Extracto
Etk es una tirosina quinasa no receptora, lo que proporciona una fuerte señal de supervivencia en células de cáncer de próstata humano. Src, otra tirosina quinasa que activa transversal con Etk, se ha demostrado que desempeñan un papel importante en la metástasis del cáncer de próstata. En este documento, hemos descubierto una nueva clase de inhibidores de ETK. Dentro de estos inhibidores, CTA095 se identificó como un potente inhibidor de Src y Etk dual. CTA095 se encontró para inducir la autofagia, así como apoptosis en células de cáncer de próstata humano. Además, CTA095 inhibió la formación de tubos de células HUVEC y "cicatrización de heridas" de células de cáncer de próstata humano, lo que implica su papel en la inhibición de la angiogénesis y la metástasis de cáncer de próstata humano. Más interesante aún, CTA095 pudo superar la resistencia Src inhibidor en las células del cáncer de próstata. Se induce la apoptosis en células de cáncer de próstata resistente a inhibidores de Src, probablemente a través de un mecanismo de regulación a la baja de Myc y BCL2. Este hallazgo indica que dirigen simultáneamente Etk y Src podrían ser un enfoque prometedor para superar la resistencia a fármacos en cáncer de próstata
Visto:. Guo W, Liu R, G Bhardwaj, Ma AH, Changou C, Yang JC, et al . (2013) CTA095, un Etk Novel y Src inhibidor dual, induce la apoptosis en células de cáncer de próstata y resistencia vence a Src inhibidores. PLoS ONE 8 (8): e70910. doi: 10.1371 /journal.pone.0070910
Editor: Qiming Jane Wang, de la Universidad de Pittsburgh School of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: Marzo 7, 2013; Aceptado: 25 Junio 2013; Publicado: 15 de agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Guo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por C-Tag Bioscience Inc (beca de investigación de RL); NIH subvenciones DK52659 CA150197 (al HJK), y CA098116 (KSL); y el DOD formación postdoctoral premio PC080859 y Auburn Fondo de Dotación cáncer Comunidad (WG). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. C-Tag Inc es una fuente de financiación comercial para este trabajo, y ambos KSL y HJK son asesores científicos para C-TAG Inc. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en el intercambio de datos y materiales.
Introducción
el cáncer de próstata es el cáncer más frecuentemente diagnosticado y la segunda causa de muerte por cáncer de hombres en los EE.UU. [1]. Mientras que el cáncer de próstata primera fase (CAP) puede ser eficazmente controlada por la terapia hormonal, CaP metastásico sigue siendo incurable. inhibidores de la tirosina quinasa (TKIs) se encuentran entre las más prometedoras terapias dirigidas; sin embargo, su potencial como terapéutica del cáncer de próstata no se han realizado plenamente y, hasta la fecha, los resultados de los ensayos clínicos con inhibidores de TK como agentes únicos han sido generalmente modesta, probablemente debido a la redundancia en la unión al receptor y la señalización de mediadores intracelulares [2]. La mayoría de las ITC que se han desarrollado se dirigen contra los receptores tirosina quinasas. Etk es una tirosina quinasa no receptor, que se expresa en off en especímenes de cáncer de próstata humano y proporciona fuertes funciones de supervivencia en células de cáncer de próstata [3], [4]. Etk media la activación de STAT3 crítico en cáncer de próstata sugiere que la alteración funcional de Etk puede atenuar múltiples señales clave que intervienen en el crecimiento y la supervivencia de CaP [5]. Etk también regula la supervivencia [6], metástasis [7], la resistencia a fármacos [3], [8], angiogénesis [9], y la apoptosis [10]. La sobreexpresión de Etk induce próstata intraepitelial neoplasia en un ratón [11]. Informes recientes indican que Etk juega un papel importante en la auto-renovación y el potencial tumorigénico de las células madre de glioblastoma través de la activación de STAT3 [12]. Por lo tanto, la inhibición sistémica de Etk puede ofrecer efectos antitumorales sinérgicos. Hasta el momento, no hay inhibidor eficaz de esta quinasa. Asociado
Src, Etk, y FAK con y transversal activar uno al otro. La inhibición de uno a menudo disminuye la actividad de los demás. Estas tres quinasas han demostrado jugar un papel importante en la angiogénesis y la metástasis de células de cáncer de próstata. El inhibidor de Src, AZD0530, se ha informado de inhibir la metástasis ósea del cáncer de próstata en modelos animales. Sin embargo, este inhibidor carece de la actividad para inducir la apoptosis de células de cáncer de próstata. inhibición dual de Etk y Src no sólo podría superar la desventaja de los inhibidores de Src, pero también puede aumentar la eficacia en la inhibición de la metástasis de células de cáncer de próstata.
