Extracto
señal de anomalías en las células humanas suelen provocar consecuencias inesperadas para la salud individual. Nos centramos en este tipo de eventos implicados en las vías de señal JAK-STAT, especialmente las provocadas por STAT3 aberrante activado, una oncoproteína que participa en los procesos esenciales de la supervivencia celular, el crecimiento y la proliferación de muchos tipos de tumores, así como enfermedades inmunes. Mediante el establecimiento de un sistema de detección de drogas de alto rendimiento basado en la señal de STAT3 en células A549 del cáncer de pulmón humano, hemos analizado una biblioteca de productos naturales que contenían compuestos purificados a partir de hierbas medicinales. Un compuesto, llamado Brevilin A, exhibió tanto una fuerte inhibición de la señal de STAT3 y STAT3 señal de inhibición del crecimiento celular dependiente. Investigaciones adicionales revelaron que Brevilin A no sólo inhibe la señalización STAT3 sino también STAT1 señalización para citoquinas inducidas fosforilación de STAT3 y STAT1, así como la expresión de sus genes diana. Además, encontramos Brevilin A podría atenuar la actividad de JAK bloqueando el dominio quinasa JAK tirosina JH1. Los niveles de citoquina inducida por la fosforilación de STAT y otros sustratos se redujeron drásticamente mediante el tratamiento de Brevilin A. Las funciones de Brevilin A la orientación en JAKs actividad indican que Brevilin A no sólo puede ser utilizado como un inhibidor de la STAT3, pero también un compuesto de bloqueo otra JAK- hiperactivación STAT. Por lo tanto, estos resultados proporcionan un fuerte impulso para el desarrollo de inhibidores selectivos de JAK-STAT y fármacos terapéuticos con el fin de mejorar la supervivencia de los pacientes con JAK hyperactivated y estadísticas
Visto:. Chen X, Y Du, J Nan, Zhang X, Qin X, Wang Y, et al. (2013) Brevilin A, un producto natural Novel, inhibe la actividad de la quinasa Janus y Bloques de señalización STAT3 en células de cáncer. PLoS ONE 8 (5): e63697. doi: 10.1371 /journal.pone.0063697
Editor: Mark Jackson, Case Western Reserve University, Estados Unidos de América
Recibido: 9 de noviembre de 2012; Aceptado: 5 Abril 2013; Publicado: 21 de mayo de 2013
Derechos de Autor © 2013 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de 1104FK CA123 El Proyecto de Apoyo a la Ciencia y Tecnología de Gansu Providencia para QW; 2009DFA30990 del Ministerio de Ciencia y Tecnología de la República Popular de China, 0708WCGA149 del Gansu Provincial de Ciencia y Tecnología y 2009AA01A130 de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China a J.Y. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El esquema de la vía de señalización JAK-STAT se ha terminado hace casi 20 años [1]. a continuación, se continuaron los estudios para más detalles de la señal incluyendo las interacciones de proteínas, post-transcripcional modificaciones, reglamentos y efectos fisiológicos. La familia Janus quinasa (JAK) contiene cuatro miembros de la tirosina quinasa, incluyendo JAK1, JAK2, JAK3 y Tyk2, que transduce señales de citocinas inducida a través de transductores de señal y activadores de transcripción (STAT). Por lo general, JAK asociadas a receptores se activaron a la dimerización del receptor en presencia de citoquinas. Mientras tanto STAT en el citoplasma fueron reclutados para los receptores y fosforilados por JAK. Las tirosina fosforilados STAT forman homo- o heterodímeros a través de interacciones fosfotirosina-SH2, y translocan en el núcleo para iniciar la transcripción de genes específicos [2]. La actividad anormal de señales JAK-STAT ha sido considerado como un enlace a muchas enfermedades, incluyendo cáncer y trastornos del sistema inmune. actividad con aberraciones STATs por lo general se correlaciona con varios tipos de crecimiento del tumor y la progresión de diversos tumores malignos de cáncer, tanto en respuesta a citoquinas y por proteína tirosina quinasas mutantes. De los miembros de la familia de siete STAT (STAT1-STAT6, con dos genes independientes Stat5a codificada y Stat5b), STAT3, así como STAT5 en cierta medida, se activan con mayor frecuencia en un buen montón tumores sólidos humanos y leucemias [3] - [5 ].
