Extracto
extracto de cebada verde (GB) fue investigado por posible actividad contra el cáncer mediante el examen de sus propiedades anti-proliferativos y pro-apoptóticos de la leucemia humana /líneas celulares de linfoma. Nuestros resultados indican que GB exhibe actividad anti-proliferativa selectiva en un panel de células de leucemia /linfoma en comparación con las células no cancerosas. Específicamente, GB interrumpe la progresión del ciclo celular dentro de las células BJAB, como se manifiesta por G2 /M detención de fase y la fragmentación del ADN, y la apoptosis inducida, como se evidencia por la fosfatidilserina (PS) translocación a la membrana citoplasmática exterior en dos de linaje B de leucemia /linfoma líneas celulares. Se encontró que el efecto pro-apoptóticos de GB para ser independiente de la despolarización mitocondrial, lo que plantea vías de muerte celular extrínsecos para ejercer su citotoxicidad. En efecto, GB provocó un aumento de la producción de TNF-α, la caspasa-8 y la caspasa-3 de activación, y PARP-1 de escisión dentro de la leucemia linfoblástica Nalm-6 células agudas pre-B. Por otra parte, la caspasa-8 y la caspasa-3 y la activación de PARP-1 de escisión fueron fuertemente inhibidas /bloqueada por la adición de los inhibidores de caspasa específicos Z-VAD-FMK y Ac-DEVD-CHO. Además, la señalización intracelular análisis determina que el tratamiento GB mejorada activación constitutiva de Lck y tirosina quinasas Src en Nalm-6 células. Tomados en conjunto, estos hallazgos indican que GB induce señales anti-proliferativos y pro-apoptóticos preferenciales dentro de las células de la leucemia /linfoma de linaje B, según lo determinado por las siguientes características bioquímicas de la apoptosis: externalización de PS, una mayor liberación de TNF-α, caspasa-8 y la caspasa-3 de activación, PARP-1 de escisión y la fragmentación del ADN Nuestras observaciones revelan que GB tiene potencial como un agente anti-leucemia /linfoma solo o en combinación con terapias estándar contra el cáncer y por lo tanto garantiza que más de evaluación
in vivo
a apoyar estos hallazgos
Visto:.-Robles Escajeda E, D Lerma, Nyakeriga AM, Ross JA, Kirken RA, Aguilera RJ, et al. (2013) Buscando en la madre naturaleza para la actividad anticancerígena: Anti-proliferativa y pro-apoptóticos efecto provocados por la cebada verde en las células de leucemia /linfoma. PLoS ONE 8 (9): e73508. doi: 10.1371 /journal.pone.0073508
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América
Recibido: Abril 1, 2013; Aceptado: July 22, 2013; Publicado: 9 de septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Robles-Escajeda et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los fondos para este trabajo fue proporcionado por NIGMS subvención SCORE 1SC3GM103713-01 a RJA; la Fundación Edward N. y Margaret G. Marsh, Lizanell, y la Fundación Colbert Coldwell a RAK; Subvenciones 8G12MD007592 al Centro de Investigación Biomédica de Frontera (CRBB) y P20MD002287-06 a la Disparidades de Salud Centro de Investigación Hispano (HHDRC) de los Institutos Nacionales de Salud de las Minorías y Disparidades de Salud (NIMHD), un componente de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) . ER-E y DL fueron apoyados por el aumento Scholars Program en UTEP través de NIGMS subvención No. R25GM069621-08 y REU-NSF subvención No. DBI-0.851.881, respectivamente. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia.
Introducción
A nivel mundial, la cebada se considera una planta no tóxica [1] que produce un grano de cereal que sirve como base de malta en la industria cervecera. También es un componente saludable de diversos alimentos y bebidas (pan, sopas, guisos, cerveza, etc.) y como importante de forraje animal. Independientemente de su grano, de 10 a 12 pulgadas de largo hojas jóvenes de cebada, también conocida como cebada verde, se ingieren en forma de infusión y también se preparan para el consumo humano como polvo seco. hojas jóvenes de cebada se recomiendan como un suplemento dietético debido a su contenido de vitaminas y minerales [2].