autofagia es un proceso catabólico que implica la degradación de los componentes propios de una célula a través de la lisosomal maquinaria [13]. Es un proceso estrechamente regulado que ayuda a mantener un equilibrio entre la síntesis, la degradación y posterior reciclado de productos celulares [14]. La autofagia podría contribuir tanto a la supervivencia celular y la muerte celular de una manera dependiente del contexto. moduladores de la autofagia ahora han surgido sensibilizadores o modificadores de la terapia dirigida tan importantes [15], [16].
Aquí, se presenta la identificación de una novela Etk y Src inhibidor dual, CTA095, que induce la autofagia y apoptosis, como así como efectos sinérgicos con los moduladores de la autofagia en las células del cáncer de próstata. Para nuestro conocimiento, este es el primer informe de un inhibidor dual de Etk y Src con una aplicación como un agente anti-cáncer.
Materiales y Métodos
Reactivos
purificada Etk , Btk, MerTK, Sí y quinasas Src se obtuvieron de Millipore Inc (Dundee, Reino Unido). El yoduro de propidio (PI),
N
,
N-diisopropiletilamina
(DIEA),
N
,
N
-dimethylformimide (DMF), etanol, acetonitrilo (ACN), 1- (3-aminopropil) piperidina, ácido trifluoroacético (TFA), Pd /C, formiato de amonio y dimetil sulfóxido (DMSO) fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO). hidrocloruro de éster metílico de L-fenilglicina se adquirió de Chem-Impex International Inc (Wood Dale, IL). Dibenzofuran-2-carboxaldehído se adquirió de Oakwood Products, Inc (West Columbia, SC). El kit de detección de apoptosis de anexina V-FITC se obtuvo de Abcam (Cambridge, MA). Se utilizó cromatografía de fase inversa líquida de alto rendimiento (RP-HPLC) de la Corporación Waters (Milford, MA) para el análisis y purificación de CTA095. LNCAP, CWR22Rv1, RWPE1, 293 y células HUVEC se obtuvieron a partir de ATCC (Manassas, VA).
síntesis en un solo recipiente de CTA095
El enfoque sintético de CTA095, 2-(dibenzo[
b
,
d
]furan-2-yl)-7-phenyl-1-(3-(piperidin-1-yl)propyl)-1
H
-imidazo[4,5-
g
]quinoxalin-6(5
H
)-one, es similar al enfoque que se informó anteriormente [17]. En breve, se añadió una solución de hidrocloruro de L-fenilglicina metil éster (201,7 mg, 1,0 mmol) y DIEA (383,2 l, 2,2 mmol) en DMF (1,5 ml) gota a gota con agitación vigorosa a una solución de 1,5-difluoro- 2,4-dinitrobenceno (204,0 mg, 1,0 mmol) en DMF (0,5 ml). La solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 45 min. Esto fue seguido por la adición de una solución de 1- piperidina (3-aminopropil) (159 l, 1,0 mmol) y DIEA (174,2 l, 1,0 mmol) en DMF (1 ml). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Etanol (20 ml), Pd /C (10%, 200 mg) y formiato de amonio (1,50 g, 23,8 mmol) se añadieron a la solución. La solución se calentó a reflujo durante 3 h y después se enfrió a temperatura ambiente. El Pd /C se retiró por filtración y el filtrado se concentró con un evaporador rotatorio. Se añadió dibenzofuran-2-carboxaldehído (196,2 mg, 1,0 mmol) en DMF a la solución. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 día. La solución de DMF se vertió en 40 ml de hielo. El precipitado se recogió por filtración y se lavó con agua, seguido de purificación por RP-HPLC. Se recogió la fracción y se liofilizó para dar un polvo de color amarillo como el producto final (Figura S1). La homogeneidad del compuesto se comprobó mediante RP-HPLC analítica. La pureza se determinó que era & gt; 95% de pureza. La identidad de los compuestos se confirmó por la matriz asistida por láser de desorción /ionización de tiempo de vuelo espectrometría de masas. Encontrado: 554.26 Dalton (calculado: 554,26 Dalton para MH
+)
El modelado molecular
