Extracto
Antecedentes
Bacilo de Calmette-Guerin (BCG) es el tratamiento más eficaz para no músculo cáncer de vejiga invasivo. Sin embargo, un fallo en la respuesta inicial o recaída dentro de los primeros cinco años de tratamiento se ha observado en el 20% de los pacientes. Hemos observado anteriormente que
in vivo
administración de un inhibidor de óxido nítrico mejora la respuesta a BCG de ratones portadores de tumor de vejiga. Se describió que este efecto era debido a una sustitución de tejido tumoral por los depósitos de colágeno. El objetivo del presente trabajo fue aclarar el mecanismo involucrado en este proceso.
Metodología /Principales conclusiones
Hemos demostrado que la BCG induce la proliferación de fibroblastos NIH-3T3 mediante la activación de las vías de señalización MAPK y PI3K y también la diferenciación determinada por alfa-actina de músculo liso (alfa-SMA) expresión.
In vivo
, la inoculación intratumoral de BCG también aumentó alfa-SMA y la expresión de colágeno. La administración oral de L-NAME aumentó el efecto pro-fibrótico de la BCG. macrófagos peritoneales obtenidos de ratones portadores de tumores tratados MB49
in vivo
con el tratamiento combinado de BCG con L-NAME proliferación de fibroblastos también se ha mejorado. Se observó que FGF-2 es uno de los factores liberados por los macrófagos activados por BCG que es capaz de inducir la proliferación de fibroblastos. La participación de FGF-2 se evidenció utilizando un anticuerpo anti-FGF2. Al mismo tiempo, esta población de macrófagos heridas mejorado la tasa de curación en ratones normales y FGF-2 expresión también se incrementó en estas heridas.
Conclusiones /Importancia
Nuestros hallazgos sugieren que los fibroblastos son el blanco de BCG tanto directamente como a través de los macrófagos activados en un contexto de inmunoterapia de un modelo murino de la vejiga. También se describe, por primera vez, que el FGF-2 está implicada en un cuadro de diálogo entre los fibroblastos y macrófagos inducidos después del tratamiento con BCG. El hecho de que la administración de L-NAME mejora el efecto de la BCG en los fibroblastos, la inhibición de NO, podría representar un nuevo enfoque para añadir a la terapia convencional BCG
Visto:. Lodillinsky C, Langle Y, Guionet A, Góngora A, Baldi A, Sandes EO, et al. (2010) Calmette Guerin Induce Bacillus fibroblastos activación tanto directamente como a través de los macrófagos en un modelo de cáncer de vejiga del ratón. PLoS ONE 5 (10): e13571. doi: 10.1371 /journal.pone.0013571
Editor: Ludovic Tailleux, Instituto Pasteur, Francia |
Recibido: 5 de Mayo, 2010; Aceptado: 4 de octubre de 2010; Publicado: 22 Octubre 2010
Derechos de Autor © 2010 Lodillinsky et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CL, YL, AB, AME), y las subvenciones del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas-PIP, y la Universidad de Buenos Aires -UBACYT M017 (www.conicet.gov.ar . www.uba.ar). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
en el momento del diagnóstico, el 60-80% de los tumores de vejiga son invasivos y confinado en el urotelio y /o lámina propia no músculo. Estos incluyen tumores papilares o carcinoma in situ. Ambos tipos de tumores comúnmente ocurren simultáneamente. En 1976, Morales et al. [1] informó, por primera vez, el exitoso uso intravesical de
Bacilo de Calmette Guerin (BCG)
como un tratamiento adyuvante para no músculo invasivo cáncer de vejiga después de la resección transuretral. Ahora es ampliamente aceptado que intravesical de BCG es más potente terapia para prevenir la recurrencia del tumor que cualquier quimioterapia intravesical [2]. Sin embargo, aproximadamente 20% de los pacientes o bien no responden inicialmente o recaída dentro de los primeros cinco años de tratamiento [3].
