Extracto
El carcinoma de próstata es el cáncer más común en hombres con pocos y cuantificables, biomarcadores. el descubrimiento de biomarcadores El cáncer de próstata se ha visto obstaculizada debido a análisis subjetivo de la expresión de proteínas en secciones de tejido. Un enfoque imparcial inmunohistoquímica, cuantitativa proporciona aquí, para el diagnóstico y la estratificación del cáncer de próstata podría superar este problema. Se utilizaron anticuerpos contra las proteínas cuatro BTF3, HINT1, NDRG1 y ODC1 en una matriz de tejido de la próstata (& gt; 500 núcleos de tejido individuales a partir de 82 pacientes, 41 pares de los casos igualados con un paciente en cada par tenían recurrencia bioquímica). expresión de la proteína, cuantificada de una manera imparcial utilizando un protocolo de análisis automatizado en el software ImageJ, se incrementó en maligna vs próstata no maligno (por 2-2,5 veces, p & lt; 0,0001). Características de funcionamiento indican la sensibilidad en la gama de 0,68 hasta 0,74; combinación de marcadores en un modelo de regresión logística demuestra una mejora adicional en poder de diagnóstico. inmunofluorescencia triple marcada (BTF3, HINT1 y NDRG1) en la matriz de tejido mostraron una disminución significativa (p & lt; 0,02) cambio en los coeficientes de co-localización para BTF3 y NDRG1 co-expresión en el epitelio recaída bioquímica vs cáncer no recaída. BTF3, HINT1, NDRG1 y ODC1 podrían desarrollarse como biomarcadores específicos epiteliales para el diagnóstico y la estratificación del cáncer de próstata basada tejido.
Visto: Symes AJ, Eilertsen M, M Millar, J Nariculam, Freeman A, Notara M, et al. (2013) Análisis cuantitativo de BTF3, HINT1, NDRG1 y Proteína ODC1 El exceso de expresión en tejido cáncer de próstata humano. PLoS ONE 8 (12): e84295. doi: 10.1371 /journal.pone.0084295
Editor: Domenico Coppola, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 23 Agosto, 2013; Aceptado: 13 Noviembre 2013; Publicado: December 27, 2013
Derechos de Autor © 2013 Symes et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue financiado por el Centro de Investigación de la caridad del cáncer de próstata y Confianza de San Pedro. Los autores agradecen a Mike Millar, Sheila MacPherson y Nancy Evans, de la Universidad de Edimburgo para obtener ayuda con la tinción y Daniel Ciantar, UCL de Huygens uso de software. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
carcinoma de próstata es una enfermedad del epitelio, el cáncer más común en los hombres y la causa de considerable morbilidad y mortalidad [1]. Cada año, más de 30.000 hombres son diagnosticados de cáncer de próstata y más de 10.000 mueren por la enfermedad en el Reino Unido. En 2010, 217.730 nuevos casos de cáncer de próstata fueron diagnosticados en los EE.UU., con 32.050 hombres estadounidenses mueren de la enfermedad [2].
El diagnóstico y pronóstico del cáncer de próstata se basa en la morfología de los tejidos de biopsias (~ 1 millón de procedimientos en EE.UU. y ~ 70.000 en el Reino Unido /año). biopsias por primera vez identificar el cáncer en el 38% de los casos mientras que el diagnóstico equívoco o falsos negativos constituyen ~ 25-30% de los casos [3]. Descriptores de agresividad (por ejemplo, grado de Gleason) determinar el tratamiento del cáncer y la terapia, pero tienen inconvenientes significativos y alta varianza, en particular para los cánceres de bajo grado. La inmunohistoquímica (IHC) se utiliza en la solución de diagnóstico equívoca, sin embargo, la mayoría de los biomarcadores de IHC se han identificado mediante análisis subjetivo (puntuación) introducir gran variabilidad [4]. Para órgano confinado biopsia de próstata enfermedad sigue siendo una herramienta clínica crítica, sin embargo, hay una necesidad de resolver los falsos negativos y refinar el diagnóstico. Mediante la identificación de cánceres que tienen buen pronóstico exceso de tratamiento podría reducirse, pero no hay marcadores de proteínas cuantitativas para mejorar la calidad del diagnóstico. Un enfoque reproducible, cuantitativa podría facilitar enormemente este proceso.