Se realizaron estudios de acoplamiento molecular para entender la unión de CTA095 a Etk.. Energía estructura optimizada de CTA095 se calculó utilizando la fuerza de campo Merck Molecular (MMFF) [18], como se aplica en suite Marvin v 5.11 (http://www.chemaxon.com/products/marvin). La estructura tridimensional de Etk humana (residuos 275-675) secuencia (NCBI GI: 42544182) se predijo usando un enfoque basado en el modelado de homología tal como se aplica en HHpred [19], [20]. Para definir un sitio de unión putativo para CTA095 en la estructura de la proteína Etk, se utilizó por primera vez un enfoque ciego de acoplamiento implementado en el servicio web SwissDock (http://swissdock.vital-it.ch) [21], [22]. Entre las agrupaciones generadas por SwissDock, se seleccionó la conformación con la energía libre de unión más bajo. Para entender aún más la estabilidad y la dinámica del complejo ligando-quinasa, se realizó un simulación dinámica molecular de 20 ns (MD), a partir de la estructura de mejor atracado-predicho por SwissDock. Estas simulaciones se realizaron con NAMD v 2.7b2 [23]. campos de fuerza CHARMM27 se utilizaron para calcular los potenciales de Etk, mientras CHARMM22 (como se aplica en SwissParam (http://swissparam.ch) [24] campos de fuerza se utilizaron para calcular los potenciales de CTA095. El complejo quinasa-ligando se solvatados en una caja de agua con condiciones de contorno periódicas. las dimensiones de la caja de agua se selecciona para que sea al menos 10 angstroms más grande que el soluto en cada dirección. todo el sistema se neutralizó con 0,15 M NaCl. un paso inicial minimización se realizó para 6000 pasos, seguido por 20 ns de relajación. las trayectorias de estas simulaciones se visualizaron usando VMD v 1.9 [25], y las interacciones entre el ligando quinasa y se representaron usando PyMOL y LIGPLOT + v 1.4
ensayo de inhibición de la quinasa [26].
inhibición de quinasa se midió usando en capa fina-cromatografía (TLC). quinasas brevemente, purificada (20 nM), el sustrato correspondiente (500 M, TSFYGRH para Etk, YIYGSFK para las otras quinasas), y CTA095 (0 -10 mu M) se incubaron en una reacción de quinasa (mM Hepes 100, pH 7,4, mM MnCl 10
2, mM MgCl 10
2, DTT 1 mM) durante 5 min, y la reacción se inició mediante la adición de 5 Ci
33P-ATP marcado. La reacción (10 l) se incubó a temperatura ambiente durante 1 h y se detuvo añadiendo 10 l H
3PO
4. La radiactividad del sustrato péptido se analizó mediante TLC como se ha descrito anteriormente [27].
Etk ensayo de autofosforilación
actividad de autofosforilación Etk se midió mediante un ensayo de quinasa in vitro. Brevemente, se purificó Etk (100 ng) se mezcló con CTA095 en el tampón de ensayo de quinasa (20 mM Hepes pH 7,55, mM MgCl 10
2, mM MnCl 10
2 mM, DTT 1, 500 M Na
3Vo
4). El ATP frío (5 M) y r- caliente
33P-ATP (5 Ci) se añadieron a la mezcla y la reacción de la quinasa se realizó a 30 ° C durante 30 min. Las reacciones se terminaron con un tampón de muestra de SDS-PAGE 4X y, a continuación, se cargó en un gel de 8% de SDS-poliacrilamida para electroforesis. El gel se secó a vacío y la actividad quinasa auto ETK se analizó con un phosphoimager (Biorad).
Cultivo celular
LNCAP, PC3, las células CWR22Rv1, y RWPE1 se mantuvieron en RPMI 1640 que contenía 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina /estreptomicina /glutamina.
Western blotting
Western Blot se realizó como se describió anteriormente [28]. Las proteínas se detectaron utilizando los siguientes anticuerpos: β-actina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO), Etk (Santa Cruz Inc., Santa Cruz, CA), pEtk; Src, pSrc; Stat3, pSTAT3. Para fosfo-Etk, las células se pre-trataron con pervanadato 100 M durante 15 min antes de la cosecha.