En muchos STAT3 activada constitutiva células cancerosas, las células tumorales humanas cultivadas o modelos de ratón generados, bloqueo de la señalización STAT3 inhibirá el crecimiento celular, inducir la apoptosis y reducir la metástasis de las células. En glioma o células de glioblastoma [6], [7], las células de carcinoma de mama [8], los cánceres de colon [9], derivados de células tumores escamosos [10], células de cáncer de próstata [11] - [13] y los melanomas [14], [15], la orientación interrupción de la actividad STAT3 por ARN de interferencia, que expresan formas STAT3 negativo dominante o la aplicación de inhibidores de la señalización específicos sería notablemente hacia abajo regular STAT3 genes inducidos, incluyendo CyclinD1, Bcl-xl, c-Myc, survivina y otros genes regulación de los ciclos celulares y la proliferación celular y, a continuación, a reducir posteriormente el crecimiento celular y aumentar la apoptosis de las células [16], [17]. La metástasis es la causa principal de mal pronóstico y las muertes relacionadas con Caner-en comparación con la génesis de tumores y el crecimiento de la neoplasia. STAT3 ahora se ha considerado como una de las oncoproteínas críticos que median la regulación de la invasión de células y microambiente tumoral. En los cánceres colorrectales humanos, STAT3 se activó en los que recibieron mal pronóstico [18]. Las proteínas implicadas en la migración y la invasión de las células cancerosas, como las metaloproteinasas de matriz (. MMP-1, MMP-2, MMP-10,
etc
) y Twist, estaban regulados por la activación de STAT3 [19] - [21] . Un inducido de señalización /STAT3 IL-6 JAK era esencial para la infiltración de células cancerosas circulantes. Tumor derivado de IL-6 ayuda a carcinoma de mama y melanoma circulantes para restablecer
in situ
o en regiones metástasis a distancia [22]. Recientemente, se ha informado de que STAT3 persistentemente activado mantiene la actividad de NF-kB a través de rutas mediadas p300. la actividad de NF-kB se redujo drásticamente por STAT3 RNAi en muchas células activadas STAT3 constitutivos del cáncer [23], lo que sugiere que los inhibidores de STAT3 también pueden desempeñar papeles potenciales en el bloqueo de la actividad de NF-kB y la mejora de la inhibición del crecimiento de estas células cancerosas.
la exploración de inhibidores de la señal JAK-STAT especialmente los inhibidores de STAT3 por la detección de drogas de alto rendimiento (HTS) es una forma eficiente en el descubrimiento de fármacos potenciales específicos dirigidos en STAT3 o aguas arriba quinasas JAK.
Mi Chau N. Opiniones y colegas desarrollaron una línea celular de cáncer de próstata que contenía un reportero STAT3 construir para el cribado de alto rendimiento de activadores e inhibidores de STAT3 [24]. Aquí se estableció un sistema de cribado de indicador de luciferasa basado señalización STAT3 similar en un A549 línea celular de cáncer de pulmón humano, que muestra la actividad STAT3 se activa constitutiva y podría ser inducido aún más por citoquinas como IL-6, EGF, y HGF [25]. Mediante cribado, Brevilin A, un producto natural novela, mostró una inhibición significativa de señalización JAK-STAT sin toxicidad celular inmediata directa de 1.400 compuestos más que en un principio fueron aisladas de plantas, la mayoría de las cuales fueron conocidas como remedios a base de hierbas. Brevilin A ha preferido inhibición del crecimiento celular de DU145 y MDA-MB-468, estos crecimientos son dependientes de STAT3 señalización [17], [26]. Investigaciones posteriores revelaron que Brevilin Una actividad del dominio quinasa de tirosina cinasa Janus JH1 bloqueado, y luego reduce la fosforilación de efectores aguas abajo. Brevilin A puede actuar como un fármaco potencial de orientación sobre las enfermedades causadas por anormalidades JAK-STAT.
Materiales y Métodos
Los anticuerpos y reactivos
Los anticuerpos contra STAT3, JAK2, pTyr705- STAT3, pTyr701-STAT1, pSer473-AKT, pSer9-GSK-3β, c-Myc, CyclinD1, PARP, pTyr1007 /1008-JAK2, pTyr1054 /1055-TYK2, pSer536-p65 y p65 se obtuvieron de Cell Signaling Technology; Los anticuerpos contra c-Src, pTyr (PY99), GAPDH y His-tag se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology, Inc .; vector pGL4.20 y sustrato de luciferasa Steady Glo se obtuvieron de Promega; M-MLV primera hebra kit de síntesis de ADNc se obtuvieron de Invitrogen, Life Technologies Corporation; perlas PD180970, AG490, estaurosporina, doxorrubicina, ATP y EZView rojo ANTI-FLAG M2 Affinity fueron adquiridos de Sigma-Aldrich; La interleucina-6 (IL-6), interferón α (IFN) y γ interferón (IFN) era de PeproTech. Ni
+ perlas de cromatografía de afinidad se obtuvieron de GE Healthcare Life Sciences. 10 × tampón de quinasa PK se obtuvieron de New England Biolabs (NEB).
