Extracto
PTEN, un fosfoinositida-3-fosfatasa, sirve un doble papel como un supresor de tumores y el regulador de anabólicos celular /metabolismo catabólico. Adaptación de un tiol de cisteinilo sensible a redox en PTEN para la transducción de señal por el peróxido de hidrógeno puede haber superpuesto una vulnerabilidad a otros mediadores del estrés oxidativo y la inflamación, especialmente las especies de carbonilo reactivos, que se están produciendo comúnmente subproductos de la peroxidación del ácido araquidónico. Usando MCF7 y células HEK-293, nos informan de que varios aldehídos y cetonas reactivas, por ejemplo, α electrófilo, ß-enals (acroleína, 4-hidroxi-2-nonenal) y α, ß-enonas (prostaglandina A
2, Δ12-prostaglandina J
2 y 15-desoxi-Δ-12,14- prostaglandina J
2) covalentemente modificar y inactivar PTEN celular, con la consiguiente activación de PKB /Akt quinasa; fosforilación de sustratos Akt; aumento de la proliferación celular; y el aumento de la señalización de β-catenina nuclear. La alquilación de PTEN por α, β-enals /enones y la interferencia con la restricción de la PKB celular /Akt puede acentuar hiperplásico y trastornos neoplásicos asociados con la inflamación crónica, estrés oxidativo, envejecimiento o
Visto:. Covey TM, Edes K, Coombs GS, Virshup DM, Fitzpatrick FA (2010) la alquilación del supresor de tumores PTEN Activa Akt y β-catenina: Un mecanismo de enlace inflamación y estrés oxidativo con el cáncer. PLoS ONE 5 (10): e13545. doi: 10.1371 /journal.pone.0013545
Editor: Marcelo G. Bonini, Universidad de Illinois en Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 8 de Julio, 2010; Aceptado: 30 Agosto 2010; Publicado: 21 Octubre 2010
Derechos de Autor © 2010 Covey et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud de Investigación de Proyectos de subvención R01 IA 26730 (Frank A. Fitzpatrick), Investigación de Proyectos del Programa PO1 CA73992 Proyecto 4 (David M. Virshup) y el Proyecto 5 (Frank A. Fitzpatrick), y de la Pequeña subvención del programa R03 MH082387 -01 (Gary S. Coombs, David M. Virshup y Frank A. Fitzpatrick). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La inflamación y el cáncer están estrechamente vinculados [1], [2]. inflamación 'Smoldering' [3], también llamado para-inflamación [4], se produce en muchos tipos de tumores pre-malignos y malignos, por ejemplo adenoma colorrectal y adenocarcinoma en el que el contenido de leucocitos inflamatorios y la enzima inflamatoria de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) influencia la progresión, el pronóstico y la supervivencia [5], [6]. No esteroides antiinflamatorios (AINE) que inhiben la COX-2 puede evitar cierta, pero no todos, los cánceres [7]; y algunos AINE, como el sulindac sulfona, actúan de forma independiente de la COX y la prostaglandina E
2 (PGE
2) la inhibición [8]. Otros AINEs, por ejemplo, celecoxib, paradójicamente puede mejorar la progresión tumoral en APC
Min /+ ratones, qué modelo de tumorigénesis intestinal [9]. Mientras que la COX-2 y su metabolito PGE
2 son sin duda importantes, para-inflamación puede mejorar la tumorigénesis por mecanismos que no están totalmente aclarados. mecanismos de inmunidad innata son los principales candidatos para la investigación.
Por lo general, la inflamación inmune innato consiste en una fase de "herida" para aniquilar a los patógenos, y una fase de "curación" para reparar y regenerar el tejido dañado de acogida [10]. La transición entre las fases depende de agotamiento gradual de mediadores inflamatorios y la conversión de ciertos mediadores pro-inflamatorios, por ejemplo, PGD
2, en metabolitos antiinflamatorios, Δ12-PGJ
2 [11], [12], [13]. Los elementos del sitio inflamado en sí, por ejemplo, especies reactivas de oxígeno (ROS), albúmina, fibroblastos y neutrófilos, orquestan esta conversión [14], [15], [16], [17]. Por ejemplo, especies reactivas de oxígeno (ROS) provocan la peroxidación no enzimática de los ácidos grasos esenciales, como el ácido araquidónico (AA) [18]. hidroperóxidos AA transforman fácilmente en productos reactivos que contiene un α, β-insaturados carbonilo [19], [20] que incluyen acroleína (2-propenal) [21], [22], 4-hidroxi-2-nonenal (4-HNE) [23], y las prostaglandinas ciclopentenona (cyPGs), PGA
2 y Δ12-PGJ
2 [24]. modificación covalente de proteínas NFkB y IKK /ß por estos metabolitos alpha, ß-insaturados de carbonilo (es decir, la proteína de alquilación) parece ser un "interruptor" para terminar la inflamación [25]. Siguiendo este precedente, la hipótesis de que la alquilación también puede actuar como un "interruptor" para iniciar la reparación y regeneración del tejido dañado por la inflamación.