Se sabe que BCG genera una reacción inmunológica local con la activación de las células inmunes, así como la secreción de citoquinas que implican la citotoxicidad de células Th1 [4]. se ha observado un aumento significativo de células polimorfonucleares y mononucleares que se infiltran en los tumores de vejiga después de la terapia BCG [5]. Desde macrófagos (MAC) son células fagocíticas y presentadoras de antígeno y tienen la capacidad para secretar citoquinas y factores de crecimiento, se consideran las células mejor equipados implicados en la inmunoterapia con BCG. Dependiendo del microambiente, la naturaleza y la intensidad donde MACs diferenciación tiene lugar, estas células son capaces de activar diferentes vías y dar lugar a perfiles particulares [6]. Las respuestas de los MAC después de una lesión o infección son ejemplos de diferentes estímulos que desencadenan la activación de los MAC en los tejidos, presentan una gran plasticidad. BCG, cuando se utiliza como inmunoterapia para tumores de vejiga, es procesada por MACs y células uroteliales, resultando en la liberación temprana de citoquinas inflamatorias, algunas de las cuales pueden ser responsables de ciertos efectos adversos observados en pacientes [7], [8]. Uno de los mediadores de este proceso inflamatorio es el óxido nítrico (NO), generado por una familia de NO sintasas (NOSs). Las citocinas inflamatorias y /o productos bacterianos generalmente activan la expresión de la isoforma inducible NOS (iNOS), la generación de grandes cantidades de NO. iNOS no se expresa en el epitelio normal de la vejiga, pero se ha detectado en las recurrencias tumorales de vejiga primeros [9] y se ha informado de que la expresión de iNOS en las células tumorales podría estar asociada con la falta de respuesta a BCG [10]. Hemos informado anteriormente de que la administración in vivo de BCG a MB49 ratones portadores de tumores se redujeron el crecimiento del tumor y que el tratamiento combinado de BCG con el inhibidor de NOS L-NAME mejorado significativamente la regresión del tumor mediante la sustitución de tejido tumoral por los depósitos de colágeno, se asemeja a la cicatrización de heridas [11] . Nuestros resultados actuales sugieren que el control de las recidivas tumorales de vejiga por la terapia con BCG implica la reorganización estroma y que la inhibición de NO podría mejorar la remodelación tisular. La cicatrización de heridas es un ejemplo de la reorganización del tejido, ya que la generación después de la herida, los factores de crecimiento liberados a la matriz extracelular induce un proceso inflamatorio que permite la migración de células [12]. Entre otros, MACs y fibroblastos son células importantes involucrados en este proceso. Fibroblastos migrar hacia la zona dañada, se diferencian en miofibroblastos y sintetizar proteínas de matriz extracelular que permiten la contracción y, finalmente, la herida cierre. En una herida contexto, factores de crecimiento tales un crecimiento fibloblast factor de 2 (FGF-2) y la transformación del factor de crecimiento beta (TGF-beta) secretado por MACs, estimulan los fibroblastos que son responsables de la síntesis, deposición y remodelación de la matriz extracelular de curación [13]. FGF-2 se identificó originalmente como un factor de crecimiento básico que estimula la proliferación de fibroblastos NIH-3T3. Además, varios estudios han demostrado un papel de FGF-2 en la fibrosis del tejido, donde este factor es mayor en las heridas agudas y desempeña un papel en la formación de tejido de granulación, reepitelización y remodelación de tejidos [12], [14].
Para nuestro conocimiento, no existe información sobre el papel en la remodelación de tejidos de la BCG cuando se utiliza en el tratamiento del cáncer de vejiga. Por lo tanto, el objetivo de nuestro trabajo fue evaluar el efecto de la vacuna BCG en la activación de fibroblastos, medido por MAPK y PI3K vías de señalización y colágeno I, y alfa-actina de músculo liso (alfa-SMA) expresión. Desde MAC están implicados tanto en la respuesta BCG y en la reorganización del tejido como se observa en el proceso de cicatrización de la herida [6], [15], también hemos evaluado el papel de los MAC en tratamiento con BCG y NO terapia de inhibición, en la activación de fibroblastos en un modelo de cicatrización de heridas . Nuestros hallazgos sugieren que, como parte de los mecanismos de control de cáncer de vejiga, BCG induce la activación de los fibroblastos, ya sea directamente oa través de los MAC, que mediante la liberación de productos solubles, pueden por sí mismas activar los fibroblastos. La participación de NO como un regulador negativo de este proceso también se demostró.