Plásmidos y Líneas Celulares
Una secuencia que contiene 16 × SIE plus con una caja TATA se insertó en pGL4.20 entre KpnI y HindIII. La construcción de la SIE-luc-puro se transfectó en la línea celular A549. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se seleccionaron las células con 5 mg /ml de puromicina durante 2 semanas, a continuación, 2,5 g /ml durante 2 semanas. Los clones fueron recogidos y analizados por separado. Las secuencias que codifican dominios JAK1-JH1 humana, dominio JAK2-JH1, dominio JAK3-JH1, dominio Tyk2-JH1 y c-Src se clonaron en plv-SV40-puro vector de expresión lentivirus separado. secuencias adicionales de la bandera de su doble-etiquetas fueron fusionadas en el extremo C-terminal de cada dominio JAK-JH1. c-Src se fusionaron con la etiqueta Flag único en el extremo C-terminal. Cada una de las construcciones anteriores se transfectó en HEK293T combinado con PMD-2.g y pCMV-dr8.74 vectores auxiliares para embalaje virus. medios sobrenadante se recogieron después de 48 h y se utilizaron para infectar HEK293T noche, después se reemplazan con medio fresco durante otras 24 h. piscinas celulares estables se seleccionaron en presencia de puromicina (2,5 mg /ml) durante 7 días.
Cell Cultura
Las células se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco suplementado con suero bovino fetal 10% ( FBS), penicilina (100 U /ml) y estreptomicina (100 mg /ml).
Pruebas de drogas
Los productos naturales para la detección de drogas eran del Centro Nacional de recursos Compuesto (El proveedor de la biblioteca original de este instituto era BioBioPha Co., Ltd.). Los compuestos de productos naturales (10 mm) se diluyeron con DMEM (10% FBS) a 100 mM (compuestos diluidos). A549R células para la detección de drogas se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1 × 10
4 (100 l /pocillo en DMEM con 10% FBS). Los compuestos Doce horas más tarde, 25 l se diluyó con 75 l de DMEM fresco (10% FBS) se añadieron en cada uno separado bien para otra 24 h para la 1
st vuelta de selección a la concentración de 25 mM. Se añadieron 12,5 l diluidas compuestos con 87,5 l de DMEM fresco para el 2
ª vuelta de selección a una concentración de 12,5 mM. DMSO se utiliza como vehículo (0,25% en 1
ª ronda de cribado y 0,125% en 2
ª vuelta de selección). IL-6 (250 ng /ml) y PD-180970 (250 nM) se usaron como estimulador y el inhibidor conocido para comprobar la respuesta del sistema para cada ronda de selección en una sola placa. La respuesta del sistema sería considerado normal cuando IL-6 induce más de 2,5 veces de fluorescencia y PD-180970 muestra la inhibición de la fluorescencia -50% 40% en cada vuelta de selección. Hemos utilizado un counterscreen suponiendo que el inhibidor conocido PD-180970 tiene una inhibición significativa de la señal, y los inhibidores potenciales siempre tendríamos un mejor rendimiento que el PD-180970. Dado que el control positivo PD-180970 (250 nM) siempre mostró una proporción de fluorescencia aproximada al 50% y podría inhibir la fosforilación de STAT3 significativamente cuando se juzga mediante análisis Western-Blot, elegimos 50% como valor "cortado", entonces cualquier compuesto que presenta una relación de fluorescencia de las células control ≤50% (
es decir, la inhibición de la fluorescencia
≥50%) será elegido. Los datos se resumen de la siguiente manera: Paso 1, 1
ª ronda de cribado, así Uno Uno-compuesto, 25 mM, ensayo de luciferasa solamente. Los compuestos se recogieron a cabo siempre FR (proporción de fluorescencia) es ≤50%. Después de este paso, los compuestos escogidos podrían incluir algunos excesivamente tóxicos. Para descartar la inhibición de la fluorescencia causada por la citotoxicidad, se aplicó Paso 2. Paso 2, 2
ª ronda de cribado, 12,5 M de cada compuesto de la Etapa 1, y dos repeticiones de ensayos de luciferasa y MTT se aplicaron. Si FR% es ≤50% & amp; Δ (% CV - FR%) es ≥30%, los compuestos se escogieron para análisis posteriores. Los compuestos excesivamente tóxicos fueron excluidos por este paso. La desviación "30%" es un valor empírico que fue capaz de distinguir compuestos excesivamente tóxicos y compuestos específicos. Aquí, FR, fluorescencia Ratio = valor de fluorescencia del tratado bien dividido por el valor de la fluorescencia del control del pozo; CV, la viabilidad celular = valor para la supervivencia de la célula del tratado bien dividido por el valor de supervivencia de la célula de control de pozos; Ensayo de la luciferasa se realizó para fluorescencia Valor; MTT ensayo se realizó para la supervivencia de la célula Valor. (Porcentaje de inhibición de fluorescencia = 100% - FR%; Porcentaje de inhibición del crecimiento celular = 100% -% CV).