Estudios anteriores han indicado que los extractos de granos de cebada enteros exhiben efectos anti-oxidantes y anti-proliferativos sobre el cáncer colorrectal humano Caco células -2 [3]. Sin embargo, la actividad anti-proliferativa dentro de hojas de cebada verde que queda por esclarecer. productos verdes de la cebada tienen propiedades anti-inflamatorias y pueden modular factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) de producción /liberación de células de monocitos humanos THP-1 [4]. Del mismo modo, otro estudio informó de que un compuesto aislado a partir de hojas de cebada verde poseía propiedades antioxidantes [5]. Además, las moléculas pequeñas (menos de 1 kDa) purificados a partir de extracto de cebada verde (GB) inhibió la liberación de TNF-α a partir de células mononucleares obtenidas de la artritis reumatoide (AR) de los pacientes, lo que sugiere que GB podría ser un fármaco natural con anti-oxidante y anti- actividad inflamatoria que alivia los síntomas de los pacientes que sufren de RA [6]. estudios de purificación se llevaron a cabo utilizando métodos avanzados para caracterizar los compuestos específicos que son responsables de las actividades biológicas observadas de GB. Markham y Mitchell mostraron que la flavona-C-glucósidos, saponarin y lutonarin, a partir de hojas jóvenes de cebada verde fueron los responsables de las propiedades anti-oxidantes [7]. Del mismo modo, biomasas de plantas de cebada verdes poseen cantidades significativas de las enzimas antioxidantes catalasa y superóxido dismutasa, así como la no enzimática antioxidantes vitaminas C y E [8,9]. En consonancia con estas observaciones,
in vivo
estudios que incluyeron 36 sujetos sugirieron que los suplementos diarios de hojas de cebada en combinación con vitaminas antioxidantes (C y E) disminuyó la lipoproteína de baja densidad (LDL)-vitamina E y contenido oxidación inhibida pequeña denso-LDL, en consecuencia, la reducción de algunos de los principales factores de riesgo de la aterosclerosis y la protección de pacientes diabéticos tipo 2 contra las enfermedades vasculares [10]. Por otra parte, se encontró que una combinación de saponarin /lutonarin (4,5 /1 proporción) aislado de hojas jóvenes de cebada tener efectos anti-oxidantes que fueron comparables a los obtenidos a partir de α-tocoferol y hidroxitolueno butilado [11].
se ha propuesto que las actividades anti-oxidante y anti-cáncer en frutas y verduras son atribuibles al aditivo o sinérgico consecuencia de su compleja mezcla de componentes fitoquímicos [12]. Por otra parte, la fracción de polifenoles totales dentro de arándanos exhibió actividad anti-proliferativa más eficiente en comparación con sus componentes individuales, lo que sugiere un aditivo combinado o influencia sinérgica [13]. Además, varios estudios han puesto de manifiesto que los productos vegetales pueden actuar como agentes de supresión del ciclo celular, la interrupción de la iniciación o progresión de fases de la carcinogénesis [14-17]. Además, se ha observado que los pacientes de cáncer a menudo ingieren productos vegetales, además de sus medicamentos prescritos [18] basado en la suposición de que los productos vegetales tienen efectos secundarios inocuos y son una opción terapéutica bien estudiado.
a pesar de la evidencia de potencial de GB como un mediador antiinflamatorio, hay escasa evidencia de su actividad anti-proliferativa y /o citotóxico directo sobre las células normales o transformadas. En este estudio, hemos tratado de examinar la actividad anti-proliferativa y citotóxica de GB en varias líneas celulares de leucemia /linfoma. Nuestros datos demuestran que GB tiene selectiva efecto anti-proliferativo en varias células de leucemia /linfoma, con poca o ninguna en las células no cancerosas. De las cuatro líneas celulares de cáncer, pre-células B (Nalm-6) y maduro-B (BJAB) fueron los más sensibles a la actividad anti-proliferativa de GB. Por primera vez, nuestro estudio mostró que GB llevó a la muerte celular apoptótica inducida a través de la liberación de TNF-α, la caspasa-8 y la caspasa-3 actividades, PARP-1 de escisión, la translocación PS, detención del ciclo celular asociada a la fragmentación del ADN. Estos estudios proporcionan apoyo a la utilidad potencial de GB contra la leucemia /linfoma y merecen una mayor investigación en sistemas de modelos animales.
Materiales y Métodos
extractos de cebada verde (GB) preparación
polvo de cebada verde de hojas jóvenes de
Hordeum vulgare L.