Resultados
BCG induce la proliferación NIH-3T3
Se ha descrito que la BCG es capaz de inducir la detención del ciclo celular y la apoptosis en líneas celulares tumorales de vejiga [15], [16]. Sin embargo, una pregunta restante podría ser lo que sería el efecto de la vacuna BCG en los fibroblastos? Para responder a esta pregunta células NIH-3T3 se cultivaron bajo diferentes concentraciones de BCG. Como se muestra en la Fig. 1A y 1B, BCG indujeron la proliferación de células NIH-3T3, evaluados tanto contando el número de células y mediante el ensayo de MTS. se detectó la inducción de la proliferación de fibroblastos con concentraciones de BCG de 1,5 × 10
6 CFU /ml hasta 3 × 10
6 CFU /ml, disminuyendo para concentraciones superiores a 6 × 10
6 CFU /ml. Nuestros resultados muestran discrepancias cuando la determinación de la proliferación se hizo o bien mediante el recuento del número de células o por MTS (figura 1 A y B respectivamente) para concentraciones iguales o mayores que 6 × 10
6 CFU /ml. Creemos que esta diferencia se relaciona con mejorar la actividad mitocondrial inducida por altas cantidades de BCG. Por lo tanto, los siguientes experimentos se llevaron a cabo con 3 × 10
6 UFC /ml de BCG para el que existe un acuerdo entre las dos formas de cuantificación. Para evaluar si PI3K y MAPK vías participan en la proliferación de fibroblastos inducida por BCG, se analizaron los efectos de la LY 294002 y PD 98059, inhibidores de PI3K y MAPK vías, respectivamente, sobre la proliferación de fibroblastos inducida por BCG. También se evaluó la fosforilación de ERK y AKT, dos moléculas activadas que son clave en estas vías. Hemos observado que LY (20 mM) fue capaz de inhibir la proliferación inducida por BCG después de 24 h de tratamiento (Fig. 1C), y que PD (50 M) inhibió la proliferación inducida por BCG después de 48 h de tratamiento (Fig. 1D ). Como se muestra en la Fig. 1E y 1F, el tratamiento con BCG indujeron una rápida fosforilación de ERK y AKT dentro de 5 min. Los análisis de transferencia Western reveló que la fosforilación de AKT se estimuló entre 5-10 min, disminuyendo después de 20 min (Fig. 1E). BCG también indujo la fosforilación de ERK1 y ERK2 después de 5 min, que luego disminuye después de 30 min (Fig. 1F). Esta interacción entre BCG y de fibroblastos implica tanto una proliferación y una vía de supervivencia. Estos datos sugieren que los objetivos de BCG no sólo las células tumorales y Mac, sino también a los fibroblastos.
(A) NIH-3T3 de fibroblastos se trataron con diferentes concentraciones de BCG durante 24 h. Se contaron las células o se evaluó la viabilidad (B) de células por un método titter celular no radiactivo (MTS), frente al control: p & lt; 0,05. (C) Efecto de LY 294002 y (D) PD 98059 evaluadas por MTS en fibroblastos estimulados con BCG (3 × 10
6 CFU /ml) durante 24 y 48 h, respectivamente, a: p & lt; 0,05 vs control, b: vs BCG. Fibroblastos estimulados con BCG (3 × 10
6 CFU /ml) y p-AKT (E) y p-ERK (F) determinada por Western blot. los niveles de fosforilación relativos se normalizaron a la proteína total y se refirieron como un factor de cambio de control, un:. p & lt; 0,05
La proliferación de células 3T3-SNS fue reforzada por L-NAME de 0,5 a 4 mM (p & lt; 0,05) de una manera independiente de la concentración (datos no mostrados). Cuando los fibroblastos fueron tratados con un protocolo combinado, se detectó la actividad de proliferación más alta con BCG 3 × 10
6 CFU /ml, más 2 mM L-NAME (Fig 2). Este efecto fue inhibido por LY 294002 y PD 98059, lo que indica que L-NAME es capaz de mejorar la proliferación inducida por BCG en células NIH-3T3 mediadas por MAPK y PI3K vías de señalización.
NIH-3T3 de fibroblastos fueron tratados con BCG (3 × 10
6 CFU /ml), L-NAME (2 mM) o BCG y L-NAME en presencia de LY 294002 y PD 98059 para 24 y 48 h, respectivamente. La viabilidad celular se evaluó por MTS. a: p & lt; 0,01 vs control; b: p & lt; 0,05 vs BCG o L-NAME solo; c:. p & lt; 0,01 frente a su respectivo control
BCG induce NIH-3T3 diferenciación
La activación de fibroblastos en miofibroblastos, un paso crucial en el proceso de cicatrización de la herida, se caracteriza por el desarrollo de las fibras de estrés intracitoplasmáticas que confieren a estas células la capacidad de desarrollar la tensión, y por el aumento de la síntesis de componentes de la matriz extracelular, como colágeno de tipo I [17], [18]. El marcador más importante de la transición fenotípica de fibroblastos /miofibroblastos es la Expresión novo de alfa-actina de músculo liso [19]. Por lo tanto, se analizaron alfa-SMA y colágeno I como indicadores de la actividad fibrogénicos y evaluó la expresión de estas moléculas en células NIH-3T3 tratados con BCG.