MTT ensayo
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante la noche, seguido de tratamiento con 0,1% de DMSO, como el control del vehículo, y CTA095, a las concentraciones indicadas durante 72 h. La inhibición del crecimiento se midió utilizando un (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) ensayo de 3- (Roche Diagnostic, Mannheim, Alemania).
citometría de flujo
células PC3 se trataron con 0,1% de DMSO (control) y CTA095 a las concentraciones indicadas durante 24 h. la detención del ciclo celular se determinó mediante la incorporación de yoduro de propidio (Sigma-Aldrich) en células permeabilizadas. Las células que sufren apoptosis se identificaron utilizando un kit de Anexina V-FITC (Abcam), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células fueron analizadas utilizando un citómetro de flujo Coulter Epics XL (Beckman Coulter, Miami, FL).
Análisis de la caspasa-3/7 y la caspasa 9 Actividades en el
En la caspasa 3/7 actividades, células PC3 se sembraron a 5.000 células /pocillo en placas de 96 pocillos durante la noche. A continuación, las células se trataron con 0 a 10 M CTA095 durante 24 h. actividades de la caspasa-3/7 se midieron usando la caspasa-3/7 kit Apo-ONE homogéneo de ensayo (Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante. Para la actividad de la caspasa 9, las células PC3 se sembraron en placa de cultivo de tejido de 10 mm y crecieron a 50% de confluencia. Las células se trataron luego con 0-10 M CTA095 durante 24 h. Las células fueron cosechadas y la actividad de la caspasa 9 se midió usando una transferencia de Western con un anticuerpo anti-caspasa 9 anticuerpo.
autofagia ensayo
células PC3 se transfectaron de forma estable con GFP-LC3 [16]. Las células se cultivaron en una placa de 6 pocillos a 50% de confluencia y se trataron con 5 mM CTA095 para 24 h. La autofagia se visualizó mediante GFP-LC3 "puntos lagrimales" e inmunoblot de las isoformas Endógeno LC3.
HUVEC tubo de ensayo de formación de células
Las células HUVEC se sembraron en mitrogel y tratados con CTA095 (0 y 5 M) durante 6 h. la formación de tubos vasculares fue visualizado utilizando un microscopio.
celular PC3 "La curación de heridas" ensayo
células PC3 se cultivaron en placas de 6 pocillos a 60% de confluencia. A continuación, las heridas se hicieron utilizando una punta y se trataron con CTA095 (0 y 5 M). La migración celular (cicatrización de heridas) se visualizó bajo el microscopio en los tiempos indicados.
La inhibición del crecimiento del tumor de xenotrasplante PC3 por CTA095nano (CAT095 formulado en nanopartículas de micelas)
Este estudio se llevó a cabo en estricto de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio de los Institutos nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Universidad de California, Davis (Protocolo Número: 16697). En resumen, 2 × 10
6 fueron inyectados por vía subcutánea células PC3 a los flancos de 5 semanas de edad ratones desnudos masculinos. El volumen del tumor se midió mediante un calibre y se calculó utilizando la fórmula V = (L x W
2) 1/2. Los tumores se dejaron crecer hasta el tamaño indicado y los ratones se dividieron al azar en dos grupos (8 ratones /grupo). El grupo de control fue tratado con vehículo. El grupo de tratamiento se trató con CTA095nano a 10 mg /kg dos veces a la semana por medio de inyección i.v. inyección. El tamaño del tumor y el peso corporal se midieron una vez a la semana. El experimento se terminó cuando el tamaño tumoral del grupo control alcanzó puntos finales por IACUC. Curvas de volúmenes tumorales versos duración se representaron para ambos grupos.
CTA095 supera Src resistencia a los inhibidores en las células de cáncer de próstata
PC3 y PC3-AZD20 (resistente a 20 M AZD0530, que es a partir de células PC3 AstraZeneca través de MTA con células Dr. Chris Evans) se sembraron a 2000 células /pocillo en placas de 96 pocillos durante la noche. Las células se trataron con AZD0530 o CTA095 a las concentraciones indicadas. La viabilidad celular se midió usando un ensayo MTT después de 72 h.
CTA095 induce apoptosis en células de cáncer de próstata resistente a inhibidores de Src través de la inhibición Myc y BCL2
células PC3-AZD20 se sembraron a 10
6 células /pocillo en placas de 6 pocillos durante la noche. Las células se trataron con AZD0530 o CTA095 a 10 micras. La apoptosis se analizó usando el kit de detección de apoptosis FITC Anexina-V. Los niveles de mRNA de Myc y BCL2 se midieron usando PCR en tiempo real. pEtk, Etk, pSrc, Src, pSTAT3, Stat3, Myc y los niveles de BCL2 se midieron utilizando los anticuerpos correspondientes a través de una transferencia de Western.
