud.org/), y en la casa HRMS y genera HRMS /MS bases de datos se utilizaron para la asignación elemental composición, las comparaciones de datos espectrales y la interpretación manual detallado. Este protocolo de descubrimiento permitió la anotación de los metabolitos, que no estaban disponibles en el mercado (S1 Archivo). datos anotados se procesaron con el software de la versión 1.2.1 MarkerView (AB Sciex) para calcular el área del pico de metabolito. características no identificados fueron excluidos sistemáticamente de la lista de pico. datos HILIC-LC-HRMS se utilizaron para aclarar la diafonía observado durante el análisis HILIC-LC-MS /MS, y se utilizan para la medición de los metabolitos que tenía concentraciones superiores al rango lineal durante el análisis HILIC-LC-MS /MS . También se utiliza para tiempos de retención de asignación de isómeros (S1) de archivos.
Tratamiento de datos y análisis estadístico
GC-MS análisis de datos utilizando ChromaTof permitió la generación de listas de pico, que se extrajo de nuevo al otro lado hojas de datos y combinados en una lista maestra. Además, el procesamiento de los datos se realizó con AnalyzerPro y un analizador de matriz add-on se utilizó para generar una biblioteca de destino de matriz. La base de datos NIST-MS se utilizó para generar esta biblioteca. Este protocolo dio como resultado la generación de varios miles de características. Los datos se filtran adicionalmente como se describe en Chan et al. [41] y Dunn et al. [42] y se fusionó con los datos generados con la ayuda ChromaTof. inspección y eliminación de duplicados manual se realizó para formar una mesa final de pico metabolitos identificados y medidos con el método GC-MS. La mediana de la normalización de datos (fila de escala), la transformación logarítmica, y el escalamiento de datos (Pareto) para los datos de LC-MS-MS y GC se realizaron utilizando la versión de software 2.0 MetaboAnalyst [45] con el fin de compensar la variación inter e intra-instrumental. Una tabla de picos metabolito final se construyó mediante la fusión de los datos adquiridos con los todos los métodos. pico de la lista, generada con el método LC-MS /MS, sirvió como base para la fusión e integración de datos (S1 Archivo). Duplicados introducidas con los métodos complementarios (GC-HRMS y HILIC-LC-HRMS) se retiraron después de la inspección manual. intensidades de metabolitos a partir de muestras individuales se normalizaron a la concentración de proteínas antes de continuar con el análisis estadístico correspondiente. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando métodos univariados y multivariados. MetaboAnalyst versión 2.0 [45] y la versión JMP 11 paquetes fueron utilizados para los análisis estadísticos. Análisis de la varianza (ANOVA) seguido de la prueba múltiple Comparación de Dunnett se realizó para las comparaciones de datos entre los grupos, definidos con el diseño del estudio de la siguiente manera: control (designada como -NA) y las células tratadas (designado como + NA, 50 nM-NA, 5 nM-NA, 50 nM + NA, 5 nM + NA). Las figuras contienen ilustraciones de los resultados del ANOVA tienen información gráfica explica como sigue: las diferencias entre grupos se consideraron estadísticamente significativas cuando p & lt; 0,05. Gran media se muestra como una línea horizontal situado dentro del panel (Fig. 1). El eje Y muestra normalizada, transformados log, y ampliarse el área del pico. Los grupos experimentales en los diferentes tratamientos se clasifican a su vez mediante la agrupación jerárquica sin supervisión, análisis de componentes principales, y supervisados de análisis multivariante de mínimos cuadrados parciales discriminante-análisis (S3 Archivo).
Grand media se muestra como una línea horizontal que se encuentra dentro del panel . El eje Y muestra normalizada, transformados log, y ampliarse el área del pico. Los puntos representan muestras. Media del grupo muestra como una línea horizontal dentro de la caja.