, que se vende comercialmente como un suplemento de hierbas como una fuente activa de vitaminas y minerales (vitamina Mundial; www.vitaminworld.com), se utilizó. polvo deshidratado GB se resuspendió con solución salina tamponada con fosfato (PBS; Life Technologies, Grand Island, NY) a una concentración de 10% v w /. Las suspensiones de polvo rehidratadas fueron expuestas a tres ciclos de congelación /descongelación consecutivos a la temperatura de -80 ° C /cuarto, respectivamente. A continuación, las muestras se sometieron a ultrasonidos en varias ocasiones (Vibra Cell; Sonics y Materials Inc., Newtown, CT) a la máxima amplitud de 40%, ~ 14 vatios, utilizando un ¼ "micropunta, por un pulso de ultrasonidos 20 seg seguido de intervalos de descanso de 30 seg , durante siete ciclos sucesivos. Los tubos que contienen las mezclas de suspensión se mantuvieron previamente enfriado en un baño de hielo-agua durante todo el procedimiento para evitar el calentamiento. Después de centrifugación a 15.000 ×
g
de 30 min, se recogieron los sobrenadantes y se filtra asépticamente, inicialmente a través de poros de la membrana de 0,45 micras, seguida de una segunda filtración a través de poros de la membrana 0,22 mm (Cole-Parmer, Chicago, ILLINOIS). Las muestras de PBS estéril sin GB se utilizaron como controles. Además, se midió el peso seco del material soluble GB para determinar la concentración del peso seco de la planta, en mg /ml, que se utiliza en cada tratamiento. Tres partes alícuotas de 1 ml de ambas muestras GB preparados en PBS se liofilizaron (liofilizador Labconco 4,5 L, Stanford, CA) durante la noche. Además, partes alícuotas de 1 ml de PBS solo se utilizaron para restar la contribución disolvente PBS, y se calculó el peso en seco. Los volúmenes típicos utilizados en este estudio y sus equivalentes en peso seco de GB se representan en la Tabla S1
Líneas celulares y condiciones de cultivo
Se utilizaron cuatro líneas humanas de leucemia /linfoma de células:. YT Natural Killer- como [19], madura-T Jurkat leucemia linfoblástica aguda [20], pre-B, la leucemia linfoblástica aguda Nalm-6 [21], y el linfoma de Burkitt-B madura BJAB [22]. Con fines comparativos,, una línea de células de origen no cáncer neonatal dérmica fibroblastos de prepucio humano (HS27 Hs27; ATCC, Manassas, VA), también se incluyó. Los medios de cultivo para la leucemia /linfoma (YT, Jurkat, Nalm-6 y BJAB) y células de fibroblastos (Hs27) eran RPMI y DMEM (Hyclone, Logan UT), respectivamente. Ambos de estos medios de cultivo se complementaron con 10% de suero inactivado por calor fetal bovino (Hyclone), 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina y 0,25 mg /ml de anfotericina B (Lonza, Walkersville, MD). Células en crecimiento exponencial, a aproximadamente 60-75% de confluencia, se contaron y se sembraron en placas de 24 pocillos. Las condiciones de incubación de las células eran 37
° C en un humidificado 5% de CO
2 atmósfera. Para garantizar una alta viabilidad, las células se procesaron tal como se describe anteriormente [23].
anti-proliferativa ensayo
Las células de leucemia /linfoma y no cancerosas fueron sembradas en un formato de placa de 24 pocillos a 1x10
5 células /pocillo y 1.25x10
4 células /pocillo en 1 ml de medio, respectivamente. Después de que las células fueron expuestas a 50 l /ml de GB para 96 h, el número absoluto de células por mililitro se cuantificó usando un microscopio invertido y una cámara de Neubauer (hemocitómetro), para estimar la actividad anti-proliferativa en comparación con los controles negativos no tratados. Las células que crecen en suspensión se homogeneizaron directamente, y una alícuota se cargaron en un hemocitómetro y se contaron. Para las células adherentes HS27, el sobrenadante que contiene las células flotantes (principalmente muertas) de cada pocillo se recogieron en un tubo, mientras que las células adherentes se separaron por tripsinización tal como se detalla anteriormente [24]. Flotante y las células adherentes se homogeneizaron y se contaron, como se detalló anteriormente. Los resultados se expresan como la media de cultivos por cuadruplicado. Los controles tratados con PBS, diluyente de la GB, se normalizaron a 100% y se usaron como referencia para calcular el porcentaje de la proliferación celular tratado con GB.