El descubrimiento de marcadores IHC, en gran medida, y su análisis, se lleva a cabo por métodos semicuantitativos (por ejemplo, la puntuación de las secciones de tejidos teñidos con un cromosoma o fluoróforo) con grandes errores entre observadores [4,5]. La puntuación de la intensidad de un cromóforo (o fluoróforo) implica la inspección visual seguido por un marcador dentro de un rango predeterminado por el experimentador. Un enfoque basado en la observación visual de los objetos modelados como tejidos de mamíferos, con una arquitectura distinta, o assesment visual de la intensidad de una señal de luz como se ha hecho para IHC puntuación, implica con severas limitaciones de la percepción de la iluminación y el juicio, por lo general [6] y para la evaluación de carcinoma de próstata, específicamente [7]. Una desventaja adicional de utilizar un enfoque de puntuación subjetiva es que la selección de las proteínas objetivo que deben ser investigadas gravita hacia los extremos (ya sea altamente expresado en el cáncer (por ejemplo EZH) o ausente en el cáncer (por ejemplo, citoqueratinas 5 y 6). Esto significa que una gran número de cambios biológicos significativos que se producen inevitablemente dentro de estos extremos no son recogidos y no se pueden utilizar para la comprensión de los mecanismos de la carcinogénesis o desarrollados como biomarcadores para el diagnóstico, o la estratificación o pronóstico de cáncer. Quantitative IHC [8] puede identificar nuevos biomarcadores de una manera imparcial, reproducible, y en conjunción con sondas fluorescentes podrían ser útiles para este último. es probable que no sólo la expresión pero co-localización de dos o más proteínas también pueden cambiar como resultado de enfermedad o tratamiento [9, 10]. Un requisito previo para el pronóstico de la enfermedad en base a criterios moleculares, en lugar de morfológicos, también requiere la detección robusta y reproducible de la expresión de proteínas en las secciones de IHC que podría ser seguido por la cuantificación de los cambios co-localización en inmunofluorescencia [10].
En un estudio anterior hemos desarrollado un método semi-automatizado, cuantitativa para medir la expresión de Wnt5A en el tejido prostático [8] en una matriz de tejido de la próstata (& gt; 500 núcleos de tejido de 82 pacientes, 41 pares de casos emparejados con un paciente en cada par tenía recurrencia bioquímica). El objetivo de este estudio era emplear el enfoque cuantitativo IHC para evaluar si este método podría utilizarse para identificar marcadores de cáncer putativo para fines de diagnóstico. Elegimos cuatro genes BTF3, NDRG1, HINT1 y ODC1 que están regulados en marcha en el carcinoma de próstata (oncomine.org; criterios de selección: p = 0,0001, 2 veces el cambio y en la parte superior del 10% de los genes sobreexpresados en el conjunto de datos global) en al menos cuatro normales vs análisis de la expresión génica del cáncer de próstata de datos [11-14]. Se utilizó la inmunohistoquímica cuantitativa [8] para demostrar que la expresión de BTF3, HINT1, NDRG1 y proteínas ODC1 se aumenta en el tejido de cáncer de próstata y podría servir como dianas putativas para la investigación de la carcinogénesis o biomarcadores para la enfermedad. a continuación, se empleó un método de inmunofluorescencia cuantitativa para estratificar el cáncer de próstata utilizando coeficientes de co-localización de BTF3, HINT1 y NDRG1.
Resultados
análisis inmunohistoquímico cuantitativo de proteínas sobre-expresado en el tejido de cáncer de próstata
Expresión de BTF3, HINT1, NDRG1 y ODC1 era en gran parte epitelial y el aumento en maligno en comparación con los núcleos de la próstata benignas o no malignos (Figura 1). Se cuantificó el DAB-etiqueta de escala de grises (Figura 1 y Figura S1), de una manera imparcial, mediante el uso de un análisis de partículas reproducibles, semi-automatizado (Analizar Partículas) de protocolo [8] el uso de imágenes en escala de grises del tejido teñido de más de 450-500 núcleos individuales de tejido de próstata para cada biomarcador (Figura 2). Los cálculos de área total y la fracción de área se dan en la Tabla 1. Integración de AUC reveló un aumento en la expresión de BTF3, HINT1, NDRG1 y ODC1 en núcleos malignos, diagnosticada por histopatología, en comparación con los núcleos no malignas (p & lt; 0,0001, Mann Whitney U test). Estos resultados identifican BTF3, HINT1, NDRG1 y ODC1 como proteínas que son sobre-expresado en el cáncer de próstata.