Para establecer la mejor dosis de BCG, la inmunofluorescencia de ambas proteínas fue lleva a cabo en fibroblastos tratados con diferentes concentraciones de BCG durante 24 h (datos no mostrados). La expresión más fuerte de los dos alfa-SMA y colágeno I se observó con 3 × 10
6 CFU /ml de BCG (Fig. 3A), por lo tanto, se eligió esta concentración para llevar a cabo los análisis de transferencias de Western. La Figura 3B muestra que 3 × 10
6 CFU /ml de BCG fue capaz de inducir la expresión de colágeno I, después de 6 h de tratamiento, siendo la expresión 2,5 veces mayor que los controles después de 12 h de tratamiento. Una inducción significativa de la alfa-SMA se observó después de 12 h de tratamiento con BCG, permaneciendo aumentó a las 48 h post-tratamiento. Tomados en conjunto los datos mostraron hasta ahora, podríamos formular la hipótesis de que la activación de fibroblastos también puede tener lugar in vivo.
(A) Inmunofluorescencia tinción de los NIH-3T3 tratados con BCG (3 × 10
6 UFC /ml) durante 24 h reveladas con anticuerpos anti-colágeno I y el anticuerpo anti-alfa-SMA. Escala: bar = 100 um. (B) Western Blot de los homogeneizados de fibroblastos tratados con BCG (3 × 10
6 CFU /ml) en diferentes momentos para determinar el colágeno I y la inducción alfa-SMA. (C) unidades densitométricas de colágeno I o (D) alfa-SMA se determinaron utilizando el software de análisis, relativizada a la beta-actina y se hace referencia como un factor de cambio de control de a: p & lt; 0,05, b:. P & lt; 0,01
BCG induce la activación de fibroblastos a través de los macrófagos
in vitro e induce
colágeno y la expresión de alfa-SMA en MB49 tumores
in vivo
a medida que el tratamiento directo con BCG induce la proliferación de fibroblastos y MACs son algunas de las células más importantes en las respuestas de BCG, la hipótesis de que existe un diálogo entre los fibroblastos y MAC en tratamiento con BCG. Para probar esto, se investigó si MACs tratados con BCG pueden afectar a la proliferación y diferenciación de fibroblastos. En primer lugar, se evaluó la producción de NO en los MAC tratados con BCG. Como se muestra en la Fig. 4A, MACs peritoneales de ratones portadores de tumor tratados in vivo con BCG producen mayores cantidades de NO que los de los no tratados. In vitro, el tratamiento de la línea celular RAW 264.7 MAC con BCG también aumentó la producción de NO. Para evaluar el papel de los productos solubles liberados de MAC, se obtuvo el medio condicionado (CM) a partir de MACs peritoneales de ratones portadores de tumores, ya sea tratados in vivo o no con BCG +/- L-NAME. Hemos observado que la CM de MACs peritoneales de los ratones portadores de tumor (MAC-T) de los diferentes grupos inducidos proliferación de fibroblastos. En particular, el CM de MACs de los ratones portadores de tumor tratados in vivo con BCG (MACs-T-BCG), además de L-NAME induce la tasa de proliferación de fibroblastos más alta in vitro. El CM no tratada de RAW 264.7 no modificó la proliferación de fibroblastos. Sin embargo, el tratamiento in vitro de RAW 264.7 con BCG, ya sea combinada o no con L-NAME, de manera similar a MACs peritoneales, también la proliferación inducida por NIH-3T3 (Fig. 4B).