citotoxicidad monitoreado por colorante de propidio vitales ensayo de exclusión de yoduro de
Para la cuantificación de la citotoxicidad, se recogieron muestras de células, se tiñeron con la membrana impermeable-colorante yoduro de propidio (PI) y monitoreados en el modo en vivo de células
a través de
citometría de flujo (FC500 Cytomics; Beckman Coulter, Miami , FL). Este ensayo identifica las células individuales PI-positiva con las membranas plasmáticas rotas que se consideran células muertas. Aproximadamente 10.000 acontecimientos se recogieron para cada muestra, y se analizaron los datos como se informó anteriormente [25]. Como controles citotóxicos /antiproliferativos positivas, las células se expusieron a 1 mg /ml G418, un inhibidor de la síntesis de proteínas. Además, como controles negativos, las células tratadas con volúmenes equivalentes de GB diluyente solo, PBS, y las células no tratadas se incluyeron en cultivos paralelos. La adquisición y análisis de datos se realizó utilizando el software CXP (Beckman Coulter). El análisis
Ciclo celular midiendo el contenido de ADN celular
El análisis del contenido de ADN y del ciclo celular distribución celular se realizó por PI tinción y el seguimiento de su fluorescencia
a través de
citometría de flujo. La influencia de GB como un posible disruptor del ciclo celular se investigó sobre la línea celular BJAB asíncrona después de 96 h de incubación. Las células se sembraron en una placa de 24 pocillos, se cultivaron como se ha descrito anteriormente y se recogieron como se detalla anteriormente [24]. Los núcleos celulares se prepararon utilizando los reactivos del kit DNA-Prep Coulter (Beckman Coulter) siguiendo las instrucciones del fabricante. En resumen, se recogieron las células y se centrifugaron a 262xg durante 5 min. Se desechó el sobrenadante y después los sedimentos celulares se resuspendieron suavemente por vórtice a baja velocidad usando 100 l de lisis DNA-Prep y un reactivo de permeabilización (detergente), seguido por la adición de 400 l de reactivo de manchas de ADN Prep (50 mg /ml PI y 4 kU /ml de ARNasa). Posteriormente, las muestras se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad durante 60 min, seguido por citometría de flujo análisis (LSRII; BD Biosciences, San Jose, CA). Como control positivo para la detención del ciclo celular, se llevaron a cabo dos experimentos independientes en los que las células se expusieron a 1 mg /ml de G418 y 80 nM etopósido (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) durante 96 h. Como control para los efectos no específicos, el diluyente de GB, PBS (10 y 50 l), que figura en las muestras experimentales, se incluyó. Se utilizaron células no tratadas como controles. Los porcentajes de células con diferentes distribuciones de contenido de ADN se determinaron a partir histograma con puertas para sub-G0 /G1, hypodiploid; G0 /G1, diploide; S, hiperdiploide; y G2 /M, tetraploide. Gating se aplicó para excluir dobletes. La población de la fase S se define como el porcentaje de células con un contenido de ADN entre G0 /G1 (diploide) y G2 /M (tetraploide). Además, se utilizó este tipo de análisis por su capacidad para detectar un patrón de fragmentación de ADN asociado a la apoptosis en el nivel de células individuales, tal como se manifiesta por un aumento en la subpoblación de células sub-G0 /G1 [26]. Para deconvolute los histogramas de contenido de ADN, se utilizó el software FACS Diva (BD Biosciences) o FlowJo (Árbol Star, Ashland, Oregón).