Estadísticas
Un utilizó un modelo lineal se utiliza en combinación con una prueba de Tukey para el par sabia comparación. Los valores de p inferior a 0,05 se consideraron significativos.
Resultados
CTA095 como un inhibidor dual contra Etk y Src tirosina quinasas
A través de la selección de una pequeña molécula en fase de solución combinatoria de 9.600 diversidad biblioteca, golpear con compuestos fueron descubiertos actividades inhibidoras contra Etk. estudios de estructura-actividad-relación posteriores condujeron a la identificación de CTA095 (Figura 1A). En comparación con otros compuestos de TC con una estructura de núcleo de tres anillos fusionados idéntica a CTA095, CTA095 mostró una inhibición significativa Etk (Figura 1B). Curiosamente, había una fuerte correlación entre la inhibición Etk y la inhibición del crecimiento de PC3 (Figura 1C). Estos datos sugieren que Etk puede ser el objetivo responsable de la inhibición del crecimiento observada para células PC3.
estructura química de CTA095 (A), la identificación de CTA095 como un inhibidor potente Etk (B) y su citotoxicidad para las células PC3 (DO). Para la inhibición Etk, purificada Etk (20 nM), los compuestos correspondientes (1 M), y el sustrato peptídico (YIYGSFK) se incubaron con
33P-ATP en una reacción quinasa. El producto resultante se analizó en una placa de TLC. Para la inhibición del crecimiento, las células PC3 se sembraron a 5.000 células /pocillo en placas de 96 pocillos durante la noche y se trataron con los compuestos correspondientes (10 M) La viabilidad celular se midió usando el ensayo MTT después de 72 h. Columnas, significan; bares, desviación estándar, n = 3.
Después de haber aislado una pequeña molécula que inhibe Etk, el siguiente paso lógico era determinar su especificidad para esta enzima. Para lograr esto, purificada Etk, Btk, Src y Yes se incubaron en un tampón de reacción de quinasa con CTA095 (0-1 M) en presencia de ATP
33P marcado con y un péptido (YIYGSFK), previamente demostrado ser una excelente sustrato para ambas quinasas de la familia Src y BTK. La actividad quinasa se midió utilizando la técnica de TLC. Este estudio reveló que CTA095 era un potente inhibidor para Etk, con una CI
50 de aproximadamente 60 nM (Figura 2A). La inhibición se observó de una manera dependiente de la concentración. Por otra parte, también podría inhibir CTA095 Src (CI
50 ≈ 120 nm). Sin embargo, Btk y Sí fueron significativamente más resistentes a la inhibición CTA095 con IC
se midió 50 mayor de 10 micras (Figura 2A, Figura S2). La potencia de CTA095 a Etk, Src, Btk y Sí usando TLC (a) para identificar sustrato peptídico
33P fosforilada. TK purificada (20 nM), CTA095 (0, 0,2, y 1 mM), y el sustrato de péptido (YIYGSFK) se incubaron con
33P-ATP en una reacción quinasa. El producto resultante se analizó en una placa de TLC. El efecto de CTA095 a Etk autofosforilación (B) se examinó adicionalmente mediante la incubación de Etk con CTA095 a las concentraciones indicadas en la presencia de
33P-ATP, se midió la radiactividad de Etk utilizando una película sensible a la radiación. La intensidad de la mancha radioactiva se midió usando un densitómetro. Columnas, significan; bares, desviación estándar, n = 3.
La familia Btk de tirosina quinasas no receptoras se caracteriza por la presencia de un sitio de autofosforilación en el dominio no catalítico Src de homología 3 (SH3). Por lo tanto, también es importante para determinar la capacidad de CTA095 para inhibir la autofosforilación Etk. Por lo tanto, un
se estableció vitro
Etk ensayo de autofosforilación en en la que se purificó Etk se mezcló con CTA095 en presencia de
33P-ATP. Después de 30 min, la reacción se terminó, y las muestras se cargaron en un gel de SDS-poliacrilamida para electroforesis. Después del secado, el gel se analizó con un phosphoimager. La Figura 2B muestra que CTA095 fue capaz de inhibir la autofosforilación Etk de una manera dependiente de la concentración.