En el ensayo de luciferasa, se añadieron sustrato de luciferasa Steady Glo 50 l (50 l /pocillo) . Después de 10 minutos de incubación, se midió la fluorescencia por Vector3 multinivel contraplaca (Perkin Elmer). Para el ensayo de viabilidad celular MTT, 20 l solución de MTT (5 mg /ml en PBS) se añadió durante 4 horas de incubación. Los cristales resultantes se disolvieron en 100 l de DMSO y la intensidad de la absorbancia se midió por Vector3 a 490 nm longitud de onda.
Western-Blot, inmunoprecipitación y la célula de tinción
Las células se lavaron con PBS enfriado con hielo por tres veces y se lisaron con tampón de lisis RIPA durante 30 minutos a 4 ° C (NaCl 150 mM, 1% NP-40, 0,5% desoxicolato de sodio, 0,1% SDS, Tris 50 mM, pH 7,5, EDTA 5 mM, EGTA 1 mM , 1 × proteasa cóctel inhibidor (Roche), 1 × inhibidor de la fosfatasa cóctel (Roche)). Los lisados se centrifugaron a 12.000 x rpm durante 10 minutos a 4 ° C. Cantidades iguales de proteínas, determinado por el método BCA (Pierce, Thermo), se separaron a continuación por SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore, Merck). Las proteínas se detectaron con anticuerpos indicados.
células HEK293T que expresan Flag etiquetados Src se pretrataron con DMSO, PD180970 (500 nM) y Brevilin A (15 mM) durante 4 horas por separado. Las células se lavaron con PBS enfriado en hielo durante tres veces y se lisaron con 500 l de tampón de lisis (50 mM Tris HCl, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% de Triton X-100 pH 7,4) en presencia de cóctel inhibidor de la proteasa y fosfatasa cóctel inhibidor. Los lisados se centrifugaron a 12.000 x rpm durante 10 minutos a 4 ° C. Las cantidades iguales de proteínas por métodos de BCA, se incubaron con perlas anti-FLAG M2 Affinity durante 8 horas a 4 ° C. muestras de proteína Src se eluyeron con 0,1 M glicina-HCl, pH 3,5 y se neutralizó con Tris-HCl (0,5 M pH 7,4).
Para el ensayo de apoptosis, las células se sembraron en placas de 24 pocillos. Doce horas más tarde, se retiró el medio y se reemplazó con medio fresco en la presencia de 10 mM Brevilin A para 24 h. Las células se sometieron a continuación a un proceso de tinción doble con anexina-V-PI como en el protocolo de kit de Anexina V-FITC Apoptosis Detección (Beyotime Instituto de Biotecnología).
Purificación de proteínas y Ensayo de quinasa
C-terminal marcada con His proteína recombinante se expresó en hSTAT3
E. coli
,
Rosetta Opiniones y purificado de Ni
+ cromatografía de afinidad.
hstat3
CDS se clonó en pET28b, y la inducida por 0,5 mM isopropiltio-β-galactosidasa a 37 ° C durante 6 h. Los cuerpos de inclusión se centrifugaron a 12.000 x rpm durante 10 minutos a 4 ° C después del tratamiento con ultrasonidos en E. coli
células enteras. A continuación, los cuerpos de inclusión se lisaron con tampón de lisis (0,5 M NaCl, fosfato de sodio 20 mM, imidazol 20 mM, urea 8 M, pH 7,5). Ni los granos
+ cromatografía de afinidad se utilizaron luego para la unión desplegada His-hSTAT3. En la columna de replegamiento fue elegido y, finalmente, la proteína STAT3 replegada se eluyó mediante tampón de elución (0,5 M NaCl, fosfato de sodio 20 mM, imidazol 250 mM, pH 7,5). Después de un proceso de intercambio iónico, la proteína hSTAT3 purificada en PBS (10% de glicerol) se congeló para su posterior análisis.