(de más de 500 núcleos de tejido teñidas para cada anticuerpo) de matrices de próstata humanos. Estos son representantes de más de 450 a 500 imágenes núcleo de tejido analizadas para cada anticuerpo de biomarcadores usando el protocolo de análisis de imagen automatizado (véase Materiales y Métodos - análisis de imágenes de partículas). Cada núcleo fue fotografiada usando un microscopio vertical Leica (10x) y se guarda como un archivo jpg. Cada imagen se utilizó para calcular la expresión de proteínas (etiqueta DAB, marrón, en gran medida en las células acinares). las imágenes de color RGB (A-H) fueron convertidos a las correspondientes imágenes en escala de grises (I-p) para la cuantificación de la señal de DAB usando Analizar protocolo de partículas en el software ImageJ para obtener Área Total manchada, en pixel. Expresión de proteínas para BTF3, HINT1, NDRG1 y ODC1 se incrementó en núcleos benignos v malignas (p & lt; 0,0001).
Un protocolo imparcial, automatizado se utiliza para calcular el área total manchado (en píxeles) estandarizado al cantidad de tejido en cada núcleo (ver Métodos). TA se convierte en la zona Fracción (área total dividido por el total de píxeles de la imagen). Cada bin es de datos para un individuo, maligno (rojo) o núcleo de tejido no maligno (verde). Hay un aumento significativo en el AUC de expresión de proteínas en v maligno de tejido de próstata no maligno (p & lt; 0,0001).
Proteína
Condición (
n
)
Área Total
fracción de área
*
Fold aumento
BTF3Benign ( 236) 22301 ± 16.971,66 ± 0.12Malignant (228) 54750 ± 35.884,09 ± 0,27
2.5HINT1Benign (214) 28564 ± 18.822,13 ± 0.14Malignant (225) 67173 ± 39.774,93 ± 0.292.3NDRG1Benign (230) 27752 ± 18.752,07 ± 0.14Malignant ( 223) 72297 ± 43805,4 ± 0.332.6ODC1Benign (261) 38621 ± 41.842,80 ± 0.31Malignant (243) 65428 ± 53.894,88 ± 0.41.8Table 1. La cuantificación de la expresión de proteínas en los tejidos de la próstata humana arryas malignas y no malignas utilizando el software ImageJ.
etiqueta de DAB, que representa la expresión de proteínas de BTF3, HINT1, NDRG1 y ODC1 fue cuantificada de una manera imparcial, mediante el uso de un análisis reproducibles, semi-automatizado de partículas (partículas Analizar) protocolo con el software ImageJ. Más de 500 núcleos de tejido de la próstata individuales (véase métodos) imágenes RGB se convirtieron en escala de grises de 16 bits. Los resultados son medias ± SE para los parámetros calculados de superficie total y fracción de área. Estos datos están normalizados para la cantidad de tejido en cada núcleo mediante el protocolo inversa en ImageJ (ver métodos). Las veces de aumento en la expresión de proteínas en maligno en comparación con los núcleos no malignas (benignos) se confirmó mediante cálculos de AUC de los datos de la Figura 2. (n) = número de núcleos utilizables incluidos en el análisis.
