Extracto
cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) es una neoplasia pulmonar altamente agresivo con los resultados clínicos extremadamente pobres y no hay tratamientos específicos aprobados. Para dilucidar los mecanismos responsables de la conducción del fenotipo CPCP con la esperanza de revelar nuevas dianas terapéuticas, se estudió el número de copias y los perfiles de metilación de SCLC. Encontramos interrupción de la vía E2F /Rb era una característica prominente desregulado en el 96% de las muestras investigadas SCLC y está fuertemente asociada con una mayor expresión de EZH2, un miembro de oncogén y el núcleo de la Polycomb represivas complejo 2 (PRC2). A través de su función catalítica en el complejo PRC2, EZH2 normalmente funciona para silenciar epigenético genes durante el desarrollo, sin embargo, de manera aberrante silencia genes en cánceres humanos. Se proporcionan evidencia para apoyar esa EZH2 es funcionalmente activa en tumores SCLC, ejerce funciones pro-tumorigénicos
in vitro
, y se asocia con los perfiles de metilación aberrante de genes diana PRC2 indicativos de un "de células madre como" perfil hypermethylator en los tumores de SCLC. Además, desmontables lentiviral mediada de EZH2 demostró una reducción significativa en el crecimiento de líneas celulares de SCLC, lo que sugiere EZH2 tiene un papel clave en la conducción de la biología SCLC. En conclusión, nuestros datos confirman el papel de EZH2 como un oncogén crítico en SCLC, y prestan apoyo a la priorización de EZH2 como una posible diana terapéutica en la enfermedad clínica
Visto:. Coe BP, Jue KL, Aviel- Ronen S, Vucic EA, Gazdar AF, Lam S, et al. (2013) La desregulación Genómica de la E2F /Rb Camino conduce a la activación del oncogén EZH2 en el cáncer de pulmón de células pequeñas. PLoS ONE 8 (8): e71670. doi: 10.1371 /journal.pone.0071670
Editor: P. Srikumar Chellappan, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 14 Enero, 2013; Aceptado: 2 Julio 2013; Publicado: 15 de agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Coe et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos canadienses de Investigación en Salud (CIHR). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de pulmón microcítico (SCLC) es una neoplasia pulmonar altamente agresivo con un resultado clínico extremadamente pobre, que ha mejorado muy poco en los últimos 25 años [1]. Debido a su curso clínico único, SCLC a menudo se realizaron usando un sistema de estadificación clínica independiente del sistema estándar TNM utilizado para la mayoría de los cánceres, incluyendo todas las no pequeñas de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), ya sea como limitado (33%) o extensa (67% ) la enfermedad en etapa basada en el grado de diseminación del tumor. Los pacientes con enfermedad en estadio localizado tienen una supervivencia media de 18 meses, mientras que para los pacientes con extensa etapa es sólo 9 meses [2] - [4]. Debido a su naturaleza altamente agresiva, la cirugía se realiza con poca frecuencia y la quimioterapia con o sin radioterapia concurrente es el tratamiento habitual. A pesar de SCLC inicialmente se presenta como una enfermedad quimio-sensible, casi todos los pacientes sufren una recaída después del tratamiento inicial, y no hay terapias dirigidas han sido aprobados para la SCLC hasta la fecha [5] - [9]. Por lo tanto se necesitan con urgencia nuevas dianas para la intervención terapéutica para esta enfermedad
.
La identificación de oncogenes que se activan selectivamente y que funcionalmente unidad de fenotipos tumorales, son blancos terapéuticos ideales para los pacientes que albergan estas aberraciones. En CPNM, el descubrimiento de este tipo de eventos ha llevado al desarrollo y aplicación de quimioterapias específicas, que se traduce en una mejor supervivencia libre de progresión y global para el CPNM para pacientes seleccionados [10]. Los últimos perfiles de genómica hacia este objetivo en el CPCP han descubierto miles de mutaciones y supresiones, que se producen en múltiples vías supresores de tumores (por ejemplo.
TP53
,
RB1
,
PTEN
,
EPHA7
), y genes implicados en la modificación de la cromatina (por ejemplo.
CREBBP
,
MLL
), así como las amplificaciones en los genes controladores cáncer SCLC putativo, como
SOX2
[5], [8]. Estos resultados son significativos y pueden conducir al desarrollo y aplicación de nuevas terapias dirigidas a los subgrupos muy específicos de pacientes con CPCP, sin embargo, la elucidación de un blanco activado más ubicua en SCLC sería aún más beneficioso.
inactivación nivel de ADN del TSG
RB1
es casi universal en el CPCP. RB1 normalmente inhibe la proliferación mediante la inhibición de los factores de transcripción E2F. miembros de la familia E2F son comúnmente sobreexpresa en varios tumores, incluyendo SCLC [11] - [15]. El trabajo por nosotros y otros han identificado las ganancias a nivel de ADN de
E2F Buscar miembros de la familia en líneas celulares de SCLC, tumores y modelos murinos [5], [16]. EZH2, un miembro central de la Polycomb represivas complejo 2 (PRC2), será un objetivo del complejo Rb1 /E2F. EZH2 es fundamental para el mantenimiento epigenética de la célula embrionaria "tallo-dad" y el establecimiento de la especificidad de linaje durante el desarrollo normal.