Camino y Análisis de Redes
Los metabolitos identificados fueron sometidos a análisis de IPA (Sistema de Ingenio, Redwood City, CA). números de acceso de los metabolitos detectados (HMDB, PubChem, y KEGG Identificadores) se enumeran en MS Excel e importados en IPA para trazar las vías canónicas y generar redes de interacción entidades biológicas. Se han presentado datos como valores de cambio veces (ratios) calculados contra el grupo de control (designado como -NA). Se llevaron a cabo análisis exhaustivos de la vía y de la red. procesos biológicos corriente abajo se calificaron de acuerdo al soporte ontología usando Ingenuity Knowledge Base (http://www.ingenuity.com/science/knowledge-base). la configuración del análisis del IPA fueron los siguientes:
conjunto de referencia:. Ingenuity Knowledge Base (productos químicos endógenos)
Relación de incluir:.. directa e indirecta
Incluye productos químicos endógenos
resumen Filtro: solo deben considerarse las relaciones de confianza, donde se observa experimentalmente o alto (valor de referencia)
El análisis incluyó ajuste de los datos recogidos a partir de células humanas
P-valor es la explicación.. de la siguiente manera: una medida de la probabilidad de que la asociación entre un conjunto de metabolitos en el conjunto de datos y una función relacionada es debido a la asociación aleatoria. Cuanto menor sea el valor de p, menos probable es que la asociación es al azar y la más significativa la asociación. En general, los valores de p & lt; 0,05 generales indican una asociación estadísticamente significativa, no aleatoria. IPA utiliza el algoritmo de puntuación z de activación para hacer predicciones. El algoritmo de puntuación z está diseñado para producir ya sea una predicción de la activación o la inhibición (o no predicción), así como para reducir la posibilidad de que datos aleatorios generarán predicciones significativas.
Resultados
para evaluar los efectos de la inhibición NAMPT sobre el metabolismo de cáncer, se utilizaron dos líneas celulares diferentes: A2780, una línea celular NARPT-negativa que sólo se puede utilizar la vía de nicotinamida NAMPT mediada para la biosíntesis de NAD, y HCT-116, una célula NAPRT-positivo línea que puede utilizar tanto nicotinamida NAMPT mediada por las vías y ácido nicotínico mediadas por NAPRT para la biosíntesis de NAD. Debido HCT-116 se puede utilizar nicotinamida y ácido nicotínico para la formación de NAD, la adición de ácido nicotínico al medio de crecimiento puede abolir la inhibición NAMPT en HCT-116, pero no en A2780. Por lo tanto, se utilizó el ácido nicotínico en el presente estudio para evaluar la especificidad de los inhibidores de Nampt.
Aminoácidos Metabolismo
El uso de protocolos globales metabolómica, se observó cambios significativos en el metabolismo de los aminoácidos en la inhibición NAMPT con FK866 en ambas líneas celulares, con la excepción de la glicina y serina metabolismo, el metabolismo de la arginina, la histidina y el metabolismo (S2-S5 archivos). Como se muestra en la Fig. 1, la alanina y aspartato metabolismo se vieron afectados significativamente. Se observaron dosis de fármaco cambios inducidos dependientes en aspartato, alanina, y los niveles de N-carbamoil-aspartato. La adición de ácido nicotínico completamente abolida estos efectos observados en HCT-116, pero no en A2780 (Fig. 1, S4 de archivos y archivos S5), lo que indica que estos efectos se debieron a la inhibición NAMPT. Es interesante que los niveles de asparagina y glutamato no se alteraron significativamente. También se observó una disminución marginal en los niveles de glutamato y la glutamina en las células HCT-116. Las elevaciones en los niveles de treonina se observaron (File S2) y revierten con el tratamiento con ácido nicotínico en las células HCT-116, que soporta la conexión a aspartato, que es una fuente para la biosíntesis de la treonina.