PTEN (fosfatasa tensina homólogo en el cromosoma 10) es un fosfoinositida-3-fosfatasa con dos funciones fisiológicas: supresores de tumores y regulador de la señalización celular anabólico /catabólico. El
PTEN
gen es frecuentemente mutado o inactivado en cánceres avanzados [26]. Usando MCF7 y células HEK-293, nos informan de que α reactiva, carbonilos ß-insaturados (acroleína, 4-HNE, y Δ12-PGJ
2) inactivar la proteína PTEN - no el gen - por alquilación. La inactivación de PTEN por alfa, carbonilos ß-insaturados provoca un aumento de la señalización Akt, la señalización mejorada β-catenina nuclear y la proliferación celular aumentada. La señalización redox por PTEN puede haber evolucionado para permitir a las células (tejidos) para estratificar su respuesta al estrés oxidativo. Por ejemplo, la inhibición transitoria de PTEN por el oxígeno reactivo o las especies de carbonilo, y la correspondiente señalización a través de Akt /GSK3 /β-catenina /TCF4 /Lef1 podría beneficiar al host a través de aumento de la proliferación y regeneración de tejido dañado por la inflamación aguda o estrés oxidativo. Errant y persistente inactivación PTEN por el mismo mecanismo molecular podría favorecer la progresión del tumor y proporcionar un vínculo etiológico entre la inflamación 'latente' y ciertos tipos de cáncer, especialmente el cáncer colorrectal, donde tanto el PTEN y la APC supresores de tumores restringen la señalización de β-catenina nuclear [27] .
resultados
El α, ß-insaturado carbonilos acroleína, 4-HNE y Δ12-PGJ
2 covalentemente Modificar celular PTEN
expusieron células MCF-7 a α representante, carbonilo ß-insaturados (Figura 1C) o H
2O
2, a continuación, etiquetado selectivamente cualquier proteína que se había oxidado o tioles carboniladas usando NEM-biotina (Figura 1A). A continuación, secuestrado proteínas con un epítopo de la biotina sobre perlas neutravidin (NA) e identificado carbonilatados PTEN mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia. células MCF-7 tratadas con 10 mM Δ12-PGJ
2, 4-HNE, o acroleína contenida carbonila PTEN en cantidades comparables a las células tratadas con 100 mM H
2O
2 (Figura 1A, NA pulldown) . Este método no distingue entre tioles oxidados y carbonilatados en PTEN. Sin embargo, la electroforesis en condiciones no reductoras, seguido de Western Blot, mostró que PTEN migró como una isoforma discreta debido a un disulfuro oxidado [28], [29], que sólo se produjo en las células tratadas con 100 mM H
2O
2, pero no en las células tratadas con α, carbonilo ß-insaturado (Δ12-PGJ
2, 4-HNE, acroleína) o 15-HPETE, un hidroperóxido de lípidos (Figura 1B).
(a) Diagrama del procedimiento para identificar PTEN con un tiol oxidado o alquilado en las células expuestas a ROS o α, carbonilos ß-insaturados. La inmunotransferencia anti-PTEN muestra oxida o carbonila PTEN (NA Pulldown) con respecto al total de PTEN (Cell lisado) aislado a partir de células MCF-7 tratadas 30 min con vehículo (DMSO), 10 mM Δ12-PGJ
2 o 4-HNE frente a 10 min con 100 M H
2O
2; una inmunotransferencia de un experimento separado muestra oxidado, carbonila y PTEN total de en las células tratadas durante 30 minutos con vehículo o 20 mM acroleína frente a 10 min con 100 mM H
2O
2. (B) Anti-PTEN inmunotransferencia de lisados de células MCF-7 fraccionadas por SDS-PAGE en condiciones no reductoras. PTEN oxidado a un Cys
124-Cys
71 disulfuro aparece como una especie migran más rápido (PTEN disulfuro oxidado) solamente en las células tratadas con H
2O
2. Esta especie fue indetectable en MCF-7cells tratada 30 minutos con vehículo DMSO o 20 mM cada una Δ12-PGJ
2, 4-HNE, acroleína o 15-HPETE. estructuras (C) Química de α típica, carbonilos ß-insaturados. La acroleína y 4-HNE son enals, ß; Δ12PGJ
2 es un α, β enona. ß carbonos electrofílicos se denotan con δ
+. Las transferencias son representativos de los resultados obtenidos en al menos tres experimentos independientes.