(A) se determinó la producción de NO en los sobrenadantes de los dos MACs peritoneales de ratones portadores de tumores MB49 (MAC-T) y RAW 264.7 tratadas in vivo con BCG (6 × 10
6 UFC /ml) o in vitro (3 × 10
6 UFC /ml), respectivamente, se evaluaron en el sobrenadante por el reactivo de Griess. a: p & lt; 0,0001 vs control. Células RAW 264.7 fueron tratados con BCG (3 × 10
6 CFU /ml) durante 24 h, y luego se lavaron las células extensamente con PBS. se añadió medio libre de suero y se continuó la incubación durante 24 horas para obtener el CM. (B) de fibroblastos tratados durante 48 h con el CM de células peritoneales o RAW 264.7 tratadas previamente con BCG (3 × 10
6 CFU /ml) más L-NAME (2 mM). viabilidad de fibroblastos fue evaluada por MTS y se refiere como un porcentaje de control (264.7 o NIH-3T3 líneas de células sin tratar RAW), a: p & lt; 0,05 y b: p & lt; 0,01 vs control, c: p & lt; 0,05 vs control de MAC-T. (C) Western Blot para determinar el colágeno I y alfa-SMA de homogeneizados de fibroblastos tratados durante 24 h con CM de RAW 264.7 tratadas previamente para 24 h con BCG más L-NAME. nivel relativo de expresión se normalizó a beta-actina y se hace referencia como un factor de cambio de control, a: p & lt; 0,05, b: p & lt; 0,01. (D) Masson Trichome (panel superior) y la tinción inmunohistoquímica (panel inferior), para determinar las fibras de colágeno y alfa-SMA, respectivamente, se llevaron a cabo en MB49 tumores de crecimiento por vía subcutánea en ratones tratados con BCG, L-NAME o BCG + L-NAME. Las flechas blancas muestran la mancha azul de las fibras de colágeno. Las flechas amarillas muestran tinción positiva marrón para alfa-SMA. Escala:. Bar = 100 um
El CM obtiene a partir de RAW 264.7 expresión I inducida por colágeno en los fibroblastos. La expresión fue mayor cuando el CM era de MACs tratados con BCG, y este efecto se mantuvo alta bajo la adición de L-NAME. El CM obtiene a partir de RAW 264.7 tratadas con BCG más L-NAME también indujo la expresión de alfa-SMA (Fig. 4C). Estos resultados parecen indicar que hay algunos factores solubles secretadas a partir de MAC activadas por BCG que pueden inducir la proliferación de fibroblastos y la activación. Con el objetivo de evaluar este efecto in vivo se analizó la deposición de colágeno y la expresión de alfa-SMA en ratones portadores de tumores MB49 bajo BCG y el tratamiento con L-NAME. Nuestros resultados muestran que tanto BCG y L-NAME y su combinación indujo la deposición de fibras de colágeno en estos tumores. BCG y L-NAME también indujo la expresión de alfa-SMA en comparación con el grupo control. Sin embargo, se observó tinción más intensa de la alfa-SMA en los tumores tratados con BCG más L-NAME. Estos resultados sugieren que BCG puede inducir la activación de fibroblastos in vivo, y que este efecto se mejora por la inhibición de la producción de NO.
mejora la inhibición del óxido nítrico
in vivo
la cicatrización de heridas inducidas por MACs peritoneales de los ratones portadores de tumor tratados con BCG
Para determinar la capacidad funcional de MAC en tratamiento BCG y su regulación por NO, se realizó un experimento in vivo de cicatrización de heridas. MAC-T peritoneal ya sea tratados o no con BCG in vivo se colocaron en una herida en la piel dorsal de los ratones normales. El inhibidores de la NO L-NAME y 1400W se añadieron en las heridas, ya sea solos o combinados con los MAC. La herida superficial se redujo significativamente cuando los Macs desde normales (datos no mostrados) o MAC-T se añadieron en la herida en comparación con los controles, en los que sólo se añadió una solución de PBS-glicerol. Es importante tener en cuenta que la adición de inhibidores de la NO el L-NAME o 1400W solo fueron capaces de disminuir significativamente la herida superficie. Cuando se añadieron MACs peritoneales de ratones portadores de tumores que habían recibido BCG por vía intratumoral (MACs-T-BCG) en la herida, el porcentaje de cierre de la herida se redujo, en comparación con las heridas con MAC-T. Sin embargo, al agregar estos MAC-T-BCG con 1400 W, la tasa de curación de heridas, fue significativamente superior (Fig. 5A).