Curiosamente, los niveles de N-acetilglutamina fueron elevados en ambas líneas celulares cuando se tratan con FK866 y sólo los efectos de HCT-116 fueron rescatados por la adición de ácido nicotínico. Se obtuvieron resultados similares para la lisina, N-acetil-lisina, fenilalanina, triptófano, tirosina, leucina, isoleucina, metionina, SAM, y prolina (File S3, S4 de archivos y archivos S5). SAM se conoce a participar en cisteína y metabolismo de la metionina, arginina y el metabolismo de la prolina, la biosíntesis de aminoácidos, y en transmetilación, transulfuración, y aminopropilación. Se encontró que las alteraciones de los niveles de SAM son sorprendentemente similares a los cambios en los niveles de aspartato (S3 archivo archivo de S4 y S5 Archivos). Finalmente, la inhibición NAMPT también conduce a la alteración del metabolismo de poliamina porque los niveles de espermina y espermidina se elevan de una manera dependiente de la dosis en el tratamiento con FK866. La adición de ácido nicotínico abolió completamente los efectos observados en las células HCT-116, pero no en las células A2780 (S3 archivo archivo de S4 y S5 Archivos). Así, la inhibición NAMPT parece perturbar varias vías de aminoácidos y algunos de los efectos parecen ser línea celular específica.
purina y pirimidina metabolismo
Debido a que los varios pasos de la purina y la biosíntesis de pirimidina requieren NAD y los intermedios que se derivan de metabolismo de los carbohidratos, se evaluó los efectos de la inhibición NAMPT en metabolism.As relacionados de nucleótidos mostradas en la Fig. 2 y en el Archivo S3, Archivo S4 y archivos S5, se observó cambios en los niveles de purinas en respuesta al tratamiento FK866 porque hubo un aumento dependiente de la dosis en los niveles de adenina, citidina, citosina, adenosina, 1-metiladenosina, inosina, adenosina monofosfato (AMP), difosfato de adenosina (ADP), monofosfato de inosina (IMP), difosfato de inosina (IDP), difosfato de citidina (CDP), difosfato desoxiguanosina (DGDP), ribonucleótido 5-aminoimidazol-4-carboxamida (AICAR), AICAR 3 ' , 5'-fosfato cíclico, N-formylglycinamide ribonucleótido, orotidina, purina, timidina y uridina en ambas líneas celulares, similar al aumento en los niveles de aminoácidos. Curiosamente, la adición de ácido nicotínico disminuye significativamente los niveles elevados de inosina en ambas líneas celulares (Fig. 2, de archivos S2, archivos S3, S4 de archivo y Archivos S5). Los niveles de xantina no se modificaron en las células A2780 pero aumentaron de una manera dependiente de la dosis en las células HCT-116, lo que sugiere una diferencia específica línea celular en el metabolismo relacionados con la xantina. Hubo una disminución dependiente de la dosis en 7-metilguanosina, desoxiadenosina, desoxiuridina, monofosfato de guanosina (GMP), monofosfato de citidina (CMP), monofosfato de desoxicitidina (dCMP), monofosfato de desoxiadenosina (húmedos), y el trifosfato de uridina (UTP) niveles. Estos efectos se debieron a la inhibición NAMPT porque la adición de ácido nicotínico abolió estos efectos en las células HCT-116, pero no en las células A2780. Curiosamente, el tratamiento con 5 nM de FK866 aumentó los niveles de dCMP comparables a los de 50 nM de FK866 en células A2780. Una vez más, hubo un efecto específico línea celular observado ya que la inhibición NAMPT causó una disminución en los niveles de AMP cíclico y Ribotide AICAR en las células A2780 pero no en las células HCT-116 (S2 archivo archivo de S3, S4 y archivos Archivos S5).
Grand media se muestra como una línea horizontal que se encuentra dentro del panel. El eje Y muestra normalizada, transformados log, y ampliarse el área del pico. Los puntos representan muestras. Media del grupo muestra como una línea horizontal dentro de la caja.