análogos Cyclopenteneone PG-biotina son modelo a, ß-enones que alquilato PTEN
El tiolato cisteinil activa en el PTEN sitio (-HC (X
5) RT-) es propenso a la oxidación, ya que es un nucleófilo fuerte, pKa ~ 5. Este rasgo también debería facilitar la alquilación de PTEN por α, ß-insaturados carbonilos. Utilizamos análogos CyPG-biotina, que tienen una β-carbono electrófilo capaz de adición nucleofílica (reacción de Michael), como modelos químicos para poner a prueba esta hipótesis [30]. La alquilación de cualquier proteínas celulares por estos análogos introduciría un epítopo biotina
de novo
(Figura 2A). PGA
1-biotina y Δ12 PGJ
2-biotina, ambas fueron tomadas arriba en células MCF-7 y formó aductos covalentes con ~ 20 proteínas (Figura 2B). Δ12 PGJ
2-biotina (una dienona bi-funcional) era más reactivo que el PGA
1-biotina (enona mono-funcional), de acuerdo con otras personas que reportaron ~20-30 dianas de proteínas modificadas por cyPG-biotina en células 3T3 o mitocondria [31], [32]. El secuestro de
de novo
proteínas celulares biotinilados en bolas de NA, seguido de inmunotransferencia con anticuerpos anti-PTEN, PTEN mostraron que forma un aducto covalente ~ 10 veces más fácilmente con Δ12-PGJ
2-biotina de con PGA
1biotin (Figura 2C, calle 4 vs carril 3).
(a) reacción de adición de Michael entre PTEN y una Δ12-PGJ analógica
2-biotina. Después del tratamiento de las células con cyPG-biotina, las proteínas con un
de novo
biotina epítopo fueron secuestrados en perlas neutravidina (NA) Pulldown, a continuación, se fraccionó por SDS-PAGE para inmunotransferencia. inmunotransferencia (B) Anti-biotina de las proteínas a partir de lisados de células MCF-7 tratadas con DMSO (carril 1), 10 mM PGA
1-biotina (carril 2), y 10 mM Δ12PGJ
2-biotina (carril 3). Δ12-PGJ
2 biotina formó un aducto covalente con las proteínas más fácilmente que el PGA
1-biotina (puntas de flecha). (C) inmunotransferencia Anti-PTEN de PTEN celular que forma un aducto covalente con cyPG-biotina (NA Pulldown) con respecto al total de PTEN (Cell lisado) a partir de células MCF-7 tratadas con DMSO (carril 1), 1 o 10 micras PGA
1-biotina (carriles 2, 3), y 1 o 10 mM PGJ
2-biotina (carriles 4, 5). Las transferencias son representativos de los resultados obtenidos en al menos tres experimentos independientes.
El α, ß-enona, Δ12-PGJ
2, PTEN interfiere con la supresión de la quinasa Akt
los factores de crecimiento, insulina y otros estímulos símbolo PI3-K para hacer PIP
3, que recluta PKB /Akt quinasa a la membrana celular donde PDK1 /2 fosforila Akt Thr
308 y Akt Ser
473 residuos, respectivamente [33], [34], [35]. PTEN regula a la baja la activación de PKB /Akt partir del metabolismo de PIP
3 a PIP
2 [36]. α, ß-insaturado carbonilos que alquilato PTEN celulares pueden interferir con su supresión de Akt quinasa. Un representante α, ß-enona, Δ12-PGJ
2, causaron un aumento dependiente de la concentración y el tiempo de fosfo (T
308) Akt en células MCF-7. Tan poco como ~ 2 M Δ12-PGJ
2 causó una mitad de la máxima respuesta (Figura 3A). Los aumentos en fosfo- celular (T
308) Akt fueron detectables en 10 min, máximo a 30 min, y duradero para & gt; 120 min (Figura 3B). Δ12-PGJ
2 aumento de la formación de fosfo- (T
308) Akt, sin alterar la formación de fosfo- (S
241) PDK1 (la quinasa que fosforila T
308 de Akt), y sin alteración de la expresión de proteína PTEN (Figura 3C). Estos datos sugieren que Δ12-PGJ
2 interfería con la capacidad de PTEN para restringir la activación de Akt quinasa. En consonancia con esta interpretación, co-tratamiento de las células con cyPGs plus 50 M LY294002, disminución de los niveles de fosfo (T
308) Akt mediante la inhibición de PI3-K, en el vértice de la PI3-K /→ PDK1 /2 → Akt cascada de quinasa (Figura 3C, carriles 3 vs 2 y 6 vs 5). Por otra parte, 1 mM de diversos PGA y PGJ isómeros, y otra α, ß-enones aislado enzima PTEN inhibe directamente [Tabla 1]. El carbono β electrofílico del cyPGs es esencial para la inhibición, ya que un cyPG estructuralmente similares, pero no electrofílico, PGB
1, estuvo inactivo.