Además de las tirosina quinasas de la familia Btk, la actividad inhibidora de CTA095 a otras quinasas, incluyendo Lyn, Axl, Mer, EGFR, y Abl, se investigó usando un ensayo de TLC. Como se muestra en la Tabla 1, CTA095 parece tener una fuerte reactividad hacia Etk y Src, mucho más alta que la de cualquier otro quinasas ensayadas.
CTA095 inhibe Etk través de la unión de su región de unión a ATP
para explorar el supuesto mecanismo responsable de la inhibición por Etk CTA095, se llevaron a cabo de conexión dinámica molecular y estudios. Estos estudios predicen que CTA095 interactúa con la parte posterior de su bolsillo de la región de unión de ATP. Esta bolsa de unión está formada por los residuos en el bucle rico glicina, T489 'guardián', y la región bisagra (Figura 3A). El R
3 grupo de CTA095 interactúa con la molécula de gatekeeper Thr489, y también estabiliza la Phe555 de DFG motivo en una posición inactiva "hacia fuera" (Figura 3B). Por otra parte, el grupo central de tres anillos del compuesto interactúa con el Cys496, que es muy singular a la Etk. Sólo 8 quinasas fuera de los 491 quinasas que fueron analizadas en un estudio anterior [29], [30] muestran treonina y cisteína en estas posiciones. De este modo la interacción de CTA095 tanto con Thr489 y Cys496 puede proporcionar con una selectividad única quinasa. También usamos LIGPLOT + para predecir el enlace de hidrógeno y /o interacciones hidrófobas en el bolsillo de unión, y nuestros resultados mostraron que múltiples interacciones hidrofóbicas son responsables de la unión CTA095-Etk (Figura S3A y S3B). Las cadenas laterales que supuestamente interactúan con CTA095 se muestran en la Figura S3C. El análisis de las trayectorias de dinámica molecular también muestran que el R
3 grupo y el núcleo de tres anillos interactúan fuertemente y de manera estable con las cadenas laterales en el bolsillo de unión, mientras que R
1 y partes de R
2 son expuestos al disolvente, y puede servir como objetivos para la mejora adicional de la unión CTA095 y especificidad (Película S1).
(a) vista de la superficie del Etk acoplado a CTA095 después de 20 ns de MD minimización y la relajación. R
3 y el núcleo de tres anillos atracado más profunda entre la región rica en glicina bucle (cian) y la región bisagra (naranja), R
1 y R
2 están expuestos al disolvente. Azul: Helix C; Red: Activación Loop; Verde: DFG motivo (554-556); Cian: bucle rico en glicina; Naranja; Región bisagra. representación (B) animada de predecir las interacciones de CTA095 con el gatekeeper Thr489, DFG (554-556) motivo, y Cys496. CTA095 unión estabiliza Phe555 en la configuración de "fuera", y afecta a la formación de puentes de sal estado activo entre Lys445 y Glu460. Azul: Helix C; Red: Activación Loop; Verde: DFG motivo (554-556); Cian: bucle rico en glicina; Naranja; Región bisagra. Las cifras se generaron utilizando PyMOL.
A diferencia de la unión ETK-CTA095, Src quinasa muestra la unión con CTA095 en el bolsillo del sitio activo formado por la N-lóbulo, C-lóbulo y el bucle de activación. CTA095 en su posición acoplada abarca los residuos Asp404 y Asn 391, que son ambos importantes para el Mg
2 + y de unión de ATP. CTA095 también interactúa putativamente con el residuo Tyr416 funcionalmente importante, que es parte de la región del bucle de activación (figura S4). En general, creemos que CTA095 bloquea el ATP en el bolsillo de unión a la quinasa Src, e inhibe la unión de ATP en Etk mediante la inducción de cambios conformacionales a través de la parte posterior de bolsillo.
CTA095 inhibe la fosforilación de Etk, Src y las señales de corriente abajo Stat3 y Akt en células de cáncer de próstata
La actividad inhibidora de la fosforilación de CTA095 contra Etk en células intactas se examinó por transferencia de Western. Etk, así como la fosforilación de Src en PC3-Etk (células PC3 transfectadas de manera estable con Etk), las células se inhibió significativamente a 5 micras y 10 mM. La inhibición de Src es probable que el resultado de tanto la inhibición directa por CTA095, así como la disminución de la actividad Etk, que activa Src. Un objetivo selectivo para Etk y Src es STAT3, cuya fosforilación también es inhibida por CTA095. Akt es otro efector aguas abajo importante de Etk, y su fosforilación fue inhibida por CTA095 (Figura 4).