*
Análisis estadístico: la expresión, para todas las proteínas, es significativamente diferente en comparación con maligna de la próstata no maligno en P & lt; 0,0001 mediante la prueba U de Mann Whitney. Descargar CSV CSV
Para investigar la utilidad de las proteínas como biomarcadores putativos para el diagnóstico del cáncer de próstata, se calculó la tasa de verdaderos positivos (sensibilidad) y la tasa de falsos positivos (1-especificidad) por la curva ROC (Figura 3). Los datos fracción de área se transformó en probit y se ajustaron a una función de Gauss. los valores de AUC de 1,0 para una curva de ROC representan una alta selectividad y sensibilidad, mientras que 0.5 sugiere que el marcador de prueba no puede distinguir entre las categorías no malignas y malignas. Los gráficos de puntos de los datos transformados se dan en la figura S2. La sensibilidad y la especificidad-1 se calcularon para los valores de fracción de área para NDRG1, BTF3, HINT1 y ODC1 (Tabla S1). umbral fijo (criterios & gt;) los valores de los biomarcadores putativos para diagnóstico oscilan entre 0,68 y 0,74 (Tabla S1), lo que indica una alta sensibilidad para NDRG1, BTF3 y HINT1, como marcadores de diagnóstico para identificar el cáncer de próstata en los núcleos de tejido por imparcial inmunohistoquímica, cuantitativa. cocientes de probabilidad positivo (LR +) para cada biomarcador en los criterios designados (Tabla S1) valores de entre 1,7 a 2,4. Un cociente de probabilidad de mayor que 1 indica que el resultado se asocia con la presencia de la enfermedad [15]. NDRG1, BTF3 y HINT1 también mostraron LR + de & gt; 10 en diversos criterios de los puntos de corte; LR + s por encima de 10, para una prueba de diagnóstico, se considera proporcionan una fuerte evidencia para descartar la enfermedad [15,16]. El poder de diagnóstico se mejoró aún más mediante la incorporación de los datos de dos biomarcadores en un modelo de regresión logística (Tabla 2). grados de Gleason 4 + 3 y 3 + 4 formados por & gt; 80% de las muestras de tejido malignos dispuestos en la matriz de tejido (entre 221-241 núcleos de tejido, ver la Tabla S2). No hubo diferencia significativa en la expresión de los cuatro biomarcadores cuando segregadas para el análisis basado en el grado de Gleason. (4 + 3 y 3 + 4; Figura S3)
curva ROC demuestra el rendimiento de discriminación de la expresión de la proteína en el diferenciación entre los núcleos de tejido malignas y no malignas utilizando la fracción de área (probit) de datos para BTF3, HINT1, NDRG1 y ODC1. Los valores característicos de funcionamiento se dan en la Tabla S1. La línea continua representa el área ROC de 0,5. combinación
Proteína
% de los casos identficados correctamente *
BTF 3 y HINT172BTF3 y NDRG178BTF3 y ODC193HINT1 y NDRG181HINT1 y ODC185NDRG1 y ODC197Table 2. Modelo de regresión logística para identificar combinación de marcadores que pueden mejorar la capacidad diagnóstica.
Un modelo de regresión logística se empleó el uso de software MedCalc para analizar la relación entre una variable dependiente dicotómica (v no maligno maligno) y una o más variables independientes (dos biomarcadores). El resultado (porcentaje de casos correctamente identificados) sugiere que dentro de la cohorte de muestras utilizadas en este estudio, el poder de diagnóstico para identificar casos malignos aumenta con la combinación de BTF3 y ODC1 y NDRG1 y ODC1. * El nivel de significación del ajuste del modelo general para el análisis de todas las combinaciones es p & lt; 0,0001. Descargar CSV CSV
estadificación de la enfermedad utilizando múltiples marcadores y la tinción de inmunofluorescencia
Se estima que alrededor del 30% de los pacientes sometidos a prostatectomía radical para la enfermedad clínicamente localizada experimentará una recaída bioquímica (definida como PSA detectable ≥ 0,2 ng ml
-1 a 2 años de la cirugía). Una cohorte de pacientes utilizados para la matriz de tejido en este estudio, había sufrido recaída bioquímica [17]. La hipótesis de que no sólo un cambio en la expresión, sino también co-localización de los biomarcadores identificados cambios en el epitelio de cáncer de próstata. Esto se investigó mediante tinción de múltiples marcado de inmunofluorescencia usando BTF3, HINT1 y anticuerpos NDRG1 (Figura 4). Las 3 proteínas se expresaron diferencialmente en no maligno (Figura 4A) en comparación con (Figura 4B) núcleos maligno y se encontró que en gran medida en el epitelio de próstata, lo que confirma los datos de anticuerpos individuales tinción utilizando 3,3-diaminobencidina-peroxidasa de rábano picante ( DAB-HRP, Figura S1 y la Figura 1). Estos resultados indican no sólo que la expresión de estos biomarcadores de proteínas, de forma individual, está aumentada en cáncer de próstata (Figura 2), pero que la expresión es en gran parte epitelial y por lo tanto específica para el proceso de la enfermedad (Figura 4).
