Extracto
cánceres espontáneos son enfermedades comunes en los perros. Entre estos, algunos tipos de cáncer malignas como el melanoma oral, osteosarcoma, hemangiosarcoma, y el tumor de células cebadas a menudo se reconocen como problemas clínicos, ya que, a pesar de sus altas frecuencias, los tratamientos actuales para estos tipos de cáncer no siempre pueden lograr resultados satisfactorios. La ausencia de terapias sistémicas eficaces contra estos tipos de cáncer lleva a los investigadores para investigar nuevas modalidades terapéuticas, incluyendo la inmunoterapia. Muerte programada de 1 (PD-1) es un receptor coestimuladora con la función inmunosupresora. Cuando se une a sus ligandos, PD-ligando 1 (PD-L1) o PD-L2, PD-1 en las células T negativamente regula la activación de señales del receptor de células T, lo que resulta en la inhibición de la función efectora de los linfocitos T citotóxicos. Aberrante expresión de PD-L1 ha sido reportado en muchos cánceres humanos y se considera un mecanismo de escape inmunológico para cánceres. En los ensayos clínicos, los anticuerpos anti-PD-L1 anti-PD-1 o la regresión del tumor inducida por varios tumores malignos, incluyendo melanoma avanzado, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, y carcinoma de células renales. En este estudio, para evaluar el potencial de los 1 PD-/PD-L1 eje como un objetivo terapéutico para la inmunoterapia del cáncer canino, se realizó el análisis inmunohistoquímico de la expresión de PD-L1 en diversos cánceres malignos de perros. Aquí, se muestra que el melanoma perro oral, osteosarcoma, hemangiosarcoma, tumor de mastocitos, adenocarcinoma mamario, y el adenocarcinoma de próstata expresaron PD-L1, mientras que algunos otros tipos de cáncer no lo hicieron. Además, PD-1 fue altamente expresado en los linfocitos infiltrantes de tumor obtenidas de melanoma oral, mostrando que los linfocitos en este tipo de cáncer podrían haber sido funcionalmente agotado. Estos resultados animan fuertemente la aplicación clínica de 1 PD-inhibidores /PD-L1 como agentes terapéuticos contra estos tipos de cáncer en perros
Visto:. Maekawa N, S Konnai, Okagawa T, Nishimori A, R Ikebuchi, Izumi Y, et al. (2016) Análisis inmunohistoquímico de PD-L1 expresión en tumores malignos caninos y PD-1 de expresión en los linfocitos en el melanoma canino oral. PLoS ONE 11 (6): e0157176. doi: 10.1371 /journal.pone.0157176
Editor: Hiroshi Shiku, Mie University Graduate School of Medicine, JAPÓN
Recibido: December 24, 2015; Aceptado: 25-may de 2016; Publicado: June 8, 2016
Derechos de Autor © 2016 Maekawa et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una subvención-en-ayudas a la subvención Número de Investigaciones Científicas (número de concesión 16K15042) y Grant-en-ayudas a JSP Fellows ( 15J01989) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSP). Esta investigación es (parcialmente) con el apoyo de la Plataforma de Drug Discovery, Informática, Ciencias de la Vida y Estructural (Propuesta Nº 2157) de la Agencia Japonesa para la Investigación y Desarrollo Médico (AMED). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los perros a menudo desarrollan cánceres espontáneos, que pueden causar la muerte [1] o reducir la calidad de vida de los pacientes. Entre los cánceres malignos, linfomas, tumores de mastocitos (MCT), osteosarcoma (OS), sarcoma de tejidos blandos, y el carcinoma de mama son relativamente frecuentes [2,3] y, a menudo reconocidas como enfermedades mortales en el ámbito clínico. melanoma oral y hemangiosarcoma (HSA) también son cánceres comunes en los perros, los perros y los pacientes con este tipo de cáncer por lo general tienen un mal pronóstico [4,5]. Se han establecido las normas de atención para cada tipo de cáncer y el pronóstico mejorado con éxito; Sin embargo, los resultados de los tratamientos no siempre son satisfactorios debido a las tasas de respuesta de bajos a moderados o prolongación de los tiempos de supervivencia limitada.