Las células fueron cultivadas en placa de 10 mm a 50% de confluencia y se trataron con CTA095. Las células se recogieron después de 24 h. pEtk, Etk, pSrc, Src, pSTAT3, Stat3, pAkt y los niveles de Akt se midieron utilizando los correspondientes anticuerpos mediante transferencia Western. Uno de los tres experimentos similares representado.
CTA095 preferentemente inhibe el crecimiento de células malignas de próstata
Para determinar el efecto de CTA095 sobre la proliferación, un panel de líneas celulares de cáncer incluyendo LNCAP, CWR22Rv1 , PC3 y la célula de la próstata normal RWPE1 se incubaron con CTA095 y su proliferación se midió usando el ensayo de MTT. CTA095 fue eficaz en la inhibición del crecimiento de células de cáncer de próstata (LNCAP, CWR22Rv1 y PC3), mientras que la célula normal de la próstata inmortalizada RWPE1 era más resistente a CTA095 (Figura 5), probablemente debido a la "adicción" a la señal Etk por las células de cáncer de próstata , como se muestra anteriormente [11].
las células se sembraron a 5.000 células /pocillo en placas de 96 pocillos durante la noche y se trataron con CTA095 a las concentraciones indicadas. La viabilidad celular se midió usando el ensayo MTT después de 72 h. puntos, significan; bares, desviación estándar, n = 3.
CTA095 induce la autofagia en las células del cáncer de próstata
Anteriormente puso de manifiesto que el AZD0530 inhibidor de Src induce la autofagia en las células del cáncer de próstata, lo que contribuye a la apoptosis la resistencia y disminuye la eficacia del inhibidor de Src [16]. Para determinar si CTA095 puede desencadenar la autofagia, las células PC3 transfectadas de manera estable con GFP-LC3 se trataron con CTA095, a continuación, se examinan bajo un microscopio de fluorescencia. Después de 24 h de tratamiento con CTA095, estas células produjeron extensa morfología "puntos lagrimales" autophagosome distinto, mientras que el tratamiento con vehículo no lo hizo (Figura 6A). La capacidad de CTA095 para inducir la autofagia en células PC3 se confirmó adicionalmente mediante la conversión de endógeno LC3-I a LC3-II formas (Figura 6B). Por lo tanto, como el inhibidor de Src de tirosina quinasa, la inhibición de Etk también induce la autofagia.
Las células fueron cultivadas en placa de 6 pocillos a 50% de confluencia y se trataron con CTA095. La autofagia se visualizó mediante GFP-LC3 "puntos lagrimales" (A) y de inmunotransferencia de las isoformas endógena LC3 (B). Todos los experimentos se llevaron a cabo 24 h después del tratamiento.
CTA095 induce la apoptosis en células de cáncer de próstata
Para determinar si la inhibición del crecimiento inducida por CTA095 en células PC3 era debido a la apoptosis, el flujo de análisis de citometría se llevó a cabo. Tras el tratamiento con CTA095 durante 24 h, una acumulación dependiente de la dosis de un "sub-G1" fracción se observó mediante la tinción de PI (Figura 7A). Los datos basados en la reactividad Anexina-V también indicaron un aumento dependiente de la dosis de la apoptosis de las células PC3 después del tratamiento con CTA095 (Figura 7B). Más investigación indicó que el tratamiento de células PC3 con CTA095 resultó en una activación dependiente de la dosis de caspase3 /7 (Figura 7C) y la caspasa 9 (Figura 7D). Por lo tanto, en contraste con la AZD05350 inhibidor de Src, este inhibidor Etk induce un nivel significativo de apoptosis, a pesar de su estimulación de la vía de la autofagia. Más interesante, células 293 (ETK negativo) son resistentes a inducir la apoptosis por CTA095, lo que indica la especificidad de este compuesto a Etk (Figura S5). Como se verá más adelante, Etk controla directamente la vía de supervivencia, sin la cual, aparentemente, puede anular el efecto protector de la autofagia. Como resultado, la apoptosis inducida CTA095 puede mejorarse aún más por un bloqueo autofagia (ver abajo).