Co-expresión de tres proteínas BTF3 (FITC-verde), HINT1 (Cy3 azul) y NDRG1 (Cy5-rojo) en no maligno (A) y núcleos de tejido de próstata malignos (B); las imágenes son núcleos de tejido representativas de la matriz de tejido con más de 200 muestras. Los tres anticuerpos se incubaron simultáneamente y se marcaron con tres diferentes fluoróforos Cy5 -red utilizando Bond sistema automatizado de tinción. núcleos de tejido enteros fueron imágenes utilizando un sistema confocal Leica y alicatados 4x4 en exactamente la misma configuración para la comparación. Las imágenes fueron zoom 3x con el zoom digital en ImageJ. Barra de escala = 100μm
La co-localización de BTF3, HINT1 y NDRG1 se investigó en los tejidos de inmunofluorescencia multi-etiquetado a partir del próximo recaída y los pacientes no recaída de imágenes fluorescentes compuestos (Figura. 5; BTF3, HINT1 y NDRG1, verde, azul y rojo, respectivamente) con el fin de determinar la utilidad de este enfoque para la estratificación del cáncer de próstata. Hay un cambio evidente y cuantificable en el patrón de tinción de estos biomarcadores de proteínas en núcleos de tejido recaída bioquímica: la expresión BTF3 aparece menos en recaída, en comparación con muestras no recaída, mientras que HINT1 y expresión NDRG1 aparece dominante en muestras de tejido con recaída (tejido representativo núcleos de pacientes con recaída bioquímica y de control se muestran en la Figura 5A y B); análisis de colocalización cuantitativa de alta ampliación deconvoluted imágenes (Figura 5C y D) mostraron que la mayor parte del cambio aparente en el patrón de expresión, por secciones multi-marcado de tejido en no recaída vs muestras recaída, fue debido al cambio en la co-expresión de BTF3 (isotiocianato de fluoresceína, FITC, verde) y HINT1 (cianina 3, Cy3, azul). Los coeficientes de Pearson calculados para la colocalización de no recaída frente a la recaída fueron de 0,73 ± 0,02 vs 0,60 ± 0,07 (media ± SD, n = 4, significación de la diferencia p & lt; 0,02). Cuantitativa co-localización indica que el enfoque multi-etiquetado podría ser utilizado para la estratificación de cáncer de próstata en núcleos de tejido
.
Co-expresión de tres proteínas BTF3 (FITC-verde), HINT1 (Cy3 azul) y NDRG1 (Cy5 -red) en las muestras de tejido de la próstata malignos (a a D). micrografías compuestas de núcleos de tejido de próstata immunofluorescently manchadas de pacientes con recaída bioquímica (definida como PSA ≥ 0,2 ng /ml dentro de los 2 años de la prostatectomía radical). se muestran núcleos de tejido de pacientes (4 pares emparejados para la puntuación de Gleason y PSA), no recidivante (A) y la recaída bioquímica (B) imágenes representativos utilizados para el análisis de co-localización cuantitativa (véase métodos). Imaging se realizó utilizando un microscopio confocal Leica; A y B son bajos aumentos; C y D mayor aumento; E es un ejemplo de la expresión de los tres marcadores en el tejido no maligno también a mayor aumento. La expresión de BTF3 (verde), por ejemplo, es evidente en muestras no recaída mientras que no muy evidente en las muestras extraídas en pacientes con recaída. Imágenes se realizó con un microscopio confocal Olympus (40x azulejos (A y B) o 40x y un zoom digital 3,5-4 (C, D y E). Las imágenes de alta magnificación (C, D y E) fueron deconvolved utilizando el software Huygens profesión. 16bit tif para cada fluoróforo (FITC, Cy3 y Cy5) se importaron en ImageJ y seudo color (FITC, verde, Cy3, azul y Cy5, rojo). Z-proyecciones para un máximo de 27 imágenes se muestran para cada núcleo de tejido. La barra de escala = 100μm para a y B y 20μm para el análisis de colocalización C y D. cuantitativa de imágenes (por ejemplo, la figura 5C y D) mostraron que la mayoría cambio significativo en el patrón de expresión, en no recaída vs muestras recaída, fue debido al cambio en co-expresión de BTF3 (FITC, verde) y HINT1 (Cy3, azul) con coeficientes de Pearson para colocalización de no recaída vs recaída = 0,73 ± 0,02 vs 0,60 ± 0,07 (media ± SD, n = 4, la significación de la diferencia p & lt; 0,02).