Análisis de la fosfatidilserina (PS) de distribución en las membranas celulares
Para investigar si la interrupción de la asimetría celular PS membrana está implicado como mecanismo de la muerte celular inducida por GB, se monitorizaron las células
vía
citometría de flujo después de doble tinción con anexina V-FITC y PI. Las células se sembraron en placas de 24 pocillos t a una densidad de 100.000 células por pocillo en 1 ml de medio de cultivo. Después de la incubación durante la noche, las células se trataron con 50 l de GB o control PBS durante 48 h adicionales y 96 h, para las células NALM-6 y BJAB, respectivamente. Las células se recogieron, se lavaron con PBS frío y procesada siguiendo las instrucciones del fabricante (Beckman Coulter). Brevemente, las células se tiñeron con una solución que contiene una mezcla de anexina V-FITC y PI en 100 l de tampón de unión, se incubaron en hielo en la oscuridad durante 15 min, seguido de la adición de 400 l de tampón de unión enfriado con hielo y se analizaron inmediatamente
a través de
citometría de flujo (FC Cytomics 500; Beckman Coulter). El porcentaje total de células apoptóticas se define como la suma de ambas fases tempranas y tardías de la apoptosis (anexina V-FITC positivo) cuadrantes derecha, arriba y abajo en una citometría de flujo gráficos de puntos, respectivamente. Para cada muestra, se recogieron 10.000 eventos y se analizaron utilizando software CXP (Beckman Coulter). Cada punto experimental y los controles fueron evaluados por cuadruplicado.
Detección de células en vivo de la caspasa-3 de activación
Las cisteína proteasas-aspártico intracelulares (caspasas) -3 activación en 6 NALM células tratadas GB se midió utilizando un NucView 488 caspasa-3 kit fluorogénico para células vivas (Biotium, Hayward, CA) según las instrucciones del fabricante. Las células que muestran una señal de fluorescencia verde se controlaron
a través de
citometría de flujo (Cytomics FC500). Las células se sembraron en un formato de placa de 24 pocillos como se describió anteriormente y se expusieron durante 6 h y 8 h a 50 l de extracto de GB. Varios controles se incluyeron en esta serie de experimentos: células tratadas durante 8 h con extracto de GB se expusieron a 10 mM Ac-DEVD-CHO (DEVD; N-acetil-Asp-Glu-Val-Asp-aldehído), un potente, específico y el inhibidor irreversible de la caspasa-3 [27], antes de la adición de sustrato NucView; células tratadas durante 8 h con 2 mg de camptotecina /ml, un inductor conocido de la apoptosis
vía
caspasa-3 de activación [26], como control positivo; y se utilizaron células no tratadas como control negativo. recopilación y análisis de las células de la caspasa-3-positivos los datos se realizó utilizando el software CXP.
Western blot de la escisión de PARP-1
La escisión de poli (ADP-ribosa) polimerasa-1 (PARP-1) se evaluó por transferencia de Western como se detalla anteriormente [28]. Brevemente, se añadieron 50 l ó 100 l GB a 1x10
5 Nalm-6 células en 1 ml de medio y se incubaron durante 24 h. Como control positivo de PARP-1 inducción de escisión, se utilizó 2 mg /ml de camptotecina. Un potente inhibidor de la caspasa-3, se añadió Ac-DEVD-CHO (20 M) a las células simultáneamente con GB para determinar la contribución de la caspasa-3 en PARP-1 de escisión. Cantidades iguales de los extractos celulares, 100 g de proteína por carril en tampón de Laemmli reductor, se separaron usando un 10% mini-gel (Bio-Rad, Hercules, CA) para SDS-PAGE. Las concentraciones de proteína de los extractos celulares se cuantificaron con el kit de ensayo de proteínas de ácido bicinconínico (Pierce, Rockford, IL). Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron desde el gel a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL) como se describe anteriormente [29]. A continuación, PVDF borrones de membrana se bloquearon con 5% (w /v) de leche descremada en polvo en TBST durante 1 h. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: conejo anti-PARP-1 (Señalización Celular, Danvers, MA) y de conejo anti-β-actina (Sigma, St. Louis, MO), diluido 1: 1000 y 1: 3000 con solución de bloqueo. Anti-PARP-1 reactivo detecta longitud completa PARP-1 (116 kDa), así como su fragmento grande (89 kDa). Entonces, las proteínas etiquetadas inmunotransferencia con el anticuerpo primario se hibridaron con HRP-conjugado de cabra anti-conejo (dilución 1: 3000; Sigma). Se especifica la movilidad de los marcadores de peso molecular. Las transferencias fueron tratadas con el reactivo de quimioluminiscencia (Millipore, Billerica, MA) y se expusieron a películas de rayos X (Phenix, Candler, Carolina del Norte) para la visualización banda de proteína. Las fotografías de las películas desarrolladas fueron capturados utilizando un sistema de documentación de geles (Alpha Innotech, San Leandro, CA).