aproximado de 5 × 10
se recogieron 8 células HEK293T que expresan Flag-His-Tyk2 JH1 y se lisaron con tampón de lisis (0,5 M NaCl, fosfato de sodio 20 mM, imidazol 20 mM, pH 7,5). Ni
+ cromatografía de afinidad perlas se utilizan para la unión-Su-etiquetados Bandera Tyk2-JH1. La proteína se eluyó con imidazol 250 mM y se diluyó con tampón de unión perlas ANTI-FLAG M2 Affinity y se incubó con perlas de M2 afinidad por 2 h a temperatura ambiente. proteína Tyk2-JH1 finalmente se eluyó con PBS que contiene 3 × péptido FLAG (500 ng /ml, 30 min a temperatura ambiente) para obtener más ensayo de quinasa.
aproximado de 150 ng de proteína hSTAT3 y 20 ng de Tyk2-JH1 quinasa eran pre-incubaron con 1 x tampón de quinasa, en presencia de la serie de concentración de 10, 20, 40, y 80 mM, para 10 min. ATP se añadió en la reacción a la concentración de 200 mM a 50 l de volumen finalmente. A continuación, la reacción de la quinasa se continuó a 37 ° C durante 2 h, y se detuvo por 5 x tampón de carga de muestra de proteína (95 ° C, 5 min). 20 l de cada muestra se cargó para el análisis SDS-PAGE y Western-Blot.
RT-PCR cuantitativa y PCR en tiempo real
ARNm total fue extraído a partir de células cultivadas con kit de purificación de ADN Tiangen . La transcripción inversa se realizó con M-MLV kit de transcripción inversa (Invitrogen, Life Technologies Corporation). Cuantitativa en tiempo real PCR se terminó con el kit de Roche mezcla de Cyber Green PCR en Biorad C1000 termociclador. Los pares de cebadores para RT-PCR fueron las siguientes:
GAPDH
adelante 5'-TGGCAAATTCCATGGCAC-3 ', 5'-reversa CCATGGTGGTGAAGACGC-3';
SOCS3
adelante 5'-CCATGGTGGTGAAGACGC-3 ', 5'-revertir CCTGTCCAGCCCAATACCTGA-3' [27];
IRF-1 | forward5'-CGATACAAAGCAGGGGAAAA-3 ', 5'-reverse TAGCTGCTGTGGTCATCAGG-3' [28].
Análisis de Datos y Métodos Estadísticos
Cada análisis se repitió como se indica. la viabilidad celular relativa se expresa como un porcentaje (%) con respecto a las células control sin tratar. Las barras de error representan la desviación estándar (± SD). Los datos se analizaron por el método de ANOVA para cada pruebas de comparación de dos grupos. Blot y la intensidad de señal de imagen se cuantificó usando el software ImageJ2X. P-STAT3 y p-p65 cambios veces se normalizaron a STAT3 total y p65, respectivamente, mientras que p-AKT y p-GSK-3ß cambios se normalizaron a GAPDH.
SOCS3
y
IRF-1
cambios en el nivel de ARNm se normalizaron a un total de
GAPDH
ARNm. números de cuantificación se representan en la parte inferior de las manchas. Plegables cambios de fluorescencia Anexina-V se normalizaron por el recuento de células. IC
50 (GI
50) fue calculado por el software de SPSS19 (método de regresión-probit). Histogramas y diagramas se dibujan con el software de origen 8.
Resultados
> alto rendimiento del sistema de detección de drogas Establecimiento de STAT3 señalización basada
.
Las células A549 se transfectadas con el vector informador de luciferasa, SIE-luc-puro, que contiene elementos de respuesta STAT3 repetidas (16 × SIE, sis-inducible element,5′-TTTCCCGTAAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAAGCTCGCTAGCATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAATTCCTGTAAGCTCGAGGATATCAAGATCTAGACACTAGAGGGTATATAATGGAAGCTCGACTTCCAGCTT-3′) (Fig. S1). A549R línea celular estable de un único clon se eligió a continuación. Este clon fue capaz de respuesta a ambas citoquinas e inhibidores participan en la señalización STAT3 (Fig. 1A). IL-6 inducida aproximadamente 5 × fluorescencia veces, y PD-180970 de tratamiento mostró una inhibición de aproximadamente 50% de la actividad de luciferasa. las concentraciones de IL-6 y PD-180970 para tratamientos no afectaron el crecimiento celular de forma significativa (Fig. 1B). PD180970, el conocido inhibidor de quinasa Src, fue capaz de inhibir actividad STAT3 en parte, en la línea celular A549 según ha informado [25] (fig. 1C).
luciferasa (a) y MTT (B) ensayos de células A549R tratados con DP-180970 (250 nM) e IL-6 (250 ng /ml), respectivamente. A549R células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1 × 10
4 (100 l /pocillo en DMEM con 10% FBS). Doce horas más tarde, se retiraron los medios y se sustituye . con medio fresco en presencia de IL-6 o PD-180970 las barras muestran la desviación estándar (± SD) (tres repeticiones independientes, n = 5 en cada repetición) *** p & lt;. 0,001, ** p & lt; 0,01, * p & lt; 0,05, significativo en relación con el control del vehículo. NS, sin significación estadística. (C) PD-180970 inhibe la actividad STAT3 en células A549R. A549R células se sembraron y cultivaron en placas de 100 mm a 70% de confluencia. Luego, las células se trataron con PD-180970 (250 nM) durante 24 h. DMSO se utilizó como control.