(A) inmunotransferencias de fosfo (T
308 ) en relación con Akt Akt total en los lisados de células MCF-7 tratadas 30 minutos con 0-20 M Δ12-PGJ
2. El gráfico de barras que muestra el aumento de fosfo (T
308) Akt /Akt total (media ± E.E.M) a partir de experimentos separados n≥3. (B) inmunotransferencia de fosfo (T
308) en relación con Akt Akt total en los lisados de las células MCF-7 se trató con 20 mM Δ12-PGJ
2 para 0-120 min. El gráfico de barras que muestra el aumento de fosfo (T
308) Akt /Akt total (media ± E.E.M) a partir de n = 4 experimentos independientes. (C) Las inmunotransferencias de Akt total, fosfo (T
308) Akt, PTEN, fosfo (S
241) PDK1 a partir de lisados de células MCF-7 tratadas 30 minutos con 20 mM Δ12-PGJ
2 (carril 2, 3) y 20 mM PGA
1 (carril 5, 6) en presencia del inhibidor de PI3-K 50 mM Ly294002 (carril 3, 6) o vehículo DMSO (carril 2, 5). (D) inmunotransferencia de fosfo (T
308) en relación con Akt Akt total en los lisados de las células MCF-7 tratadas con vehículo 4 horas, las ciclopentenonas - PGJ
2, Δ12-PGJ
2, y 15-desoxi-Δ12-PGJ
2, o su precursor PGD
2. Para (C) y (D), manchas son representativos de los resultados obtenidos en tres experimentos independientes.
experimentos estructura-actividad mostraron que varios cyPGs J-series, incluyendo PGJ
2 , Δ12 PGJ
2 y Δ12 15-desoxi-14-PGJ
2, el aumento de fosfo (T
308) Akt en células MCF-7, en comparación con el vehículo o su precursor PGD
2 (Figura 3D). PGA
1 tuvo un efecto modesto sobre la fosforilación de Akt celular (Figura 3C, carril 5), que corresponde con su modificación covalente más débil de PTEN celular (Figura 2C, carril 3).
fosfo Activado (T
308 /S
473) Akt quinasa puede fosforilar diferentes sustratos proteicos que regulan la proliferación celular y el destino [35]. La fosforilación de sustratos Akt con un epítopo RxRxx-fosfo-S /T, coincidió con el aumento de fosfo- (T
308) Akt en células MCF-7 tratadas con 10 mM Δ12-PGJ
2 (Figura 4A). activación de la quinasa Akt también coincidió con la proliferación de Akt-dependiente en células MCF-7 tratadas con 1-10 M Δ12-PGJ
2 (Figura 4B). Este hallazgo es consistente con reportados acciones bi-fásicos de cyPGs, con lo que aumentan la proliferación de células cultivadas en ~ 1 mM [37], [38], mientras que disminuyen la proliferación o causan apoptosis mediante la modificación de otras dianas proteicas en ~ 50 M [39 ].
(A) inmunotransferencias de fosfo (T
308) Akt, Akt total, y varios fosfoproteínas con (K /R) -x- (K /R) -xx- (S /T), un motivo reconocido y fosforilada por fosfo activa (T
308) Akt, en lisados de las células MCF-7 tratadas 0 y 10 mM Δ12-PGJ
2. (B) la proliferación relativa de las células MCF-7 (media ± sem, n = 4) se trató con 0, 1, y 10 mM Δ12-PGJ
2 solo (▪), o en presencia de 10 mM de inhibidor IV (▪), un inhibidor de la quinasa Akt. (C) Las inmunotransferencias de fosfo (S
473) Akt, Akt total, fosfo (S
9) GSK3, el total de GSK3; y β-catenina y la tubulina en los lisados de células HEK 293 después del tratamiento de 0,1, 3, 6 y 16 horas con 6 M Δ12PGJ
2, 6 M 4-HNE o 20 mM acroleína. Para (A) y (C), manchas son representativos de los resultados obtenidos en tres experimentos independientes.