Las inmunoterapias tienen potencial como nuevas opciones de tratamiento para el cáncer. Entre ellos, inhibidores de punto de control inmunes tales como anti muerte programada de 1 (PD-1) y 1 (PD-L1) anticuerpos anti-PD-ligando mostraron efectos prometedores en varios tumores malignos en los seres humanos [6,7]. La molécula inmune puesto de control PD-1 es un receptor CD28-familia, que suprime la respuesta inmune. PD-1 en las células T regula negativamente la señalización del receptor de células T e inhibe la inducción de citoquinas tales como interferón gamma (IFN-γ), la interleucina 2, y factor de necrosis tumoral alfa, así como la proliferación celular, lo que permite el mantenimiento de la tolerancia periférica o la persistencia de ciertos patógenos en el huésped [8]. Se han reportado dos ligandos para PD-1: PD-ligando 1 (PD-L1) y PD-L2. expresión de PD-L2 está restringida a ciertos tipos de células o tejidos, tales como macrófagos y células dendríticas, mientras que la expresión de PD-L1 puede ser inducida en una amplia variedad de tipos de células, incluyendo las células no hematopoyéticas. expresión de PD-L1 no se encuentra en la mayoría de los tejidos normales; sin embargo, su expresión se informó en diversas células tumorales [9,10] y por lo tanto se considera como uno de los mecanismos de evasión inmune para el cáncer. En el carcinoma de células renales, cáncer gástrico, y otros pacientes de cáncer, la expresión de PD-L1 se sabe que está asociada con mal pronóstico [10-12], lo que indica que PD-L1 podría ser un regulador importante del sistema inmunitario cuando lucha contra el cáncer . fármacos de anticuerpos que se dirigen a esta vía interfieren con la unión de PD-L1 a PD-1 y pueden mejorar las respuestas inmunitarias específicas a las células tumorales [13,14], posteriormente dando como resultado la regresión del cáncer [15]. Un número de ensayos clínicos han puesto de manifiesto que las respuestas objetivas se pueden obtener con anticuerpos anti-PD-L1 en pacientes con tumores malignos, incluyendo melanoma avanzado, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, y carcinoma de células renales [6 anti-PD-1 o, 7], y la evidencia acumulada demuestra el potencial de los inhibidores de punto de control inmune en el tratamiento del cáncer
.
Sin embargo, sólo hay unos pocos informes sobre la PD-1 /PD-L1 eje en los perros, y su asociación con las enfermedades que queda por no se ha dilucidado. Anteriormente, hemos informado de que PD-L1 se expresa en melanoma perro, MCT, y carcinoma de células renales y que PD-L1 bloqueo por un anticuerpo anti-PD-L1 aumenta la producción de IFN-γ por las células infiltrantes de tumor [16]. Estos resultados sugieren que los anticuerpos anti-PD-L1 pueden tener efectos terapéuticos sobre el cáncer en perros. En este estudio, para evaluar qué tipos de cáncer podrían dirigirse, expresión de PD-L1 en los cánceres malignos perro se procedió a investigar. Aquí, se muestra que el perro melanoma oral, OS, HSA, MCT, adenocarcinoma mamario, y el adenocarcinoma de próstata expresan PD-L1, lo que sugiere que el eje de PD-1 /PD-L1 podría ser utilizado como un mecanismo de evasión inmune en estos tipos de cáncer. En apoyo de esta hipótesis, PD-1 de expresión se reguló en los linfocitos infiltrantes de tumores obtenidos de melanoma oral y tumores hepáticos. Al menos, el potencial terapéutico de la EP-1 /PD-L1 bloqueantes en el melanoma y otros cánceres orales PD-L1-positivos merecen una mayor investigación.
Materiales y Métodos
muestras caninas
el uso de animales en todo este estudio fue aprobado por el Comité de Cuidado y uso de Animales institucional (el número de serie de la aprobación fue#15-0149), la Universidad de Hokkaido. Ningún animal fue sacrificado con el propósito de este estudio. Las muestras clínicas de tejidos tumorales extirpados quirúrgicamente para perros fueron en el Hospital Clínico Veterinario, Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Hokkaido y en hospitales veterinarios en la ciudad de Sapporo, en 2014-2015. En la utilización de este estudio, se obtuvo el consentimiento de todos los propietarios de los perros. Muestras de sangre periférica de perros clínicamente sanos fueron recogidos de los beagles a la edad de 12-15 años guardado en el Centro Experimental Animal, Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Hokkaido.