Identificación de Brevilin A como un inhibidor de la señalización STAT3
Los compuestos (1.440 en total) a partir de productos naturales (Tabla S1) fueron seleccionados como se describe en
Materiales y Métodos
. En la vuelta de selección 1
st, también se considera como una proyección en bruto, se utilizó una estrategia de compuesto-uno bien a la concentración de 25 mM. Nueve compuestos mostraron una inhibición de fluorescencia más de 50% (Tabla S2, los valores en rojo). En el 2
nd vuelta de selección, 12,5 mM compuestos se eligieron para su posterior ensayo de luciferasa, así como para el ensayo de viabilidad celular MTT adicional. Sólo un compuesto, llamado Brevilin A (Fig. 2A, un sesquiterpeno pseudoguaiane de
Litsea glutinosa
, la información proporcionada por el proveedor original) todavía mostraba más del 50% de inhibición de fluorescencia, mientras que exhibió una desviación (más del 30% ) entre la viabilidad celular (CV) y la relación de fluorescencia (FR). Especulamos que los inhibidores específicos de señal deben exhibir más de inhibición de la señal de inhibición del crecimiento celular dentro de las 24 horas, y en el 2
ª vuelta de selección, si es FR% ≤50% andΔ (CV% - FR%) es ≥30%, los compuestos se escogieron para análisis posteriores (Tabla S3). De los 9 compuestos de 1 vuelta de selección
st, solamente Brevilin Un cumplen estos criterios (Fig. S2). Parecía que podíamos conseguir los mismos resultados mediante la evaluación de las puntuaciones Z en el 1
st ronda de cribado (Tabla S4). Western-Blot demostró además que Brevilin A STAT3 tirosina bloqueado 705 fosforilación en la concentración de refiere 12,5 y 25 M durante 24 h de tratamiento en las células A549R (Fig. 2B). la inhibición de la señal y la viabilidad celular se analizaron entonces mediante la luciferasa y el ensayo de MTT a concentraciones de serie de Brevilin Un tratamiento después de 24 h (Fig. 2C). Brevilin A exhibió una inhibición mejor en la señalización de una manera dependiente de la dosis (IC
50 = 10,6 M) de la inhibición de la viabilidad celular STAT3 dentro de las 24 h (GI
50 & gt; 20 M), lo que indica que se trata de una señal específica inhibidor más de una compuesto que mata directamente las células cultivadas sobre la base de la toxicidad celular. Luego, se cambió concentraciones de alrededor de 10 micras para nuevos análisis.
(A) Estructura de Brevilin A. (B) Brevilin A inhibe la fosforilación de STAT3 en células A549R. A549R células se sembraron y cultivaron en placas de 100 mm a 70% de confluencia. Las células se trataron luego con Brevilin A (12,5 mM y 25 mM) durante 24 h. DMSO se usó como control. (C) de señalización STAT3 fue inhibida por Brevilin A de una manera dependiente de la dosis. A549R células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1 × 10
4 (100 l /pocillo en DMEM con 10% FBS). Doce horas más tarde, se retiró el medio y se reemplazó con medio fresco en presencia de Brevilin A a diferentes concentraciones durante otras 24 h (20 m, 17,5 m, 15 m, 12,5 m, 10 m, 7,5 m, 5 M, 2,5 M y 1 M). Se realizaron ensayos de luciferasa y MTT a continuación. Las barras muestran la desviación estándar (± DE) (3 repeticiones independientes, n = 5 en cada repetición).
Brevilin A inhibe activado de forma constitutiva de STAT3-Driven DU 145 y MDA-MB-468 células
carcinoma de próstata humano DU145 y cáncer de mama MDA-MB-468 líneas celulares mostraron actividad STAT3 constitutiva. Entonces nos preguntamos si Brevilin A podría inhibir la actividad STAT3 en estas dos líneas celulares. Figura 3A y B indicaron que Brevilin A inhibe la señalización STAT3 en la dosis y de manera dependiente del tiempo, tanto en DU145 (Fig. 3A) y MDA-MB-468 (Fig. 3B). Para probar la inhibición específica de la señal, se analizaron los niveles de fosforilación de p65-Ser536, Ser473-AKT y GSK-3β-Ser9. Curiosamente, Brevilin A no mostró efectos correspondientes sobre la fosforilación de estas proteínas (Fig. 3A, 3B y 3C), lo que indica que Brevilin A no puede afectar o tiene menos efectos sobre otras señales celulares. La inhibición de la actividad STAT3 por lo general conduce a la baja regulación de los genes diana,
por ejemplo.