EZH2
Recientemente se ha establecido como un oncogén conductor, en el que está implicado en la hipermetilación aberrante de genes supresores de tumores (TSG) en múltiples tipos de cáncer. La sobreexpresión de EZH2 se ha descrito recientemente en el CPCP, en el que se ha propuesto como una nueva diana terapéutica SCLC [11].
Los mecanismos que subyacen a la EZH2 hiperactividad se han identificado en otros tipos de cáncer e incluyen la mutación de
EZH2
sí que hace que el exceso de activación de sus capacidades de modificación de histona y fenotipos hypermethylator ADN que están asociados con un mal resultado, la resistencia a la quimioterapia y fenotipos tumorales altamente agresivos. Para explorar los mecanismos que impulsan la activación de EZH2 y para confirmar el papel oncogénico de EZH2 en el CPCP, se estudiaron los perfiles de número de copias de 14 tumores SCLC y 14 líneas celulares de SCLC y se evaluó la viabilidad celular después de EZH2 caída. Se encontró que el nivel de ADN interrupción de componentes de la vía Rb E2F /, ya sea por pérdida de
RB1
o amplificación de
E2F
, en el 100% de las muestras investigadas SCLC, que nos pareció fuertemente asociada con el aumento de expresión de EZH2. Confirmamos un papel oncogénico funcional para EZH2 en el CPCP, y un perfil asociado y hypermethylator ADN de los tumores SCLC. Proponemos que la alteración genómica de E2F /Rb conduce a la activación de la EZH2 histona metiltransferasa que funciona como un oncogén en el CPCP, más el apoyo a su promesa de ser una diana terapéutica para pacientes con CPCP.
Métodos
Contratación de la muestra y la matriz de hibridación genómica comparada
Una gran mayoría de los pacientes con CPCP no son candidatos para la cirugía, por tanto, sólo las muestras de biopsia de archivos disponibles. Un panel de 14 fijados en formalina y muestras de tumores SCLC embebidos en parafina se obtuvieron del archivo de la Universidad Health Network (UHN) Departamento de Patología, con un protocolo de estudio aprobado por el Consejo de Ética UHN, que no requiere el consentimiento informado específico para materiales desde antes de 2000 y los pacientes que habían fallecido (Tabla S1). núcleos de tejido fueron seleccionados de las regiones de bloques tumorales que demostraron suficiente pureza para un núcleo de 2 mm. Después de la revisión histológica, las muestras se extrajeron por desparafinación estándar xileno base y proteinasa estándar K protocolo de extracción de ADN basado con la adición de hidrólisis de base (10 minutos 70 C incubación con NaOH 1M volumen ½ seguido por neutralización con un volumen de ½ HCl 1 M) para eliminar cualquier contaminante RNA. CGH array se llevó a cabo en una plataforma susceptible de material de FFPE, y el número de copias llamadas generadas como se describe anteriormente [16], [17].
La cuantificación de E2F y EZH2 niveles de expresión
RT-PCR se realizó utilizando TaqMan ensayos de expresión génica con protocolos estándar en un termociclador rápido ABI 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Los ensayos TaqMan utilizados fueron E2F1 (Hs00153451_m1), E2F2 (Hs00231667_m1), E2F3 (Hs00605457_m1), Rb (Hs00153108_m1), EZH2 (Hs00172783_m1), y 18S ARN (HS99999901_s1). Los valores absolutos de expresión se calcularon para E2F1, E2F2, E2F3 y RB1 al escalar los valores de Ct (gen delta-18) a un valor entre 0 y 1000. Los niveles de proteína de EZH2 y E2Fs en líneas celulares fueron evaluados usando métodos estándar de transferencia Western (Cell señalización anticuerpos primarios:#3147 (EZH2) y#2118 (GAPDH); Santa Cruz anticuerpos primarios: sc-251 (E2F1), SC-632 (E2F2), y SC-878 (E2F3)) [18]. intensidades de las bandas se cuantificaron utilizando el software ImageJ. La inmunohistoquímica (IHC) se llevó a cabo utilizando técnicas estándar con un anticuerpo anti-EZH2 primario (policlonal de conejo, 18-7395, Life Technologies, Grand Island, NY). Las imágenes fueron calificados de acuerdo a la intensidad de la tinción observado en una escala de 0 (bajo) a 3 (alto).