La citometría de flujo
Para evaluar la especificidad de unión de un anticuerpo recientemente establecido anti-PD-L1 monoclonal (mAb) [17], el flujo de los análisis de citometría se realizaron como se describe anteriormente [16], con algunas modificaciones. En breves líneas, canino celulares de melanoma, CMEC y CMM-1, que son PD-L1-negativas en condiciones normales [16], se transfectaron con el vector pEGFP-N2 o el vector pEGFP-N2-CPD-L1 [16] utilizando Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Un día después de la transfección, se recogieron y se tiñeron con anti-PD-L1 mAb 6G7-E1 o un anticuerpo de control de isotipo (IgM de rata) (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.) a una concentración final de 10 las células g /ml. Después del lavado, las células se incubaron con un anticuerpo anti-Ig de rata anticuerpo conjugado con aloficocianina (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE.UU.). La fluorescencia se analizó mediante un FACSVerse citómetro de flujo (BD Biosciences) y el software de FCS Express 4 (De Novo Software, Glendale, CA, EE.UU.). Para las células transfectadas, proteína verde fluorescente (EGFP) células positivas mejoradas fueron cerrada y utilizaron para el análisis.
Para evaluar si PD-1 de expresión está regulada positivamente en el contexto de los cánceres caninos, el análisis de citometría de flujo se realizó con la cruz Reactivo anti-humano PD-1 de anticuerpos [18]. Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) y TIL a partir de tejidos tumorales de perros recién extirpadas como se describe anteriormente [16]. Todas las suspensiones de células individuales se prepararon por el método mecánico. Las células se tiñeron con las concentraciones óptimas de FITC-conjugado anti-CD4 /cóctel de anticuerpos anti-CD8 conjugado con PE (ABD Serotec, Oxford, Reino Unido) y PD-1 y el anticuerpo anti-humano biotinilado (amp I +; D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.) durante 30 min a temperatura ambiente (RT). Después del lavado, las células se incubaron con estreptavidina-APC eFluor 780 (eBioscience, San Diego, CA, EE.UU.) durante 30 min a TA. La fluorescencia de las células se analizaron por FACS verso y FACS expreso 4 de software. IgG normal de cabra biotinilado (R & amp; D Systems) se utilizó como un anticuerpo de control de isotipo coincidente. Para el análisis, los linfocitos población estaba cerrado por el FSC y SSC y dentro de ellos PD-1 de expresión de CD4
+ células CD8 o se evaluó
+ células.
Especímenes
Los especímenes fueron seleccionados al azar de fijado en formol e incluidos en parafina tejidos de tumores malignos de perros (110 muestras en total), que se habían presentado para el diagnóstico histológico y guardados en un laboratorio comercial patología (Norte Lab, Hokkaido, Japón). Todas las muestras de melanoma (
n
= 40) utilizado en este estudio se originaron de la cavidad oral. Las muestras MCT (
n
= 5) fueron todos clasificados en Patnaik grado III [19]. Para muestra de adenocarcinoma mamario (
n
= 5) análisis, se incluyeron muestras de carcinoma de mama inflamatorio. Además de las muestras antes mencionadas, OS (
n
= 10), HSA (
n
= 10), el adenocarcinoma de próstata (
n
= 5), piel El carcinoma de células escamosas (
n
= 5), el linfoma difuso de células B grandes (
n
= 5), adenocarcinoma nasal (
n
= 5), sarcoma de tejidos blandos (
n
= 5), el sarcoma histiocítico (
n
= 5), carcinoma de células transicionales (
n
= 5), y el carcinoma de la glándula del saco anal con enfermedad metastásica (
n
= 5) muestras fueron estudiadas mediante técnicas de inmunohistoquímica.