Análisis policromática del potencial de membrana mitocondrial (
Δ
Ψm)
Nalm-6 células se trataron con 50 l GB y se incubaron durante 4 h como se detalló anteriormente. Luego, las células se tiñeron con 2 mM del fluoróforo 5,5 ', 6,6'-tetracloro-1,1', 3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine yoduro (JC-1) siguiendo las instrucciones del fabricante (Life Technologies, Grand Island , NY). La interrupción de la mitocondria
ΔΨm
se evidencia por un cambio apreciable de la señal de fluorescencia de rojo a verde. JC-1 agregados o monómeros, que emiten luz roja o verde, se identificaron
a través de
citometría de flujo (Cytomics FC500) utilizando detectores FL1 FL2 o, respectivamente. Como control positivo un ionóforo de protones que disipa la mitocondrial
ΔΨm
, carbonilo cianuro 3-clorofenilhidrazona (CCCP, 50 mM), se utilizó. Las células tratadas con el diluyente GB (PBS) y las células no tratadas se utilizaron como controles. La recopilación y el análisis de datos se realizó utilizando el software CXP.
Luminex múltiplex análisis
Nalm-6 células sembradas en una placa de múltiples pocillos fueron expuestos a 25 y 50 l /ml de GB para 3 h antes de que los gránulos de células y sobrenadantes de medios de cultivo se recogieron por centrifugación. sobrenadantes de cultivo de células de cada muestra se ensayan luego para cuantificar el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y el ligando de Fas soluble (sFas-L) citoquinas niveles, siguiendo la recomendación del fabricante (Millipore, Billerica, MA). Además, los sedimentos celulares se lavaron con PBS y se lisaron con la célula MAP MILLIPLEX señalización tampón de lisis que contiene inhibidores de la proteasa (Millipore, Billerica, MA). cuantificaciones de proteínas se realizaron utilizando el reactivo BCA (Pierce, Thermo Scientific, Rockford, IL). El kit MILLIPLEX MAP Src humana de la familia de quinasa (Millipore, Billerica, MA) se utilizó para detectar fosforilada Lck (Tyr394), Src (Tyr419), Fyn (Tyr420), Blk (Tyr389) y Fgr (Tyr412), en 25 g del total lisado de células de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. Las proteínas diana se analizaron mediante la tecnología xMAP basado en perlas (perfiles multianalito) en la plataforma Luminex 200 (sistema 3D FLEXMAP; Millipore, Billerica, MA) junto con software xPONENT 3,1 (Luminex, Austin, TX) según el protocolo sugerido por el fabricante (Millipore ). Cada punto experimental y los controles se realizaron por triplicado.
Detección en tiempo real de intracelular de activación de la caspasa-8
La caspasa-8 de activación en las células NALM-6 se determinó utilizando el celular permeable y unirse irreversiblemente caspasa-8 inhibidor marcado con fluoresceína, FITC-IETD-FMK, y monitoreado
vía
citometría de flujo [30]. Las células en un formato de placa de 24 pocillos, sembradas a una densidad de 100.000 células por pocillo en 1 ml de medio de cultivo de crecimiento, se expusieron a 10 y 50 l /ml de GB para 4 h y posteriormente se incubaron con reactivo de FITC-IETD-FMK , con fines de tinción, siguiendo el protocolo del fabricante (Abcam, Cambridge, MA). Se utilizaron los siguientes controles: 50 l GB extracto de forma concomitante añadió con el inhibidor pan-caspasa Z-VAD-FMK (Abcam) a 20 mM, que bloquea la unión de FITC-IETD-FMK; 2 mM de H
2O
2, como un control positivo para la activación de la caspasa-8; 50 l de PBS como control de disolvente; y las células no tratadas como control negativo. Las distribuciones de células con la señal de fluorescencia verde se analizaron mediante el detector FL-1. adquisición y análisis de las células de caspasa-8-positivo de los datos se realizaron utilizando el software CXP (Beckman Coulter).
El análisis estadístico
Cada punto de datos se llevó a cabo un mínimo de tres veces. Para indicar la variabilidad experimental, los datos se expresaron como la media con la correspondiente desviación estándar. Dos colas de Student pareada
t
-pruebas se llevaron a cabo para establecer la significación estadística de las diferencias entre las muestras experimentales y sus controles correspondientes. Para indicar si la comparación de dos tratamientos tienen significación estadística, un valor de
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado significativo.