(A) MACs peritoneales de ratones portadores de tumores, ya sea o no tratados con BCG ( MAC-T-BCG y MAC-T, respectivamente), fueron colocados en la herida de la piel dorsal de ratones normales. se añadió L-NAME (2 mM) o 1.400 W (1 uM) sobre la herida. El cierre de la herida se calculó como el porcentaje del área inicial de la herida (día cero), a: p & lt; 0,01, b: p & lt; 0,001 vs PBS-gli, c: p & lt; 0,05 vs control de MAC-T-BCG. (B) Peritoneal MACs-T-BCG se colocaron en dorsal herida en la piel de los ratones tratados por vía oral con L-NAME (0,2 g /kg de ratón), a: p & lt; 0,0001 vs PBS-gli, b: p & lt; 0,01 vs MAC-T -BCG de control.
Cuando la herida de la piel dorsal fue generada en ratones beben ellos el inhibidor de L-NAME, la herida de la superficie se redujo en comparación con el grupo control. MAC-T-BCG Además también inducida por la aceleración de la cicatrización de heridas. Además, la adición MACs-T-BCG mejora la reparación de la herida cuando los ratones recibieron L-NAME por vía oral (Fig. 5B).
FGF-2 media el efecto estimulador de macrófagos activados-BCG en fibroblastos
se ha demostrado que el FGF-2 es uno de los principales factores de crecimiento implicados en la proliferación de fibroblastos [20]. Además, se ha demostrado que el FGF-2 es capaz de inhibir la apoptosis en células NIH-3T3 tratados con fármacos de quimioterapia [21]. Así, hemos planteado la hipótesis de que el FGF-2 podría ser uno de los factores solubles secretados por los MAC activadas capaces de estimular la proliferación de fibroblastos. Para confirmar esta idea, primero analiza si el FGF-2 se modula en MACs células RAW 264.7 en tratamiento con BCG. La figura 6A muestra, por tinción de inmunofluorescencia, que FGF-2 se incrementa en MACs RAW 264.7 tratadas con BCG en comparación con las células no tratadas. Esto también se observó mediante un ensayo de western blot (Figura 6B), donde se puede ver una banda de 17,2 kDa compatibilidad con la secreción de FGF-2. Las bandas de peso molecular más alto representan no secretor FGF-2. A continuación realizó un ensayo de proliferación con CM derivado de RAW 264.7 activada por BCG, agotadas o no de FGF-2. CM de RAW 264.7 tratadas con BCG aumentó la proliferación de fibroblastos, mientras que el agotamiento de FGF-2 redujo significativamente la estimulación de los fibroblastos, lo que sugiere que los MAC activadas con BCG podría inducir la proliferación de fibroblastos, al menos en parte, por FGF-2 secreción. Los fibroblastos migran en la herida, en el que proliferan y producen grandes cantidades de matriz extracelular. Algunos fibroblastos differentiante en miofibroblastos, que son responsables de la contracción de la herida y la deposición de matriz adicional [22]. Para evaluar si los MAC de los ratones tratados con BCG portadores de tumores son capaces de inducir FGF-2 in vivo, la expresión de FGF-2 se evaluó en ensayos de curación de heridas. Al lado, también se evaluó la expresión de FGF-2 en tumores MB49. análisis histológico de las heridas de la piel mostraron una mayor expresión de FGF-2 en las heridas con MAC-T-BCG. Cuando estos MAC se colocaron junto con los inhibidores de NO en las heridas, la expresión de FGF-2 se mantuvo alta (Fig. 6D). El alto nivel de FGF-2 fue consistente con la tasa de curación aumento que se mostró en la Fig. 5. Además, se observaron resultados similares en MB49 tumores, en los que la expresión de FGF-2 fue mayor en los tumores de los ratones tratados ya sea con BCG o con L-NAME que en los controles. Los tumores derivados de ratones que recibieron el tratamiento combinado mostraron más localizada e intensivo FGF-2 tinción (Fig. 6E). En este modelo, nuestros resultados muestran que el FGF-2 se asocia con el mecanismo de la inmunoterapia acción BCG.