la inmunohistoquímica
la tinción inmunohistoquímica fue examinado por el procedimiento complejo avidina-biotina peroxidasa (ABC). Secciones (4 micras) se dewaxed en xileno y alcoholes graduados a través hidratados. Para eliminar la peroxidasa endógena, las secciones se sumergieron en una solución de peróxido de hidrógeno al 3% a temperatura ambiente durante 10 min. Después de esto, las secciones se incubaron con anti-PD-L1 anticuerpo 6G7-E1 (10 mg /ml). Después de lavar con solución salina tamponada con fosfato, las secciones se incubaron en una solución de anticuerpo secundario (marcado con biotina de cabra anti-IgM de rata) (Jackson ImmnunoResearch Laboratories, West Grove, PA, EE.UU.) a temperatura ambiente durante 30 min. Después de la incubación, las secciones se hicieron reaccionar con el ABC en el Kit de VECTASTAIN Elite ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.) a temperatura ambiente durante 30 min. La visualización se lleva a cabo utilizando una solución de 3,3'-diaminobencidina al 0,05%. mancha hematoxilina de Mayer se utilizó como contratinción. Para el control negativo, las secciones se sometieron a los mismos procedimientos sin el anticuerpo primario o con el anticuerpo de control de isotipo IgM de rata (Acris Los anticuerpos, Herford, Alemania). La muestra se considera positiva para PD-L1 si había evidencia histológica de la tinción de células. No tinción evidente se observó en las secciones de control negativas (S1 FIG). Para preparar las muestras de OS, la descalcificación se realizó utilizando un protocolo estándar con solución de Plank-Rychlo. La tinción con azul de Berlín se realizó para distinguir los depósitos de hemosiderina de tinción positiva en las muestras de HSA, cuando sea necesario.
El análisis estadístico
En el análisis de citometría de flujo de PD-1 de expresión, de Mann-Whitney U test se llevó a cabo y
p Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
anti-PD-L1 anticuerpo 6G7-E1 se une específicamente al perro PD-L1
Los anticuerpos anti-PD-L1 que se puede unir al perro PD-L1 se establecieron previamente [16,17]. Entre ellos, 6G7-E1 mostró una unión suficiente según lo determinado por inmunohistoquímica de secciones fijadas en formalina y tumorales perro incluido en parafina. Para probar la especificidad de 6G7-E1 en la detección de perro PD-L1, tratamos primero análisis de transferencia de Western de canino PD-L1-conejo de proteína de fusión Fc de IgG [16] como un control positivo. Sin embargo, no se observó unión cuando se usó 6G7-E1 como el anticuerpo primario, mientras que un anticuerpo IgG Fc anti-conejo detecta la banda específico (datos no presentados). Debido a que este resultado sugiere que 6G7-E1 reconoce una conformación específica de perro PD-L1, el análisis de citometría de flujo de las líneas celulares de melanoma canino se realizó CMEC y CMM-1. No se observó unión con el no transfectadas o mock (sólo EGFP) transfectadas células de melanoma canino, mientras que 6G7-E1 se une a las células transfectadas con canino PD-L1-EGFP (Fig 1), lo que indica la unión específica de 6G7-E1 al perro PD-L1.
líneas celulares de melanoma canino, CMEC y CMM-1, fueron transfectadas con el vector pEGFP-N2 (mock) o pEGFP-N2-CPD-L1, y la unión de los anticuerpos se analizó mediante una citómetro de flujo. El área sombreada, la línea de negro, y la línea roja representan los resultados para las células sin tratamiento, las células transfectadas de manera simulada, y las células transfectadas-CPD-L1-EGFP, respectivamente. (A) La unión del anticuerpo de control de isotipo a CMEC; (B) Unión de 6G7-E1 a CMEC; (C) de unión del anticuerpo de control de isotipo a CMM-1; y (D) la unión de 6G7-E1 a CMM-1 se muestran en los histogramas. Sin unión del 6G7-E1 se observó en las células transfectadas de manera simulada o no transfectadas, mientras que se observó unión específica en las células transfectadas-CPD-L1-EGFP.