Resultados
GB disminuyen la proliferación de las células de la leucemia /linfoma
Inicialmente, se analizó el potencial actividad anti-proliferativa de GB en el cáncer y la no células de origen del cáncer mediante la cuantificación de la cantidad total de células después de 96 h. células /linfoma de leucemia tratados con GB demostraron una reducción estadísticamente significativa en su número total (
P
& lt; 0,05; Figura 1). Después de la normalización de los controles tratados con PBS a 100%, se calculó el porcentaje de proliferación de las células tratadas con GB. GB ejerció un gradiente de inhibición de la proliferación en las células de leucemia /linfoma, causando reducciones en la proliferación celular de 73% en Nalm-6, 40% en BJAB, 34,5% en YT y 24,7% en las células Jurkat (figura 1A-D). Curiosamente, esta actividad anti-proliferativa no afectó significativamente la proliferación de las células no cancerosas HS27 (Figura 1E). Además, de linaje B Nalm-6 y BJAB eran las células más afectadas (Figura 1A-B). Por lo tanto, se utilizaron estas líneas celulares en experimentos adicionales para explorar el mecanismo subyacente a la toxicidad celular GB. Hasta ahora, nuestros hallazgos sugieren que GB posee una actividad de supresión preferencial de la proliferación de células de leucemia /linfoma.
El número total de células por mililitro (
y
eje x) se cuantificaron usando un hemocitómetro después 96 h de tratamiento: (A), (C) YT NK-como, células Jurkat y (e) HS27 (D) (B) BJAB NALM-6. Como control positivo de un efecto anti-proliferativo, /ml G418 se incluyó 1 mg. Se utilizaron células no tratadas como un indicador de la viabilidad celular durante todos los períodos de tiempo de incubación. Controles adicionales del diluyente de los extractos, PBS, también se examinaron. Cada barra representa la media de cuatro réplicas y las barras de error representan la desviación estándar. La proliferación celular, anotada de la parte superior de 50 l GB células tratadas, se muestra como un porcentaje de la proliferación celular de células tratadas con PBS, que se considera 100% de crecimiento. Cincuenta l en PBS GB equivale a 1,5 ± 0,048 mg /ml polvo liofilizado.
GB induce citotoxicidad en la pre-B aguda leucemia /linfoma de células Nalm-6
concomitante con la cuantificación del número total de células, determinamos si GB indujo citotoxicidad. Sorprendentemente, se observó citotoxicidad sólo en células NALM-6, pero no en BJAB, YT, o células Jurkat (Figura 2A-D), lo que implica que la actividad anti-proliferativa observada no era necesariamente asociado con la citotoxicidad. Con la excepción de Nalm-6, la viabilidad de las líneas celulares de leucemia /linfoma parecía constantemente los valores de los controles tratados con PBS o no tratados (Figura 2). Del mismo modo, la falta de citotoxicidad también se observó en las células no cancerosas derivadas normales (Figura 2E)
Después de 96 h de incubación, se observó toxicidad en Nalm-6 células (A).; mientras que (B) BJAB, (C) YT, (D) células HS27 no cancerosas Jurkat y (E) fueron resistentes a este efecto tóxico. Las células se tiñeron con PI y el porcentaje de citotoxicidad (
y
eje x) se controló usando un método de citometría de flujo. Como control positivo de la actividad citotóxica, se utilizó 1 mg de G418 /ml. Se utilizaron células no tratadas como un indicador de la viabilidad celular durante todo el período de incubación. El diluyente del extracto GB, PBS, también se analizó. Cada barra representa la media de cuatro réplicas y las barras de error representan la desviación estándar. 1 x 10
4 eventos por muestra fueron adquiridas y se analizaron utilizando el software CXP (Beckman Coulter). Cincuenta l en PBS GB equivale a 1,5 ± 0,048 mg /ml polvo liofilizado.