(A) La tinción de inmunofluorescencia con anti-FGF-2 de anticuerpos de RAW 264.7 MACs tratados con BCG (3 × 10
6 UFC /ml) durante 24 h. (B) Western blot de lisados de RAW 264.7 tratadas con BCG (3 × 10
6 UFC /ml) durante 8 y 24 h. 20 ng de FGF-2 murino purificado se utilizó como control positivo. nivel relativo de expresión se normalizó a GAPDH y se refirió como un factor de cambio de control, a: p & lt; 0,05 (C) fibroblastos fueron tratados con CM de células RAW 264.7 tratadas previamente con BCG (3 × 10
6 CFU /ml), L-NAME o BCG plus L-NAME durante 24 h. El control se lleva a cabo con medios de cultivo agotado (CM 3T3, de las mismas células NIH-3T3). se utilizó 0,5 ng /ml de FGF-2 en CM 3T3 como un control positivo. la proliferación NIH-3T3 se controló mediante
3 (H) la incorporación de timidina. El CM se preincubó 1 h con 10 g /ml del bloqueo monoclonal anti FGF-2 de anticuerpos (DB3), o IgG normal como control, a: p & lt; 0,001 vs CM NIH-3T3, b: p & lt; 0,001 vs IgG. (D) La tinción inmunohistoquímica para determinar la expresión de FGF-2 se realizó en heridas de la piel. Las heridas se trataron con MACs peritoneales de ratones portadores de tumores tratados o no con BCG (MAC-T y MAC-T-BCG respectivesly) solo o de forma local en combinación con inhibidores de la NO (E). La tinción inmunohistoquímica de FGF-2 se realizó en s.c. MB49 tumores de los ratones tratados con BCG, L-NAME o BCG más L-NAME. Escala:.. Bar = 100 um
Discusión
La terapia intravesical con BCG juega un papel importante en el tratamiento y profilaxis de no músculo invasivo carcinoma de vejiga recurrente [23]
Shelley et al. [24] han descrito recientemente en un meta-análisis del estudio que la BCG utiliza como adyuvante después de la resección transuretral reduce el riesgo de recurrencia en un 67% a los 12 meses en comparación con la resección transuretral solo; sin embargo, algunos efectos secundarios tales como cistitis, fiebre y hematuria, se asociaron con la administración de BCG. El mecanismo exacto de la actividad antitumoral de BCG no se conoce completamente, pero parece que la BCG implica tanto a efectos directos sobre las células tumorales [16] y los efectos indirectos mediados por células inmunes [7].
Hemos informado anteriormente que BCG wass capaz de inducir la inhibición del crecimiento de células tumorales de vejiga MB49 ya sea in vitro o in vivo se inocularon en ratones singénicos NO producido por las células MB49 con cáncer tratados con MACs y esplenocitos BCG inducida por la muerte, lo que sugiere una función inmunosupresora in vivo de NO. Nuestros experimentos también mostraron una mayor inhibición del crecimiento del tumor en ratones tratados con BCG combina con L-NAME en comparación con BCG solo. En el primer caso, pocas células tumorales restantes estaban completamente rodeados por fibras de colágeno [11].
En el presente trabajo, investigamos algunos de los mecanismos por los cuales BCG y L-NAME generan la cicatriz ya hemos descrito anteriormente. Las vías de señalización de MAPK y PI3K han sido ampliamente estudiado en diferentes modelos. Estos son activadas por diferentes estímulos, tales como factores de crecimiento y citoquinas [25], [26]. Nuestros hallazgos presentes demuestran que BCG es capaz de inducir directamente la proliferación de fibroblastos NIH-3T3 a través de MAPK y PI3K vías de señalización, la expresión de colágeno y la diferenciación de fibroblastos tal como se determina por la expresión de alfa-SMA. Además, la inmunohistoquímica de los tumores de los ratones tratados con BCG, mostraron aumento de la expresión de fibras de colágeno y alfa-SMA, lo que sugiere que la activación de fibroblastos también podría tener lugar.
Creemos que BCG puede actuar en el estroma que rodea las células del tumor que puede siendo después de la resección del tumor o en un nuevo tumor en aumento. Por lo tanto, la actividad conjunta de los fibroblastos y las células inmunes activadas por BCG y la acción directa sobre las células tumorales podría reducir el riesgo de recurrencia. La concentración de BCG utilizada en cada instilación en los pacientes, es aproximadamente de 10
7 UFC /ml (volumen total 50 ml). No sabemos la dosis exacta que reciben el estroma, sin embargo, en nuestros experimentos usamos 3 × 10
6 UFC /ml, que es la mejor dosis que induce la proliferaton de fibroblastos in vitro, siendo un orden inferior a la utilizada en la instilación de paciente. Por lo tanto, se especula que las cantidades de BCG que empleamos in vitro son casi fisiológica.