cánceres malignos caninos expresan PD-L1
se realizó un análisis inmunohistoquímico para detectar la expresión de PD-L1 en diversos cánceres malignos. En total, 110 muestras fueron probados, entre los cuales 36 melanoma oral, 7 OS, 6 HSA, 3 de grado III MCT, 4 mamaria adenocarcinoma, y 3 muestras de adenocarcinoma de próstata fueron PD-L1 positivo (Figs 2 y 3, y en la Tabla 1). Ambos se observaron tinción citoplasmática y la tinción de la superficie celular. Las tasas de expresión de PD-L1 fueron del 90% (36/40) para el melanoma oral, el 70% (7/10) para el sistema operativo, el 60% (6/10) de HSA, el 60% (3/5) de MCT grado III , 80% (4/5) de adenocarcinoma mamario, y 60% (3/5) de adenocarcinoma de próstata (Tabla 1). Los otros 7 tipos de tumores, a saber, el carcinoma de células escamosas, linfoma difuso de células B grandes, adenocarcinoma nasal, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma histiocítico, carcinoma de células de transición, y carcinoma de la glándula del saco anal no expresaban PD-L1, aunque el tamaño de la muestra analizada se limitó considerablemente (5 casos por cada tipo de tumor).
fijados en formalina y los tejidos tumorales incluidas en parafina fueron examinados por inmunohistoquímica. Las secciones se tiñeron con anti-PD-L1 mAb 6G7-E1. se muestran tinciones positivas representativas de (A, B) melanoma oral, (C, D) osteosarcoma, y (E, F) hemangiosarcoma. Aumento original: (A, C, E) 200 ×; (B, D, F) 400 ×.
fijados en formalina y los tejidos tumorales incluidas en parafina fueron examinados por inmunohistoquímica. Las secciones se tiñeron con anti-PD-L1 mAb 6G7-E1. se muestran tinciones positivas representativas de (A, B) tumor de mastocitos, (C, D) de adenocarcinoma mamario, y (E, F) adenocarcinoma de próstata. Aumento original: (A, D, E) × 200; (B) × 400; (C) × 100.
PD-1 es altamente expresado en los linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) en el melanoma canino orales
Con el fin de evaluar el nivel de expresión de PD-1 en linfocitos asociados a tumor, TIL se obtuvieron de los tejidos de cáncer quirúrgicamente extirpados, y se llevó a cabo el análisis de citometría de flujo. En comparación con los linfocitos de sangre periférica de perros sanos, PD-1 fue altamente expresado en tanto CD8
+ y CD4
+ TIL de melanoma oral (figura 4,
p Hotel & lt; 0,05). La tasa positiva de PD-1 de expresión de CD8
+ o CD4
+ TIL fue 70,9 a 96,6% o 80,2 a 96,8%, respectivamente (Tabla 2). En el caso de los tumores hepáticos, las células de control más óptimas estaban disponibles; Se utilizaron los linfocitos infiltrantes de tejidos normales (NIL) de los mismos individuos. Tanto en adenoma hepatocelular y en adenocarcinoma hepatocelular, TIL tenía mayor expresión de PD-1 que NILs (S2 Fig), indicando que la regulación positiva de la expresión de PD-1 podría ser un fenotipo común para los TIL.
TIL se obtuvieron de extirpados quirúrgicamente los tejidos de melanoma orales y el nivel de expresión de PD-1 se evaluó por citometría de flujo. Panel izquierdo, PD-1 de expresión de CD8
+ linfocitos. Panel derecho, PD-1 de expresión de CD4
+ linfocitos. Se utilizaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de perros sanos como control (control sano, HC).
p Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo (Mann-Whitney U test).