, C-Myc y CyclinD1 [17]. Aquí, después de tratado con Brevilin A durante 24 h y 48 h, tanto-c Myc expresión y CyclinD1 reducido en DU145 y células MDA-MB-468 (Fig. 3D). El aumento de PARP escindida también se observó (Fig. 3E), lo que indica que Brevilin A indujo DU145 y MDA-MB-468 apoptosis después de 24 h de tratamiento [29]. Es consistente con los informes de que el bloqueo de la actividad STAT3 llevó a la inhibición del crecimiento de células DU145 en [30] y MDA-MB-468 células [31]. A continuación, se midió la viabilidad celular de las células DU145 y MDA-MB-468, así como fibroblastos humanos no transformadas telomerasa inmortalizado células BJ (hTERT-BJ, una línea celular normal inmortalizada). células hTERT-BJ tenían actividad STAT3 inferior (Fig. 4A) y de este modo se utilizaron como células de control negativo. Después se trató con Brevilin A durante 24 h, 48 h y 72 h, Brevilin A mostró inhibición del crecimiento celular más significativo en DU145 y MDA-MB-468 de hTERT-BJ, tanto en 5 M y 10 concentración mu M (Fig. 4B, izquierda y medio). Varios otros compuestos, los mecanismos de los que se sabía sobre la viabilidad celular, se escogieron como controles. AG490, un inhibidor de JAK, podría inhibir la JAK-STAT de señalización del crecimiento celular dependiente (
por ejemplo
, DU145 y MDA-MB-468.); La estaurosporina, que es un conocido pan-tirosina quinasa [32], inhibe una gran cantidad de procesos celulares y por lo general no muestra especificidad de tipo celular; La doxorrubicina, un compuesto utilizado ampliamente, es capaz de inducir la apoptosis de células y el crecimiento celular bloque [33]. Mediante la comparación de los efectos sobre la viabilidad celular entre DU145, las células MDA-MB-468 y hTERT-BJ después de 24 horas de tratamiento de drogas (Fig. 4B, el histograma a la derecha), AG490 muestra efectos similares (con Brevilin A) en estas células, mientras que la doxorrubicina y estaurosporina no tenía especificidad sobre la viabilidad celular o crecimiento entre estas células. La investigación adicional mediante tinción con anexina-V reveló que Brevilin A exhibió una fuerte inducción de la apoptosis para DU145 y MDA-MB-468 (alrededor de 2,2 y 4,4 veces, respectivamente) que hTERT-BJ (~1.3 veces) después de 24 h de tratamiento (Fig. 4C).
tirosina STAT3 705 fosforilación fue inhibida por Brevilin a en la dosis (5 mM, 10 mM y 15 mM para 2 h) y el tiempo (10 M durante 30 min, 60 min y 120 min) modales dependientes tanto en DU145 (a) y MDA-MB-468 (B) las células, mientras que la fosforilación de p65-Ser536 (a y B), AKT-Ser473 y GSK-3β-Ser9 (C) no se vio afectado correspondientemente (10 M, 2 marido). (D) c-Myc y CyclinD1 disminuyó después de 24 h y 48 h de tratamiento con Brevilin A (10 mM). Las células se sembraron y se cultivaron en placas de 100 mm durante 12 h, a continuación se trataron con Brevilin A como se describe. (E) Cleaved PARP aumentó en DU145 y MDA-MB-468 células con Brevilin A (10 mM) de tratamiento de 24 h. DMSO se usó como control.
(A) STAT3 tirosina se detectó la fosforilación de 705 en hTERT-BJ, DU145 y células MDA-MB-468. (B) izquierdo y diagramas medias, hTERT-BJ, DU145 y MDA-MB-468 células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 8 × 10
3 (100 l /pocillo en DMEM con 10% FBS) . Doce horas más tarde, los medios se retiraron y se reemplazaron con medio fresco en presencia de Brevilin A (5 M y 10 M) durante 24 h, 48 h y 72 h, la viabilidad celular se midió por el ensayo MTT. histograma derecho, 12 horas más tarde se sembraron las células, los medios fueron retirados y se reemplaza con medio fresco en presencia de Brevilin A (10 mM), AG490 (100 mM), doxorrubicina (1 M) y estaurosporina (100 nM y 500 nM) para 24 h. Dox, doxorrubicina. Sta, estaurosporina. Las barras muestran la desviación estándar (± SD) (3 repeticiones independientes, n = 3 en cada repetición). *** P & lt; 0,001, ** p & lt; 0,01, * p & lt; 0,05. NS, sin significación estadística. (C) Las células se sembraron en placas de 24 pocillos. Doce horas más tarde, se retiró el medio y se reemplazó con medio fresco en la presencia de 10 mM Brevilin A para 24 h. DMSO se usó como control. Las células se sometieron a continuación a un proceso de doble tinción con anexina-V-PI. programa de la exposición misma se utilizó en cada longitud de onda.