Discusión
mediante el uso de un análisis global de la expresión génica, se han realizado enormes progresos en la identificación de genes desregulados en el cáncer de próstata en la última década. Lo que ha faltado es la traducción de estos genes en los biomarcadores clínicamente útiles para el diagnóstico y la estratificación de la enfermedad. próstata humana fue uno de los primeros tejidos para ser investigado por los cambios globales en la expresión de genes en la enfermedad hace casi una década. Por cierto, la aprobación de nuevos marcadores por la Administración de Drogas y Alimentos, EE.UU., en particular los marcadores de proteínas, se ha reducido en la última década. Esta disminución se puede atribuir a tres problemas principales en la identificación y desarrollo de biomarcadores de proteínas a base de tejido para el diagnóstico y pronóstico del cáncer de próstata: 1. La falta de especificidad, es decir, no específica epitelio (el sitio de inicio de la enfermedad) 2. Falta de un análisis imparcial y automatizado, cuantitativa de la expresión de proteínas que podrían identificar, datos reprdoucible robustas de biomarcadores putativos 3. la falta de enfoques cuantitativos proteómicos, a una base molecular para el pronóstico del cáncer de próstata.
marcadores inmunohistoquímicos podrían ser extremadamente útiles en el diagnóstico primario o de confirmación en apoyo de la histopatología, pero debido a las dificultades en la identificación o validación [18] sólo un puñado de tales marcadores existen. También parece probable que el análisis histopatológico seguirá siendo un bastión para el diagnóstico del cáncer de próstata en el futuro a corto o medio. Por lo tanto, además de continuar la búsqueda de la identificación de biomarcadores no invasivos que podrían detectarse en los fluidos corporales, es importante mantener el refinado y la mejora de los biomarcadores de tejido inmunoquímicos que podrían facilitar el diagnóstico, mejorar el pronóstico y proporcionar estratificación predictivo útil de cáncer de próstata. Debido al aumento de la potencia de cálculo de la última década dos tecnologías han madurado que podrían ayudar a lograr estos objetivos. Estos se discuten a continuación.
El análisis morfológico se utiliza rutinariamente para diagnosticar el cáncer de próstata, aunque IHC se utiliza para ayudar a un diagnóstico morfológico, en particular en los casos dudosos, por ejemplo, en muestras de tejido de biopsias con aguja, muestras de resección transuretral y muestras de tumores metastásicos [19]. Una cuestión que complica obstaculizar descubrimiento de nuevos biomarcadores para el diagnóstico y la enfermedad de estratificación de próstata (y otros) cáncer (s) a partir de muestras de biopsia, ha sido una escasez de métodos imparciales, cuantitativos para detectar cambios significativos de los experimentos de IHC para la identificación de biomarcadores. Hay, sin embargo, algunas excepciones a este enfoque. Rubin y colegas [20] idearon un enfoque cuantitativo para identificar α-CoA racemasa metilacil-(AMACR). Los estudios iniciales mostraron expresión casi uniforme de esta proteína en tejido canceroso, sino en su posterior análisis se encontró que la expresión a ser menos y, con reserva, esta proteína se usa como un marcador de diagnóstico.
Para abordar la cuestión de sesgo y dependencia de la evaluación subjetiva de la expresión de un biomarcador dado, hemos desarrollado un método, libre de sesgo del experimentador, para cuantificar la expresión de proteínas en el cáncer de próstata [8] usando un software de libre acceso [21]. A diferencia de los métodos convencionales, de puntuación (por ejemplo de la tinción DAB) para estimar la expresión en arrays de tejido, nuestro enfoque permite la cuantificación objetiva de la señal total DAB. Aunque la cuantificación total de la señal DAB puede no ser ideal, mediante la estandarización de la medición de la señal y la eliminación de puntuación arbitraria identificamos BTF3, NDRG1, HINT1 y los niveles de proteína ODC1 que se sobre-expresado en el carcinoma de próstata, cuantificable y reproducible, lo que confirma el gen de la sobreexpresión observada desde nuestra lista de genes preliminar. Las características de operación (Figura 3 y Tabla S1) para BTF3, HINT1 y NDRG1 muestran AUC de 0.71 a la 0,76; una AUC de & gt; 0,7 se considera aceptable para un marcador de diagnóstico [22] lo que indica que, de forma individual, estos son biomarcadores adecuados de enfermedad. El poder de diagnóstico puede mejorarse aún más cuando estos marcadores se analizan para poder diagnóstico agregada (Tabla 2). Por otra parte, BTF3, NDRG1 y HINT1, en los estudios de co-localización cuantitativos (Figura 5) parecen capaces de discriminar entre la recaída bioquímica y el cáncer de próstata no recaída. Los biomarcadores identificados aquí son nuevos para su uso en el diagnóstico y también en las combinaciones descritas de recaída bioquímica del cáncer de próstata. Se discuten los posibles mecanismos por los que estos biomarcadores putativos de carcinoma de próstata pueden contribuir a la carcinogénesis continuación
.