α, ß-insaturado carbonilos causan una acumulación dependiente del tiempo de fosfo celular (S
473) quinasa Akt (activo) → fosfo (S
9) GSK3 (inactivo) → β-catenina y un aumento de la β-catenina nuclear de señalización
GSK3 β-catenina convierte a fosfolípidos (S
33/37 /T
41) β-catenina, que se elimina rápidamente por el proteasoma 26S [40]. GSK3 actúa en concierto con la APC supresor de tumores. En las células con mutante APC, o cuando ligandos Wnt estimulan las células con APC de tipo salvaje, GSK3 no fosforilar β-catenina, que permite que se acumule, asociado con otros factores de transcripción nuclear y expresar sus genes diana (por ejemplo,
c-myc
,
ciclina D1
) [41]. PTEN puede bloquear la acumulación de β-catenina /señalización al favorecer la retención de GSK3 activa e inactiva PKB /Akt quinasa de alguna [42], [43], pero no todos los sistemas experimentales [44], [45]. En consecuencia, PTEN inactivada debe aumentar la señalización de β-catenina, favoreciendo la retención de fosfo inactiva (S
9) GSK3 y fosfo activa (S
473) Akt quinasa. por tanto, la hipótesis de que estos mediadores electrófilos pueden afectar ß-catenina señalización a través de este mecanismo. Para investigar más a fondo, se utilizaron células HEK 293 que tienen una vía de señalización beta-catenina intacta. Se encontró que las a diferentes carbonilos, ß-insaturado que alquiló PTEN (6 M Δ12 PGJ
2, 6 M 4-HNE y 20 mM acroleína) toda causó un aumento dependiente del tiempo en fosfo (S
473 ) Akt (es decir, activa la quinasa Akt), con un correspondiente aumento de la fosfo (S
9) GSK3 (es decir, inactiva GSK3) y β-catenina (Figura 4C). Para determinar si alfa, beta-insaturados carbonilos mejoradas de señalización β-catenina nuclear, se utilizó HEK 293 células por ingeniería genética para expresar de forma estable y Wnt3a SuperTopFlash (STF) reportero de genes [46]. Estas células, llamadas células STF3A, así Wnt3a secreto, un /estímulo paracrino autocrino para receptores FZD que retarda la degradación de APC-dependiente de β-catenina (Figura 5A). señalización nuclear β-catenina en células STF3A es proporcional a su expresión de la luciferasa (actividad), y son sensibles a DKK1, un antagonista de WNT que inhibe la señalización de β-catenina en células STF3A de una manera dependiente de la concentración (Figura 5B).
células STF3A (a) albergan un transgén integrado de forma estable que expresa Wnt3a (). Cuando secretada, Wnt3a provoca la estimulación autocrina /paracrina de los receptores fzl () que inhibe la rotación APC dependiente de β-catenina (). Si β-catenina no es fosforilado por GSK3, puede acumularse como una β-catenina: LEF dímero () y se unen a promotores de β-catenina integrado de forma estable: luciferasa gen reportero (SuperTop Flash) (). La actividad de luciferasa en los lisados de células es proporcional a la señalización de β-catenina nuclear. (B) nuclear β-catenina de señalización (luminiscencia de la luciferasa) en células STF3A (2 × 10
4 células /pocillo) cultivadas durante 24 horas en medio que contiene 0, 10, o 30 ng /ml de DKK1 (media + SD, n = 3). DKK1, un antagonista de Wnt, la señalización de β-catenina inhibe (C) Nuclear señalización β-catenina en células STF3A (2 × 10
4 células /pocillo) crecido durante 24 horas en medio que contiene 20 mM de cyPGs; α, β-enals o PG primarias. Varios electrófilos reactivos mejorados de señalización β-catenina por ~2-4 veces. Histograma representa la media ± SEM, n = 4.