El análisis de metilación del ADN
Se obtuvieron los perfiles de metilación de ADN de 12 tumores SCLC, y 21 de control bronquiales pequeñas vías respiratorias epiteliales (SAE) las muestras utilizando el ensayo de Illumina Infinium metilación humano (HM27). SAE se obtuvieron por el cepillo bronquial durante la broncoscopia de rutina de las vías respiratorias pequeñas (definida como & lt; 2 mm de diámetro) de los individuos sin presencia o historia previa de cáncer de pulmón o la enfermedad pulmonar obstructiva crónica [19]. Las muestras de ADN fueron convertidos bisulfito utilizando el kit EZ Zymo metilación del ADN con bisulfito de conversión (Zymo Research Corporation, Orange, CA) y perfiles HM27 generados como se ha descrito anteriormente [20]. Infinium HM27 metilación Sentrix archivos de matriz (.sdf) and.idat archivos de imagen se carga en Illumina GenomeStudio. Los datos en bruto se exportan y se leen en R: Un Lenguaje y Medio Ambiente de la Computación de Estadística, y corregir el sesgo de canal de color verde rojo y el efecto de la hornada entre múltiples experimentos de metilación, utilizando la lumi paquete de Bioconductor, que aplica una corrección de color y el algoritmo de normalización SSN [21 ]. Las sondas con un Illumina detección por red de p & lt; 0,05, presente en & gt; 58% de los casos en cada grupo fueron retenidos. metilación por ciento por cada sonda se presenta como un valor beta (max (yi, metil, 0) /(max (yi, unmethy, 0) + max (yi, metil, 0)) 100). Se obtuvo una lista de objetivos ligados EZH2 en las células madre embrionarias de ratón a partir de una publicación por Ku
et
al [22]. Los objetivos se alinean con los genes ortólogos humanos utilizando la base de datos del genoma del ratón [23]. Para identificar EZH2 genes específicos que fueron metilados diferencialmente entre SCLC y grupos normales, un pruebas de permutación no paramétricos utilizando 10.000 permutaciones se realizó como se describe por Chari
et al
. [24]. Un valor M se calculó mediante el registro
2 ratio de intensidad de la sonda sobre la sonda de intensidad metilado metilado, y se utiliza como entrada para la permutación de prueba [25]. puntajes de permutación de metilación fueron corregidos para múltiples pruebas utilizando el método de Benjamini y Hochberg (B-H). Los valores promedio beta para los tumores SCLC fueron restados de los valores beta promedio de normal de las vías respiratorias controles para obtener un valor delta β. Hypermethylated y hypomethylated sondas en tumores SCLC fueron definidos como aquellos con valores delta beta & gt; = 0,2 o & lt; = - 0,2, respectivamente. Las sondas que cumplieron con los siguientes criterios:
i
) de permutación B-H corregida p & lt; 0,05,
ii
) un valor delta beta & gt; = 0,2 o & lt; = -0.2 Y
iii
) una desviación estándar (SD) ≤2 dentro de cada grupo, fueron consideradas diferencialmente metilado (DM) entre los tumores SCLC y las vías respiratorias normales.
Correlación entre EZH2 y expresión E2F niveles
Para determinar la asociación entre el
EZH2
y
E2F1
,
E2F2
,
E2F3
, y
RB1
niveles de mRNA expresión en muestras de SCLC, que consultan los datos de expresión públicamente disponible de Peifer et al. [5] y el proyecto de la Línea Celular Sanger del Instituto Broad (broadinstitute.org/cgi-bin/cancer/datasets.cgi). GraphPad Prism 6 se utilizó para calcular los coeficientes de correlación de Spearman entre los
EZH2
y los genes de la ruta de Rb /E2F.
Desmontables de
EZH2 y E2F en líneas SCLC y
E2F
expresión en células HBEC
líneas celulares
293T, HTB-175 y H524 SCLC se obtuvieron de la ATCC y se cultivaron según las instrucciones de la ATCC. Inmortalizadas células epiteliales bronquiales humanas (HBEC) se cultivaron en medios KSFM suplementado con extracto de pituitaria bovina y EGF. plásmidos resistentes lentiviral PLKO-puromicina codifican shRNAs dirigidos
E2F1
,
E2F2
,
E2F3
, y
EZH2
fueron adquiridos de Applied abierto (RHS3979-201768515 , RHS3979-201745380, RHS3979-201745384, y RHS4533-NM_004456). Los lentivirus se generaron como se describe anteriormente [26]. Se determinó la multiplicidad de infección (MOI), tanto para el PLKO (control de vector vacío) y E1 (EZH2 orientación shRNA) de virus utilizando cebadores TaqMan personalizado (hacia delante 5 '- GCGGTGTTCGCCGAGAT - 3' y revertir 5 '- GAGGCCTTCCATCTGTTGCT - 3'). La transfección se realizó como se describe en Lockwood et al [26]. En pocas palabras, para cada línea y el virus se infectaron 150.000 células (utilizando una MOI de 15 en busca de virus EZH2) en medio suplementado con 2 ug /ml de polibreno. El medio de crecimiento se complementó con 1 ug /ml de puromicina para seleccionar las células infectadas. Para evaluar la viabilidad de
EZH2
knockdown relación con las células controles ensayos de MTT se realizaron como se describe anteriormente [26].