células PC3 se sembraron a 10
6 células /ml (2 ml) en una placa de 6 pocillos durante la noche y después se trató con CTA095 a las concentraciones indicadas durante 24 h. la detención del ciclo celular se analizó mediante tinción con PI (A). La apoptosis se analizó usando Anexina-V kit de detección de FITC apoptosis (B). La activación de caspasa 9 se midió mediante Western blot (D). Para la actividad de la caspasa 3/7, las células PC3 se sembraron a 5000 células /placa de pocillos en 96 bien durante la noche y tratados con CTA095 a 0-10 mu M durante 24 h. actividades de la caspasa-3/7 se midieron usando la caspasa-3/7 kit Apo-ONE homogéneo de ensayo (Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante. Columnas, significan; bares, desviación estándar, n = 3. 5 M y 10 M son significativamente diferentes de 0 (M *, P & lt; 0,05, ANOVA de una vía con la prueba de Tukey para el par sabia comparación) guía empresas
CTA095. inhibe la formación de tubo HUVEC celular y la migración de células de cáncer de próstata
Etk es altamente expresado en las células endoteliales y demostrado estar involucrados en la angiogénesis [31]. Para investigar la capacidad de CTA095 para inhibir la angiogénesis, se examinó la formación del tubo vascular de las células endoteliales HUVEC después del tratamiento con CTA095. Como era de esperar, la formación de tubos de células HUVEC fue interrumpido por CTA095 (Figura 8A). "La curación de heridas" para explorar la posibilidad de CTA095 para inhibir la migración de células, las células PC3 se midió después del tratamiento con CTA095. "Cicatrización de la herida" como se muestra en la figura 8B, de las células PC3 se inhibió en gran medida por CTA095 después de 48 h. Estos resultados sugieren que CTA095 tiene la capacidad no sólo para suprimir el crecimiento de células de cáncer de próstata, sino también para reducir la angiogénesis.
Inhibición de la formación vascular tubo de células endoteliales HUVEC (A) y la inhibición de la migración (cicatrización de heridas) de células de cáncer de próstata humano PC3 (B) por CTA095. células HUVEC (A) fueron la cabeza en mitrogel y tratados con CTA095 (0 y 5 mM) durante 6 h. la formación de tubos vasculares se visualizó usando microscopio. (B) células PC3 se cultivaron en placa de 6 pocillos a 60% de confluencia. A continuación, las heridas se hicieron y se trataron con CTA095 (0 y 5 M). La migración celular (cicatrización de heridas) se visualizó bajo el microscopio en los tiempos indicados.
CTA095 como un sensibilizador de quimioterapia-
Nuestros estudios iniciales indicaron que CTA095 tiene buena citotoxicidad hacia un panel de próstata Células cancerígenas. Para examinar si Etk y Src inhibidor dual funciona efectivamente como un sensibilizador de la quimioterapia, las células PC3 se co-tratadas con CTA095 y paclitaxel (PTX) (2 ng /ml), o la cloroquina inhibidor de la autofagia (CQ) (10 mM). La inhibición del crecimiento se determinó utilizando un ensayo MTT después de 72 h. Curiosamente, un efecto sinérgico de CTA095 con PTX o CQ a las células de cáncer de próstata se observó (Figura 9). Esto sugiere que CTA095 es un sensibilizador de la quimioterapia, y el bloqueo de la autofagia por CQ promueve CTA095 la muerte celular inducida.
Inhibición del crecimiento de CTA095 y en combinación con 10 mM de cloroquina (CQ), o 2 ng /ml de paclitaxel (PTX ) a la PC3 células humanas de cáncer de próstata. Las células se sembraron a 5.000 células /pocillo en placas de 96 pocillos durante la noche y tratados previamente con los correspondientes compañeros de tratamientos durante 1 h, después se trató con 2,5 M CTA095. La viabilidad celular se midió usando el ensayo MTT después de 72 h. Columnas, significan; bares, desviación estándar, n = 3.
CTA095nano inhibe el crecimiento tumoral in vivo de xenoinjertos PC3
Dado el
in vitro
actividad de CTA095 contra las células de cáncer de próstata, es importante validar estos resultados
in vivo
. Desde CTA095 es muy insoluble en agua, formulamos CTA095 en micelas nano. Este micela fue desarrollado en nuestro laboratorio y se ha utilizado con éxito para formular fármacos hidrófobos tales como paclitaxel y vincristina [32], [33].