Varios metabolitos carbonilo Reative, cada uno con un electrófilo α, β o el sustituyente enona enal, una mayor expresión de la β-catenina: gen reportero de la luciferasa en STF3A las células (Figura 5C). actividad de informador de luciferasa aumentó en ~ 4 veces sobre la línea base (p & lt; 0,01) en las células incubadas con STF3A Δ12 PGJ
2 o 4-HNE; por ~ 3 veces (p & lt; 0,01) en las células con otra PGJ análogos, acroleína o 4-ONE; y por ~ 1,5 veces (p & lt; 0,05) en las células con PGA
2. De acuerdo con nuestra hipótesis mecanicista, ni PGB
2 ni MDA tuvieron un efecto detectable. PGB
2 es un cyPG, pero tautomería impide la carga de-localización necesaria para crear un carbono β electrófilo, que se requiere para la alquilación de proteínas. MDA (β-hidroxi-acroleína) penetra las membranas celulares mal, ya que es & gt; 99% ionizados a pH ~7.4 fisiológica utilizada en nuestros experimentos. Ni PGE
2 ni otros metabolitos PG primarias de la COX-1 o -2 tenido ningún efecto sobre la señalización de β-catenina nuclear en las células STF3A. Llamamos la atención sobre el hecho de que se requería ectópico sobreexpresión de receptores EP en células HEK 293 para obtener cualquier PGE
2 de señalización mediada por β-catenina [47]. La débil respuesta a la PGE
2 y otra de PG en la figura 5C puede reflejar los niveles constitutivos de EP, FP, DP o receptores IP en células STF3A o rápido metabolismo de las PGs, o ambos
.
β- mejorada catenina de señalización en las células STF3A era dependiente de la concentración entre 2-20 mM de acroleína, 4-HNE y Δ12 PGJ
2 (Figura 6A). El agotamiento de GSH celular a ~ 10% de la línea de base por tratamiento con 100 mM de señalización BSO potenció β-catenina, por ejemplo, en las células tratadas con STF3A 2 y 6 M Δ12 PGJ
2 (Figura 6B). Esto es consistente con el papel del glutatión reducido en la conjugación de metabolitos reactivos, y la protección de las proteínas sensibles redox de la alquilación [20].
(A) Nuclear β-catenina de señalización (luminiscencia de la luciferasa) en células STF3A ( 2 × 10
4 células /pocillo) cultivadas durante 24 horas en medio que contiene 0, 2, 6 y 20 mM de cada uno de acroleína (□), Δ12 PGJ
2 (▪) y 4-HNE (▪). (B) de señalización nuclear β-catenina en células STF3A (2 × 10
4 células /pocillo) crecido durante 24 horas en medio que contiene 0, 2 o 6 M de Δ12 PGJ
2 solo (▪) o Δ12 PGJ
2 más 100 M BSO. los niveles de GSH se redujeron en 79% y 88% a los 6 y 24 horas después de tratamiento de las células con BSO; 92-95% de las células eran todavía viables a las 24 hrs. Las barras representan la media ± SEM de experimentos separados n≥3.
Discusión
El
PTEN
gen supresor de tumores está mutado o inactivado en cánceres avanzados con frecuencia [26 ], [48]. PTEN es un phosphoinositide-3-fosfatasa que metaboliza PIP
3 a PIP
2 [36], PKB de ese modo contra-regulación /Akt, una serina /treonina quinasa proto-oncogén que controla el crecimiento anabólico y la especificación del destino celular [33], [34], [35]. PTEN, en sí, es regulada después de la traducción por la fosforilación [49], la acetilación [50], y la oxidación reversible de la cisteína catalítica
124 residuos [28], [29]. La oxidación de PTEN celular puede implicar H
2O
2 derivado de NADPH oxidasa [51], superóxido dismutasa [52], o la peroxidación enzimática del ácido araquidónico (AA) por la COX-1, COX-2 o 5-LOX [53]. Todas estas enzimas son comúnmente sobre-expresó y activada por la inflamación o la transformación neoplásica. PTEN oxidación, y cualquier fisiopatología asistente, varía con el grado de exposición celular a las especies reactivas de oxígeno (ROS). En estos estudios, se demuestra que la química que facilita la oxidación de PTEN también puede facilitar su alquilación por α electrofílico, ß-enals y α, ß-enones [19], [20].
PTEN personifica la adaptación de tioles redox sensible para la señalización de células, así como su potencial vulnerabilidad a los subproductos de estrés oxidativo y la inflamación. PTEN es inactivada por dos procesos redox mediada distintivas: 1) la formación intra o inter-moleculares disulfuro por ROS y 2) carbonilación tiolato (adición de Michael) por α electrofílico, carbonilos ß-insaturados (Figura 1-3). El peróxido de hidrógeno (H
2O
2), un ROS prototípico, inhibe PTEN celular por oxidación directamente su catalítica Cys
124 a un ácido sulfónico intermedio, que forma entonces una forma inactiva, Cys intra-molecular
124-71 disulfuro [28], [29]. Nuestros datos muestran que varios representativa, las especies de carbonilo electrófilos (α, ß-enals y α, ß-enonas), que pueden ocurrir de forma endógena como subproductos de la peroxidación de lípidos durante la inflamación o estrés oxidativo, alquilato e inactivar PTEN. La inactivación de PTEN por procesos redox mediada causa un aumento en la actividad de la Akt proto-oncogén. Hiperactivación de Akt aumenta la proliferación y la supervivencia de muchos tipos de cáncer diferentes.