Discusión
El melanoma es un tipo relativamente común de tumor, lo que representa el 7% de todos los cánceres malignos y es la neoplasia maligna oral más frecuente en perros [20]. el melanoma maligno canino puede ocurrir en la piel de pelo, cavidad oral, lecho de la uña, almohadilla de la pata, ojos o unión mucocutánea [20]. Entre estas formas, el melanoma oral está considerado un cáncer muy maligno, ya que con frecuencia causa la invasión local severa y enfermedad metastásica. Desafortunadamente, melanoma oral es generalmente resistente a la quimioterapia, por lo que es difícil de tratar lesiones metastásicas, que finalmente matar perros enfermos [21]. La ausencia de una terapia sistémica efectiva fomenta el desarrollo de nuevas modalidades terapéuticas, incluyendo inmunoterapias. En los seres humanos, los inhibidores de punto de control inmunes tales como anticuerpos anti-PD-L1 anti-PD-1 y se han utilizado para el tratamiento de melanoma avanzado, mostrando eficacias prometedores, con las tasas de respuesta objetiva de 28% y 18%, respectivamente [6, 7]. En este estudio, el análisis inmunohistoquímico demostró que hasta un 90% (36/40) de perro melanoma oral, expresó PD-L1, lo que sugiere que el PD-1 /eje PD-L1 es un importante mecanismo de evasión inmune para esta forma de cáncer . Este resultado es también consistente con nuestro informe anterior, el cual mostró que el 100% (8/8) de melanoma oral, expresó PD-L1, mientras que la mayoría de melanoma escindió del ojo o la piel no expresaban PD-L1 [16]. Por otra parte, de acuerdo con estos resultados, PD-1 fue altamente expresado en tanto CD8
+ y CD4
+ TIL obtenidos a partir de melanoma oral. Estos TIL parecían exhaustos debido a motivos funcionalmente inmunosupresores, que suprimen las funciones efectoras de las células T en ratones y humanos, es altamente conservadas en el perro PD-1 [16]. Teniendo en cuenta que los perros malignas acciones de melanoma algunas similitudes con melanoma humano, los inhibidores de la DP-1 eje /PD-L1 también podría proporcionar efectos terapéuticos contra el perro de melanoma oral, y los perros podría ser un buen modelo animal para la investigación de los aspectos terapéuticos de PD-1 /inhibidores de la PD-L1 contra el melanoma en los estudios clínicos.
OS es el cáncer de hueso más común en los perros, conocidos por sus características altamente metastásico. Con amputación solo, MST para perros con OS es sólo 19 semanas, y aproximadamente el 90% de los perros desarrollan lesiones metastásicas [22,23]. Por lo tanto, la cirugía agresiva en combinación con la quimioterapia sistémica ha sido un tratamiento estándar para el sistema operativo canino, y las nuevas terapias sistémicas deben ser investigados. En los seres humanos, se espera que los anticuerpos anti-PD-L1 tener efectos terapéuticos en el sistema operativo debido a que aproximadamente el 75% (12/16) de OS metastásico mostró expresión de PD-L1. En un modelo de ratón, un anticuerpo anti-PD-L1 mejoró la función de los linfocitos T citotóxicos y aumentó la supervivencia de ratones portadores de tumores [24]. Debido a que se encontraron 70% (7/10) de sistema operativo principal en perros para expresar PD-L1, anticuerpos de bloqueo también pueden tener una eficacia terapéutica contra OS canina. Sin embargo, puede ser importante tener en cuenta que, a diferencia de sus lesiones metastásicas, no OS primaria humana expresada PD-L1 [24], mientras primaria perro OS expresó PD-L1 a una velocidad alta. La diferencia en la expresión de PD-L1 debe tenerse muy en cuenta al extrapolar los resultados de estudios OS humanos para OS canino o viceversa.
Los perros tienen un relativamente alto riesgo de desarrollar HSA [25], que es un tumor maligno cáncer que se origina a partir de células endoteliales vasculares. Teniendo en cuenta que el perro HSA es altamente metastásico, la quimioterapia adyuvante sigue siendo importante a pesar de que sólo puede proporcionar un beneficio modesto en los tiempos de supervivencia [26]. Debido a que el angiosarcoma es una enfermedad rara en los seres humanos, los informes sobre la expresión de PD-L1 en angiosarcoma se han limitado [27,28], y su implicación terapéutica no ha sido bien estudiado. Debido a que la expresión de PD-L1 se encontró en 60% (6/10) de las muestras de HSA perro, vale la pena investigar el potencial terapéutico de los inhibidores /PD-L1 como nuevos inmunoterapias sistémicos para perro HSA 1 PD-. expresión de PD-L1 en HSA puede compartir las características de sus células endoteliales vasculares originarios, porque las células endoteliales vasculares expresan PD-L1 en respuesta a varias citoquinas tales como IFN [29,30]. Puede ser razonable sugerir que HSA utiliza el PD-1 /eje PD-L1 como un mecanismo de evasión inmune porque PD-L1 en células endoteliales vasculares Se ha informado de regular negativamente CD8
+ respuestas de células T tales como IFN- γ producción y la actividad citolítica [30].