GB provoca la fragmentación del ADN y G2 /M detención en las células BJAB
Se realizaron análisis de distribución del ciclo celular descifrar con más detalle el mecanismo que GB utiliza para inhibir la proliferación celular. Para este propósito, las células BJAB se expusieron a 10 y 50 l GB durante 96 h y después se preparó para el análisis del contenido de ADN celular
vía
citometría de flujo. Este método se basa en sondas fluorescentes que se unen al ADN, lo que permite que todo el contenido de ADN por núcleo que debe controlarse con precisión [31]. No se observaron diferencias relevantes en la distribución del ciclo celular en las células tratadas con 50 l GB, mientras que 10 l células tratadas con GB no mostraron alteración significativa en la frecuencia de células de todas las fases del ciclo celular (Figura 3A-D). Las células con ADN fragmentado apoptótica se pueden distinguir por su contenido de ADN hypodiploid (sub-G0 /G1peak) durante el análisis de contenido de ADN celular univariado. Los valores hipodiploides se aumentaron a 11,8% en las células tratadas con 50 l GB, mientras que en las muestras expuestas a 10 l GB, PBS o los controles no tratados, los valores eran hipodiploides menos de 1% (
P
= 0,01173; figura 3). El valor G0 /G1 25,4% en las células tratadas con GB se redujo significativamente (
P
& lt; 0,04) en comparación con 40,1% y 39% para las células tratadas con PBS y no tratadas, respectivamente. Las diferencias en la frecuencia de células en la fase S fueron imperceptible. El porcentaje de células en fase G2 /M para las células tratadas con GB era 43,7%, que fue superior en comparación con cualquiera de las células que se trataron con PBS, 37,5%, o los controles no tratados, 37,1% (
P
= 0,01945 y
P = 0,02426
, respectivamente).
Después de 96 h GB indujo la fragmentación del ADN de apoptosis y detención en la fase G2 /M en una modalidad dependiente de la dosis. Se recogieron las células, se permeabilizaron y se tiñeron y analizaron
a través de
citometría de flujo. Cada barra representa la media de tres repeticiones independientes, y las barras de error representan la desviación estándar correspondiente. (A-D) El porcentaje de la frecuencia de células se representa gráficamente a lo largo del
y
eje y, y los diferentes tratamientos se representan a lo largo del
x
eje x. (E-I) histogramas representativos de los parámetros individuales, donde se anotan cuatro puertas que exhibe el porcentaje de la frecuencia de células en cada fase del ciclo celular. Gates, de izquierda a derecha: sub-G0 /G1 (hypodiploid; contados como una subpoblación de apoptosis), G0 /G1 (diploides), S (hiperdiploide) y G2 /M (tetraploide). Esta serie de experimentos incluye varios controles: dos compuestos que provocan la alteración del ciclo celular, (G) 80 nM etopósido (ETO) y (H) 1 mg /ml de G418; (F) el diluyente GB, PBS, tal como figura en las muestras experimentales; células y (I) no tratados (UNT), como un control negativo. La significación de las diferencias entre las células tratadas con 50 GB mu l en comparación con 50 l de PBS células tratadas, y también, con las células no tratadas, es de
P
& lt; 0,03 (*) y
P Hotel & lt; 0,04 (‡), respectivamente. E 10 l = 0,3 ± 0,009 mg /ml, y GB 50 l = 1,5 ± 0,048 mg /ml polvo liofilizado.
GB evoca externalización de fosfatidilserina en líneas de células de linaje B
dos líneas de células de linaje B fueron expuestos a GB a discernir su potencial de inducción de fosfatidilserina externalización (PS). Esto se controló
a través de
V-FITC ensayo de anexina /PI y citometría de flujo. Para determinar si GB citotoxicidad ejercida sobre Nalm-6 células también comprendido translocación PS, los experimentos se realizaron después de 48 h de incubación con 50 l GB. En este punto de tiempo, 37,2% de las células fueron apoptóticas y 24,9% de y las células se necrótico (Figura 4A). Las células tratadas con 50 l de PBS y las células no tratadas no mostraron un aumento sustancial en cualquiera de los valores de apoptosis o necrosis (Figura 4C-D). Además, el aumento de la fragmentación del ADN de apoptosis observada en las células tratadas con BJAB GB se procedió a investigar en las mismas condiciones que se aplicaron para el análisis del ciclo celular. células tratadas con GB eran 26,3% anexina V-FITC positivo, en contraste con 15,1 y 3,4% para las células tratadas con PBS o no tratados, respectivamente;