Señales mediante H
2O
2, abarca una amplia serie continua fisiopatológico [54] y un papel comparable para electrófilos reactivos parece plausible. especies carbonilo reactivos tales como acroleína, 4-HNE y Δ12PGJ
2 representan un sub-conjunto de electrófilos comúnmente producidos durante el estrés oxidativo y la inflamación. Estos hallazgos podrían extrapolar a los agentes electrófilos que carecen de un carbonilo, pero que contienen otros grupos aceptores de electrones, y nos referimos a ellos como "generalmente electrófilos reactivos". En primer lugar, al igual que H
2O
2, se produce reactivos electrófilos
in vivo
durante la inflamación y el estrés oxidativo [16], [18], [19], [22]. En segundo lugar, los electrófilos reactivos modulan de forma covalente otras proteínas que regulan los procesos de señalización importantes; es decir, LKB1 /STK11 [55], NFkB [56], y IKKβ. En tercer lugar, H
2O
2 y reactivos electrófilos tanto se originan de una combinación de procesos espontáneos y enzimáticos, que a menudo coinciden en los tejidos inflamados [57]. H
2O
2 se deriva de anión superóxido, O
2
-, el metabolito principal de NADPH oxidasas. dismutación espontánea y enzimática convierte O
2
- en H
2O
2. Del mismo modo, la peroxidación de lípidos espontánea y enzimática genera acroleína y 4-HNE [18], [57]. cyPGs se originan en el endoperóxido PGH lípidos
2, el metabolito principal de la COX-1 y -2. Enzimática y la escisión espontánea de bonos endoperóxido convierte PGH
2 en PGE
2 y PGD
2; albúmina /suero provoca entonces su deshidratación en PGA
2, PGJ
2, y sus isómeros [14], [16], [24].
Aunque especulativo, parece que ROS y reactiva electrófilos (H
2O
2, acroleína, 4-HNE, Δ12 PGJ
2) pueden tener tanto evolucionado para desempeñar papeles dispares en la inmunidad innata: patógenos 1) aniquiladores y 2) la inflamación resolver. Análoga a la inactivación de NFkB y IKKαβ, la inactivación temporal de la proteína supresora de tumores PTEN por su alquilación, y la activación concomitante de PKB /Akt quinasa proto-oncogenes, podrían ayudar a normalizar la morfología y la histología en los tejidos con inflamación aguda mediante la liberación de su restricción de la proliferación celular, crecimiento anabólico y la especificación del destino [34], [35]. En situaciones ordinarias de reparación y resolución debería ayudar a poner fin a la inflamación inmune innato (Figura 7,). Sin embargo, este mecanismo podría también conferir riesgos ineludibles si PTEN se inactivaron equivocadamente o persistente. Por otra parte, los electrófilos reactivos también inactivan otros supresores de tumor notables, incluyendo p53 [30] y LKB1 /STK11 [55]. Esta inactivación combinada y sostenida de los supresores de tumores podría contribuir significativamente a la tumorigénesis asociado con la inflamación y posteriormente prolongar el ciclo de para-inflamación asociado a un tumor (Figura 7,). En general, nuestros datos y el modelo se alinean con la observación de que los tumores son heridas que no cicatrizan [58]. En esta situación, la progresión del tumor puede derivar en parte de una mala adaptación de un mecanismo molecular que evolucionó para terminar y resolver la inflamación inmune innato.
La inflamación es un componente crítico de la progresión del tumor. Muchos cánceres surgen de sitios de infección, irritación crónica e inflamación. El microentorno del tumor, que se compone en gran parte de las células inflamatorias, juega un papel importante en el proceso neoplásico, el fomento de la proliferación, supervivencia y migración. Mostramos aquí que las especies carbonilo reactivos que se producen habitualmente durante la inflamación covalentemente modifican e inactivan supresor de tumores PTEN. Es importante destacar que, el mecanismo se describe también podría extrapolar a: 1) otras especies electrófilos generados por la inflamación, el estrés oxidativo o xenobiótico (es decir, otra α, aldehídos y cetonas insaturados ß; epóxidos alílicos o vinílicos; quinonas, chlorhydrins, cloraminas, sulfonas de vinilo; y 2) otros miembros de la superfamilia de PTP que son redox sensible. Estos estudios se extienden nuestra comprensión de los mecanismos por los que la inflamación contribuye a la iniciación y progresión del cáncer.