Creatina Metabolismo
inhibición NAMPT condujo a un aumento dependiente de la dosis en los niveles de creatina y creatinina en ambas líneas celulares similares a los aminoácidos los niveles. En consonancia con esto, la adición de ácido nicotínico abolió estos efectos en las células HCT-116, pero no en las células A2780 (S2 archivo archivo de S3, S4 y archivos Archivos S5).
Metabolismo de Lípidos
biosíntesis de ácidos grasos requiere una gran cantidad de NADP /NADPH derivado de NAD y citrato de (a TCA intermedio); se observó cambios significativos en el metabolismo de lípidos en respuesta al tratamiento FK866. los niveles de ácido palmítico y esteárico se elevan de una manera dependiente de la dosis en ambas líneas celulares. Curiosamente, la adición de ácido nicotínico abolió estos efectos en ambas líneas celulares. El tratamiento con FK866 dio lugar a aumento de los niveles de colina, fosforilcolina y phoshatydylglycerol en las células HCT-116, pero no en las células A2780. Estos efectos observados en las células HCT-116 eran resultado de la inhibición NAMPT porque los efectos se suprimieron con la adición de ácido nicotínico al medio de crecimiento. Curiosamente, se observó un aumento dependiente de la dosis fuerte en los niveles de glicerofosfocolina y glicerol-3-fosfato en células A2780 pero no en células HCT-116. El tratamiento FK866 también dio lugar a una disminución significativa dependiente de la dosis en los niveles Liso-PC y PC detectadas en las células A2780, pero los cambios marginales en las células HCT-116 (S2 archivo archivo de S3, S4 y archivos Archivos S5).
estas observaciones podrían reflejar una diferencia de línea de células específicas en estas vías metabólicas particulares. Por último, la inhibición NAMPT también afectó significativamente el metabolismo de la carnitina en una forma dependiente de la dosis (Fig. 3).
Grand media se muestra como una línea horizontal que se encuentra dentro del panel. El eje Y muestra normalizada, transformados log, y ampliarse el área del pico. Los puntos representan muestras. Media del grupo muestra como una línea horizontal dentro de la caja.
La carnitina es una molécula importante para la regulación del metabolismo energético celular de ácidos grasos y glucosa. Carnitina participa en el transporte de ácidos grasos de cadena larga a través de la membrana interna de las mitocondrias, y se facilita el transporte de los grupos acilo de cadena acortada producidos en los peroxisomas a la mitocondria para la producción adicional de energía. No se observaron alteraciones de células específicas en el metabolismo de la carnitina, lo que indica un impacto diferente de la administración de FK866 sobre la biosíntesis de carnitina y la degradación. Acetilcarnitina se deriva a partir de acetil-CoA, el producto de degradación universal de todos los sustratos metabólicos. No se encontraron cambios acetylcarnitine ser similar a acetil-CoA cambios (S2 archivo archivo de S3, S4 y archivos Archivos S5). Butyrylcarnitine se pueden derivar de ácidos grasos y aminoácidos. Se encontraron sus alteraciones de ser dependiente de la dosis, lo que puede reflejar alteraciones observadas en el metabolismo de los aminoácidos y ácidos grasos.
La glucólisis, la pentosa fosfato Camino, y el ciclo TCA
Se ha demostrado recientemente que la inhibición NAMPT atenúa la actividad gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, que a su vez afecta a la glucólisis, la vía de las pentosas fosfato, y el ciclo TCA y sus vías descendentes en las células del cáncer [1]. Los resultados de este estudio están en estrecha concordancia con los del estudio anterior [1] (S2-S5 filess).
análisis de la agregación
Para entender aún más la conectividad metabólico y para capturar el mundial efectos, se realizó un análisis de agrupamiento jerárquico no supervisado. Higo. 4 ilustra los mapas de calor metabolitos seleccionados. Las intensidades de color de los mapas muestran que la inhibición NAMPT con FK866 es específico de célula y la fig. La figura 4 muestra el tratamiento con ácido nicotínico. Higo.