MCT es el cáncer cutáneo más común en los perros, que representa hasta un 21% de todas las neoplasias de la piel canina [31]. Aunque el comportamiento clínico de MCT puede variar, el grado histológico [19] se utiliza ampliamente y se considera que es un factor pronóstico fiable para perros MCT. De acuerdo con Bostock
et al
., De alto grado o MCT indiferenciada, MST es sólo 13 semanas [32] y la tasa de metástasis es tan alta un 56 a un 96%. En este estudio, de alto grado (grado III Patnaik) MCT se analizó para la expresión de PD-L1, y 60% (3/5) de las muestras se tiñeron positivamente. Este resultado también es así en consonancia con nuestro informe anterior, en el que el 66,7% (4/6) de grado III MCT mostró PD-L1 expresión [16]. A pesar de que algunos fármacos quimioterapéuticos citotóxicos e inhibidores de la quinasa KIT tirosina, como imatinib y Toceranib se han utilizado para tratar MCT sistémicamente, inhibidores de punto de control inmunes dirigidas a la PD-1 /eje PD-L1 también tienen el potencial para ser incluidos en el tratamiento de la MCT porque el aparición de resistencia a los medicamentos a veces se observa durante la quimioterapia, incluyendo que con inhibidores de KIT. Aunque la expresión de PD-L1 en el grado I o II MCT queda por investigar, la expresión de PD-L1 puede estar relacionado con el comportamiento biológico de MCT porque conduce CD8
+ supresión de células T y facilita la metástasis en modelos de cáncer de ratón [33 ]. Se requieren más investigaciones para evaluar si la expresión de PD-L1 podría ser utilizado como un marcador pronóstico de este cáncer complicado y heterogéneo.
tumores de glándula mamaria son las neoplasias más frecuentes en perras sexualmente intactas, lo que representa el 70% de todos los casos de cáncer en esta subpoblación [34]. Entre los tumores malignos de mama, adenocarcinoma mamario representa una patología en común, y los perros con adenocarcinoma mamario tratados sólo con cirugía a veces sufren de una recurrencia y /o metástasis. La quimioterapia tiene algunos beneficios para los tumores malignos de mama; Sin embargo, en muchos casos, no es curativa, y alternativa o adicional terapias sistémicas necesitan ser explorados. En los seres humanos, se observó la expresión de PD-L1 en células tumorales en el 34% (15/44) de los pacientes con cáncer de mama, y su expresión se correlacionó significativamente con algunos factores de pronóstico importantes, tales como la expresión de los receptores de hormonas [35]. En los perros, el 80% (4/5) de las muestras de adenocarcinoma mamario expresó PD-L1, aunque su asociación con el pronóstico sigue siendo poco clara. Una investigación adicional de la relación entre el estado de la expresión de PD-L1 y el pronóstico en el caso de tumores mamarios caninos debe llevarse a cabo, y vale la pena por lo menos a evaluar el potencial terapéutico de PD-1 inhibidores /PD-L1 como novela Las terapias sistémicas contra este tipo de cáncer.
el adenocarcinoma de próstata es una enfermedad relativamente poco común en los perros. Aunque la incidencia es baja, adenocarcinoma de próstata se presenta a menudo como un problema clínico debido a la progresión y metástasis locales son las secuelas común. En el momento del diagnóstico, metástasis regionales y distantes se pueden encontrar en la mayoría de los casos, y MSTs para perros con ningún tratamiento se considera que son menos de un mes [36]. Hasta la fecha, no se ha logrado consenso para el estándar de cuidado y los tratamientos convencionales como la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia son paliativos en la mayoría de los perros. En los seres humanos, el 50% (8/16) de cáncer de próstata resistente a la castración se reportaron (CRPC) casos para expresar PD-L1 [37]; sin embargo, ninguno de los pacientes CRPC que recibieron un anticuerpo anti-PD-1 tuvo una respuesta objetiva en un ensayo clínico [6]. No hay respuesta en los pacientes CRPC es posiblemente debido a la ausencia de expresión de PD-L1 en los tejidos tumorales, aunque sólo unas pocas muestras de los pacientes que participaron fueron examinadas y se encontró que PD-L1-negativas [6,38]. En este estudio, PD-L1 se expresó en el 60% (3/5) de las muestras de adenocarcinoma de próstata perro, pero sus implicaciones terapéuticas siguen siendo oscuros. Otros estudios de la asociación de la expresión de PD-L1 con el resultado del tratamiento deben llevarse a cabo, y los perros podrían ser un poderoso modelo animal para el cáncer de próstata humano porque las acciones de adenocarcinoma de próstata de perro algunas características con cáncer de próstata humano en términos de su ocurrencia espontánea, la propensión metastásica y expresión de PD-L1.