Brevilin bloques A inducida por citoquinas de señalización STAT
Las citocinas, como las interleucinas e interferones, por lo general inducen la activación de STAT3 a través de la vía de JAK-STAT canónica. Se ha informado de que STAT3 se activó en DU145 y MDA-MB-468 a través de IL-6 bucles autocrinos [34], [35]. Aquí, en la presencia de un tratamiento adicional de IL-6, se encontró que Brevilin A podría inhibir la activación de STAT3 en respuesta a IL-6 de inducción en HEK293T, células HeLa y HepG2 (Fig. 5A). Para probar si esta inhibición por Brevilin A estaba involucrado en otras citoquinas mediadas activación STAT3, se usaron IFN y IFNa. En pocas palabras, la IL-6 inducida por la activación de STAT3 través de la vía IL6R-gp130-JAK [36], mientras que IFN y IFN inducidos por la activación de Tipo II-I y tipo interferón-receptor vía JAK, respectivamente [37]. Después del pretratamiento de Hela con Brevilin A, Tyr705 fosforilación de STAT3 se inhibió en gran medida como se esperaba (Fig. 5B). La transcripción de
SOCS3 gratis (supresor de la señalización de la proteína citoquina 3) gen está regulada por la activación de STAT3 directamente en respuesta a citoquinas como la IL-6 [38], por lo que el nivel de ARNm de
SOCS3
por lo general refleja la actividad transcripcional de STAT3. Se midió el nivel de ARNm de
SOCS3
en respuesta a IL-6 con o sin un tratamiento previo Brevilin por RT-PCR en las células HEK293T, HeLa y HepG2. Un Brevilin STAT3 mediada inhibida
SOCS3
transcripción en todas estas células drásticamente (Fig. 5C). En tiempo real PCR resultados mostraron una reducción aproximada del 70% de los
SOCS3
ARNm después tratado con Brevilin A en presencia de IL-6 en células HEK293T (Fig. 5D).
Las células se sembraron y cultivaron en platos de 100 mm durante 12 h, a continuación, los medios se retiraron y se reemplazaron con medio fresco sin suero durante otras 12 h. Se añadió Brevilin A (10 mM) durante 30 minutos de pretratamiento, a continuación, las células fueron tratadas con IL-6 (250 ng /ml), IFN (5000 U /ml) y IFN (1500 U /ml) durante 2 h. la fosforilación de STAT3 fueron analizados por Western-Blot (A y B). (C) Las células se sembraron y se cultivaron en placas de 100 mm durante 12 h, a continuación se retiró el medio y se reemplazó con medio fresco sin suero durante otras 12 h. Brevilin A se añadió durante 30 minutos de pretratamiento (HEK293T, 10 mM; Hela y HepG2, 15 mM), a continuación, las células fueron tratadas con IL-6 (250 ng /ml), IFN (5000 U /ml) y IFN (1500 U /ml) durante 4 h.
Socs3
ARNm se analizaron por RT-PCR. (D) Análisis de qPCR en tiempo real de
SOCS3
mRNA en células HEK293T tratados con Brevilin A en presencia de IL-6 (250 ng /ml). (E) Brevilin A inhibe IFNa y IFN inducida por fosforilación Tyk2 y JAK2, respectivamente, así como la fosforilación de tirosina STAT1 en células HeLa como en tratados (B). (F)
IRF
mRNA fueron analizados por RT-PCR en células HeLa en presencia de IFN como tratamientos descritos anteriormente.
Brevilin A Blocks Janus quinasa Actividad
Desde Brevilin a podría inhibir la fosforilación de JAK2 y Tyk2 en respuesta a IFN y IFN (Fig. 5E), que después se ensayaron los efectos de Brevilin a sobre la señalización de STAT1. Los resultados indican que la fosforilación de STAT1 y su gen diana
IRF1
se redujeron en presencia de Brevilin A después de la inducción de citoquinas (Fig. 5E y 5F). Estas características revelan que los posibles objetivos inhibidores directos de Brevilin A pueden localizar aguas arriba de la señalización de STAT3 y STAT1.