BTF3 es una proteína de 27kDa que se forma un complejo estable con ARN polimerasa II B y se requiere para la iniciación de la transcripción [23] y se sabe que se sobre-expresado en células de carcinoma ductal pancreático tanto
in vitro
y
in situ
[24]. NDRG1 (anteriormente conocido como
Cap43
), un gen de respuesta al estrés, se ha implicado en diversos procesos celulares en la salud y la enfermedad. A diferencia de la expresión de otros marcadores biológicos presentados aquí, la expresión de NDRG1 se ha investigado en el tejido de próstata, pero es un tema de controversia con los informes que se incrementa [25] y la disminución de [26] en el cáncer de próstata. Es importante tener en cuenta sin embargo, que ninguno de estos estudios emplea una técnica cuantitativa imparcial y por lo tanto el análisis de la expresión puede ser la razón de estas discrepancias.
Hemos demostrado previamente que la vía de señalización Wnt juega un importante papel el cáncer de próstata [8,27]. NDRG1 También se ha demostrado que influyen en la señalización de Wnt y hay un
prima facie
caso de la participación de NDRG1 en la regulación de la señalización de Wnt en líneas celulares de cáncer de próstata [28]. NDRG1 gen es también una pareja de fusión ETS-familia en el cáncer de próstata que expresan ERG pero a diferencia de TMPRSS2-ERG y SCL45A3-ERG fusiones, frecuente en los cánceres de próstata, se cree que la fusión NDRG1-ERG para codificar para una proteína quimérica [29]. No existe ninguna información con respecto a la expresión de proteínas NDRG1 en cáncer de próstata; si encuentra que estar condensado a ERG o no, NDRG1 podría ser un biomarcador de proteína útil para el cáncer de próstata.
HINT1 pertenece a la tríada de histidina (HIT), la familia y una proteína quinasa C interacción de proteínas [30]. No existe información sobre la expresión o función HINT1 en cáncer de próstata, aunque puede actuar como supresor de tumores en ratones [31]. En una línea celular de hepatoma, HINT1 inhibe la actividad de Wnt /ß-catenina de señalización y la transcripción de genes a través TCF4 [32]. Hemos demostrado, previamente, que hay una supresión de la ß-catenina /transcripción de genes mediada TCF4 de objetivos de transcripción TCF4 [8]. Es tentador especular que HINT1 puede contribuir a la inhibición de la señalización /ß-catenina en cáncer de próstata [8].
descarboxilasa ornitina-L 1 (ODC1) es una enzima en la vía de la síntesis de poliaminas [33] un factor clave en la proliferación celular normal y el crecimiento neoplásico. ODC1 se ha identificado como un marcador genético para el cáncer de colon [34] y la sobre expresión de ODC1 se ha relacionado con neuroblastomas de alto riesgo [35] y colorrectal y de mama [36]. Estos datos se correlacionan con
in vivo
experimentos con ODC1 ratones knock-out que se desarrollaron menos tumores en respuesta a diversos promotores cancerígenos en línea con la reducción del número de copias de genes [37].
Nuestros datos sugieren que el uso de un enfoque imparcial, cuantitativa para identificar biomarcadores específicos del epitelio en combinación con inmunofluorescencia podría ser útil en el diagnóstico, la estratificación y el pronóstico del carcinoma de próstata.