Se sabe que los estímulos bacterianos son capaces de inducir la producción de NO en los MAC [27]. Aquí demostramos que después del tratamiento con BCG, RAW 264.7 y MAC-T fueron capaces de aumentar los niveles de NO in vitro e in vivo, respectivamente, y CM a partir de RAW 264.7 tratadas in vitro con la proliferación de fibroblastos inducida por BCG y el aumento de la expresión de colágeno I. Debido a la participación de NO en diversos aspectos de los procesos fisiológicos y patológicos, inhibidores de la NOS han ganado importancia en los mecanismos implicados en la cicatrización de heridas, la angiogénesis y la respuesta inflamatoria a las citoquinas [28], [29], [30]. Desde CM de MAC-T-BCG-L-NAME inducida por la tasa de proliferación de fibroblastos más alto, podríamos especular que en esta población de células, la inhibición de NO induce la liberación de algunos factores solubles, capaces de aumentar la proliferación de fibroblastos y la activación. Además, no se puede descartar que la inhibición de NO puede también modificar el patrón de secreción de estos factores solubles. Hasta donde sabemos, no existen informes que muestran la interacción entre el MAC y fibroblastos en el cáncer de vejiga. Sin embargo, en concordancia con nuestros resultados, usando un modelo de tuberculosis pulmonar, se ha descrito una mayor proliferación de fibroblastos pulmonar por CM de los macrófagos alveolares estimulados con BCG [31]. Al mismo tiempo, se observó concordancia entre el efecto del tratamiento in vivo de tumos de la vejiga y el ensayo in vitro. Una expresión marcada de las fibras de colágeno y alfa-SMA se observó en los tumores tratados con BCG, L-NAME y BCG más L-NAME, siendo el efecto más pronunciado con el tratamiento combinado.
El papel de NO en dérmica la proliferación de fibroblastos se ha descrito previamente por Chen et al [32], que sugiere que la inhibición de la proliferación de fibroblastos dérmicos por la luz UV, podría estar relacionado con la sobre regulación de la expresión génica de iNOS y por lo tanto a NO sobre-secreción En acuerdo con estos resultados , podemos sugerir que la producción de NO es un regulador negativo de la proliferación de fibroblastos y la activación cuando BCG se utiliza en el tratamiento del cáncer de vejiga.
los tumores y heridas comparten algunos componentes, tales como el contexto inflamatoria [22]. Sin embargo, mientras que en las heridas inflamación es transitoria, en los tumores de este proceso se perpetúa en el tiempo, por lo que esta reversión, un objetivo para el control de crecimiento del tumor. En 1986, Dvorak postula el concepto de "tumores son heridas que no se curan" y la hipótesis de que la composición de la estroma tumoral se asemeja a la de tejido de granulación de la cicatrización de heridas de la piel, lo que sugiere que los tumores epiteliales promueven la formación de su estroma mediante la activación de la herida respuesta del huésped [22], [33] de curación. Sobre la base de esta hipótesis, hemos generado un ensayo de herida en la piel dorsal, para evaluar la función de los macrófagos en diferentes tratamientos en un modelo en el que los fibroblastos tienen una función clave. Se evaluó la capacidad de los MAC-T-BCG para ayudar en la curación de heridas. Hemos observado que exógenos MAC-T acelera el proceso de curación, sino por el contrario MAC-T-BCG disminución de la tasa de curación en comparación con los MAC-T. Sin embargo, en presencia de un inhibidor de NO, el cierre de la herida se aceleró, lo que sugiere que el NO liberado por los MAC-T-BCG retrasa el proceso de curación. Para evaluar el papel del NO endógeno del huésped, L-NAME se administró oralmente a ratones portadores de cuerda, el cierre de la herida fue significativamente más rápido cuando los MAC-T-BCG se colocaron en las heridas. En resumen, nuestros resultados sugieren que, además de la NO Con autorización sobre la herida por MAC-T-BCG, otras células productoras de NO en ratones portadores de heridas juegan un papel negativo en el proceso de curación. La información relacionada con la actividad de NO en la reparación de heridas es controvertido. Algunos autores han demostrado que el NO induce un proceso angiogénico necesaria para una buena curación [29], [34], mientras que otros han demostrado que la apoptosis inducida por el NO es capaz de inhibir la cicatrización de la herida [30]. Sobre la base de nuestros resultados, podemos especular que el NO generado por MAC-T-BCG o por las células cancerosas restantes puede retrasar la reorganización del tejido durante la inmunoterapia con BCG.
funciones divergentes de los factores de crecimiento, tales como también se han reportado FGF-2 o TGF-beta, en la cicatrización de heridas y el cáncer.