Materiales y Métodos
Materiales
Se utilizó un medio esencial mínimo (MEM) , suplementos, insulina bovina, gentamicina, células humanas de riñón embrionario HEK-293, y las células HEK-293 que contienen el virus Epstein Barr nuclear antígeno 1 gen (HEK-EBNA1) (Invitrogen; Carlsbad, CA); Células MCF-7 (HTB-22, American Type Culture Collection, Manassas, VA); PGs, análogos cyPG-biotina, y kits de ensayo de proliferación WST (# 10008883) (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI); Completa mezcla de inhibidor de la proteasa ™ (Roche Molecular bioquímicos, Indianapolis, IN); tampón de lisis 0,6% de Igepal CA-630 en PBS (Promega; Madison, WI); Neutravidina perlas conjugadas, NEM-biotina de cabra y anticuerpos policlonales anti-biotina (# 31852) (Pierce Chemical; Rockford, IL); un inhibidor de PI3-K, LY294002 (# 9901), anticuerpos policlonales contra PTEN (# 9552), Akt (# 9271), fosfo (Thr
308) Akt (# 9375), fosfo (S
473 ) Akt (# 9271), fosfo (S
9) GSK3 (# 9336), GSK-3β (# 9332), fosfo (Ser
33/37 /Thr
41) β catenina (#9561S) K /RxK /RxxS /T (PO
4) epítopos (# 9614) y fosfo (S
241) PDK1 (# 3061) (Tecnologías de señalización Celular, Danvers, MA); β-catenina (# C19220) (Laboratorios de transducción BD; Franklin Lakes, NJ); HRP (peroxidasa de rábano picante) conjugado con anticuerpos secundarios (de Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); difluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas y reactivos de quimioluminiscencia Western relámpago ™ (Perkin-Elmer; Waltham, MA); kits de ensayo de la enzima PTEN (# 17-351) (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY); inhibidor de Akt IV (# 124011) (Calbiochem; San Diego, CA); acroleína (# 01680), crotonaldehído (# 262668), L-butionina-sulfoximina (BSO) (B2515), H
2O
2 solución al 30% (H-1009), malondialdehído (Fluka Cat.#63287) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO); DKK-1 (# 1096-DK-010) (R & amp; D Systems; Minneapolis, MN) (Cat.#10101-2). Y luciferina (Biotium Inc., Hayward, CA):
Cultivo celular
MCF-7 de cáncer de mama (ATCC) se cultivaron en MEM con 10% v /v de FBS, 2 mM L-glutamina, 1,5 g /l NaHCO
3, 0,1 mM aminoácidos no esenciales ácidos , piruvato de sodio 1 mM, 0,01 mg /ml de insulina bovina, y 0,01 mg /ml de gentamicina. células HEK-293 (ATCC) se cultivaron en MEM con suero de ternera fetal al 10%, 100 unidades de penicilina /estreptomicina, 2 mM L-glutamina y piruvato 1 mM.
Identificación de PTEN modificado mediante el etiquetado con biotina conjugado con maleimida
células MCF-7 (MEM al 1% v v FBS /) fueron tratados durante 30 minutos con vehículo, o electrófilos reactivos (10 mM Δ12-PGJ
2, 4-HNE, acroleína) o 100 M H
2O
2. se eliminó de medios; las células se congelaron a -80 ° C durante 15 min; transferido al vacío y se incubaron 1 h, 25 ° C con 1 ml de O
2-libre de tampón de extracción (mM NaHPO 50
4, pH 7,0, EDTA 1 mM, mM NEM 10 [N-etil maleimida], 10 mM IAA [ácido yodoacético], 1% de Triton X-100, mM NaF 5, 50 mg /ml de leupeptina y 50 mg /ml de aprotinina). Este tratamiento alquilatos selectivamente todos los tioles reducidos en PTEN, pero no oxida tioles o tioles modificados por adición de Michael con electrófilos reactivos. Las muestras se lavaron en 1 ml de O
-2 libre de tampón de extracción después se transfirió a un tubo cónico de 15 ml. Después de la adición de SDS a una concentración final de 1% v /v, la mezcla se mantuvo 2 horas a 25 ° C en la oscuridad, y las proteínas se precipitaron con TCA [ácido tricloroacético], 10% v /v durante 1 h.