Materiales y Métodos
array de tejidos de próstata
La selección del paciente, detalles del estado de la enfermedad y de la construcción de bloques de tejido se dan en otras partes [8,17]. En pocas palabras, los bloques de tejido fueron construidos utilizando, piezas de prostatectomía radical incluidas en parafina fijadas con formalina de archivo de los 82 pacientes con pT3a estadio patológico o de la etapa b PSA y pre-operatorio de & gt; 3. 41 pares de casos fueron agrupados por las siguientes categorías: estadio patológico, grado de Gleason y el antígeno de concentración preoperatoria prostático específico (PSA). Un paciente de cada pareja tuvo una recidiva bioquímica (definida como PSA ≥ 0,2 ng ml-1 dentro de los 2 años de la cirugía) y el otro permaneció bioquímicamente libres de la enfermedad (definida como PSA indetectable por lo menos 3 años después de la cirugía). Se diagnosticaron los núcleos (como benignos o no malignas y malignas) y secciones marcadas por un patólogo y 5-6μm fueron cortadas de los arrays de tejido en portaobjetos recubiertos. Para eliminar el sesgo, los experimentadores estaban ciegos a las manchas, tratamiento de imágenes y análisis, siendo este último el automatizado (véase más adelante). Los detalles clínicos de las muestras de tejido utilizadas se dan en la Tabla S2 y [17]; patólogos obtuvo una mayoría de muestras (& gt; 80%) como Gleason 4 + 3 y 3 + 4. Un cálculo del tamaño de la muestra fue hecho para diferenciar entre la sobreexpresión utilizando DAB-IHC; el tamaño de la muestra para la expresión de la proteína se calculó antes de la construcción de la matriz de tejido (con una α y ß de 0,05 y la diferencia esperada de 2,5 pliegues entre las medias de las muestras malignas y no malignas ser 41 pacientes por grupo).
ética aprobación
la aprobación ética fue dado por los comités mixtos de UCL /UCLH sobre la ética de la investigación en humanos. La junta de revisión (RB) aprobó el uso de tejidos humanos para la investigación del cáncer de próstata, de acuerdo con el Comité Internacional de Armonización de las Buenas Prácticas Clínicas (BPC de la ICH). Para la construcción de matriz de tejido fueron anónimos las muestras durante la construcción de las matrices de tejido [17] y se utilizaron para diversos estudios inmunohistoquímicos en un proyecto aprobado por el comité de ética UCL /UCLH. La RB renunció a la necesidad de consentimiento informado debido a que las muestras utilizadas para la matriz de tejido fueron muestras patológicas de archivo.
3,3-diaminobencidina-peroxidasa de rábano picante (HRP-DAB) tinción
Todo era tinción realizado utilizando el sistema automatizado Bond [8] de acuerdo con los protocolos del fabricante. Los detalles del procedimiento de tinción para IHC usando DAB y anticuerpos (BTF3, HINT1, NDRG1 y ODC1) utilizados se dan en Métodos S1.
La tinción de inmunofluorescencia usando anticuerpos 3 en arrays de tejido de próstata
El protocolo para la tinción de inmunofluorescencia fue similar a la descrita para la tinción DAB, anterior, excepto que BTF3, los anticuerpos HINT1 y NDRG1 incubaron simultáneamente y se tiñeron con FITC, Cy5 y Cy3, respectivamente, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las imágenes fueron adquiridas utilizando un microscopio confocal Leica 710 con un objetivo Plan-CE Neofluar (40x).
análisis de partículas de imágenes con el software ImageJ
Un método imparcial y reproducible de partículas automatizado de análisis [8] fue empleado para cuantificar la señal DAB en no maligno (benigno) y núcleos de tejido de próstata humana malignas utilizando el software ImageJ [21]. Las macros se escribieron para ejecutar la siguiente secuencia de eventos para las imágenes JPEG adquiridos: 1. Abrir imagen 2. Convertir a 16 bits imagen umbral 3. Conjunto 4. Analizar las partículas 5. Guardar la imagen (Tamaño 0.5- Infinity, circularidad 0,00-1,00) 6. Guardar la información de partícula (contar, área total, y el tamaño medio de la fracción de área) en una hoja de cálculo Excel (rsb.info.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf). Las unidades son de ajuste por defecto ImageJ (píxeles). Normalización de la cantidad de tejido por núcleo también se cuantificó mediante el uso de la función inversa (imagen EditInvert) en ImageJ con el protocolo descrito anteriormente. la señal cuantificada DAB se expresa como señal /cantidad de tejido en cada núcleo de tejido. Un diagrama de flujo para la cuantificación de la señal DAB se da en la Figura S1. Para todos los anticuerpos ensayados, se observó la expresión de ser en gran parte epitelial y análisis también se limita a la expresión epitelial; conjunto de parámetros de umbral se eligieron después de análisis manual de los núcleos de azar para la cuantificación posterior de la señal. Una hoja de cálculo contiguo para todos los núcleos utilizables (entre 211 y 260 núcleos) para no malignos vs comparación maligno, para diferentes anticuerpos se construyó.