Los otros tipos de cáncer probados en este estudio no mostró ninguna expresión de PD-L1. La ausencia de expresión de PD-L1 en estos tumores puede ser debido a diferencias en el origen de las células tumorales, sitio del tumor, y /o condición inmunológica de cada cáncer. Debido a que el tamaño de la muestra sometida a prueba en este estudio fue muy pequeño, un análisis más detallado se debe realizar antes de hacer una conclusión sobre el estado de la expresión de PD-L1 en aquellos tipos de cáncer. Recientemente, los mecanismos de regulación de la expresión de PD-L1 en los seres humanos han sido ampliamente investigados. Uno de los mecanismos para la inducción de la expresión de PD-L1 en células tumorales es en respuesta a IFN-γ [9], lo que probablemente se produce por las células inmunes en el microambiente tumoral durante las respuestas inmunitarias antitumorales. Dado que la expresión de PD-L1 en líneas celulares de cáncer canino fue inducido o mejorado por el IFN-γ tratamiento canina [16], este mecanismo también es probable que participen en la regulación de PD-L1 en los perros. Otro mecanismo se asocia con la señalización oncogénica; la pérdida de la función de fosfatasa y tensina homólogo (PTEN) se ha informado de regular positivamente la expresión de PD-L1 en glioma y células de cáncer de mama triple negativos [39,40]. En los perros, también se informó de una mutación y /o pérdida de PTEN en el melanoma, OS, HSA, y los tumores de las glándulas mamarias malignas [41-44]. Esto puede contribuir, al menos en parte, a la expresión aberrante de PD-L1 en estos tipos de cáncer en perros.
A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer reporte de expresión de PD-L1 en diversos cánceres malignos caninos . Análisis de la expresión de PD-L1 tiene implicaciones importantes en una aplicación clínica de 1 PD-inhibidores /PD-L1 en perros debido a que, en los ensayos clínicos humanos con un anticuerpo anti-PD-1, se informó de expresión de PD-L1 de estar asociado con el el resultado del tratamiento. Los pacientes con tumores PD-L1-positivos tenían una tasa de respuesta objetiva del 36%, mientras que ninguno de los pacientes con tumores PD-L1-negativos tuvo una respuesta objetiva [6]. Nuestros datos proporcionan información básica sobre la participación de eje /PD-L1 en la inmunología del cáncer canino y fuertemente fomentar el desarrollo de nuevas inmunoterapias 1-PD para apuntar el PD-1 /PD-L1 vía en perros. Debido a que los anticuerpos anti-PD-L1 demostraron tener potencial terapéutico para el cáncer canino [16], las aplicaciones clínicas de los anticuerpos anti-PD-L1 merecen una mayor investigación.
Apoyo a la Información
S1 Fig. Representante inmunohistoquímica con el anticuerpo de control de isotipo correspondiente.
muestra de melanoma oral se tiñó con un anticuerpo IgM de rata de control de isotipo. No se observó tinción. Aumento original, 200 ×
doi:. 10.1371 /journal.pone.0157176.s001 gratis (TIF)
S2 Fig. PD-1 de expresión en los TIL obtiene a partir de los tumores hepáticos.
TIL obtiene a partir de (A) y adenoma hepatocelular (B) adenocarcinoma hepatocelular se analizaron para determinar la expresión de PD-1 mediante citometría de flujo (línea roja). linfocitos infiltrantes de tejidos normales (NIL) obtenidas a partir de tejido hepático sano adyacente de los mismos individuos (línea azul) se utilizaron como control. línea de negro, control de isotipo de TIL. El área sombreada, control de isotipo para NILs
doi:. 10.1371 /journal.pone.0157176.s002 gratis (TIF)