E2F1 gratis (EX-Z8212-M46),
E2F2 gratis (EX-F0378-M46),
E2F3 gratis (EX-T0731-M46), y el control de la luciferasa (EX -hLUC-M46) ORF clones de expresión se adquirieron de GeneCopoeia. experimentos de expresión transitoria se realizaron utilizando Lipofectamina LTX siguiendo las instrucciones del fabricante. Eficiencia de E2F desmontables y sobreexpresión, y sus efectos sobre los niveles de expresión EZH2 se determinó mediante Western Blot.
Resultados y Discusión
Genómica de perfiles de tumores SCLC, y la comparación con líneas celulares de SCLC
los detalles de los perfiles de número de copias de ADN de estos tumores a lo largo de 14 líneas celulares de SCLC no relacionadas se presentan en la Figura S1, y están disponibles en el gene Expression Omnibus de datos. Sorprendentemente, se observó recurrencia de copias de ADN alteraciones en el número de tumores SCLC, incluidas las regiones que abarcan los principales candidatos de la vía de nuestro estudio anterior línea celular como
TCF4 gratis (18q21),
STMN1 gratis (18q21) y
E2F2 gratis (1p36) [16].
El E2F /Rb Camino está desregulado Específicamente en SCLC
sobre la base de las observaciones anteriores por nosotros y otros, la hipótesis de que el ciclo celular la activación en SCLC se puede producir en la medida de corriente abajo como los factores de transcripción que regulan la progresión del ciclo celular. La vía del retinoblastoma tiempo se ha establecido como un objetivo clave de la desregulación en el CPCP.
RB1
se pierde con frecuencia o mutado (60-90%) en el CPCP y demuestra una expresión reducida en la mayoría de los casos [5], [8], [11] - [13], [27]. Una función principal de Rb es su inhibición normal de los factores de transcripción E2F. Cuando Rb1 se inactiva por fosforilación, proteínas E2F son libres de funcionar como factores de transcripción que activan una colección de factores de progresión del ciclo celular. La familia E2F de los genes se divide en la activación (E2F1, E2F2, E2F3) y los miembros inhibidoras (E2F4, E2F5) que interaccionan físicamente con Rb1 [15], [27] - [31].
La evidencia reciente ha demostrados los genes E2F también pueden ser objetivos primarios de la desregulación. Otros estudios han detectado altos niveles de expresión de E2F1 y E2F3 en varios tumores, incluyendo SCLC [11] - [15]. Además, Peifer et al observaron la amplificación de ADN de alto nivel de
E2F2 Hoteles en modelos de ratón de SCLC [5]. Tomados en conjunto con nuestras propias observaciones de
E2F2
ejemplar número ganancia y más específicamente en la expresión CEP líneas celulares y validación de
E2F2
copia alteraciones en el número de tumores SCLC, decidimos analizar más a fondo esta vía en el contexto del número de copias y la desregulación transcripcional.
E2F /Rb se centró el análisis del número de copias en líneas celulares de SCLC (n = 14) y los tumores (n = 14) reveló ganancia de al menos una de la activación
E2F
s o pérdida de
RB1 Hoteles en 14/14 muestras tumorales y líneas celulares 13/14 (96% de todas las muestras; IC del 95%: 80% a 100%) (Figura 1A). Esto es concordante con los perfiles genómicos publicados recientemente por Peifer et [5] al, que nos pareció exhibir el mismo patrón de alteración en 56/63 muestras de tumores (que aplican umbrales de número de copia de & lt; 1,7 para la pérdida de genómica y & gt; 2,3 para ganancia genómico a los datos segmentados identifica eventos en 84% de las muestras, 95% CI 72% a 92%). Aunque el límite de confianza no incluye el 100% en el estudio Peifer y otros, vale la pena señalar que en los 29 casos con datos de la secuencia, el 100% de los casos tenía o
RB1
deleción o mutación truncar un evento [5 ]. Esto, en combinación con las estimaciones previas de
RB1
tasas de mutación en SCLC (60% a 90%) [32], [33] sugiere que la E2F /interrupción RB1 es casi universal en los casos de SCLC.
numéricos (a) el ejemplar alteraciones de los miembros vía específica E2F /Rb en líneas celulares de SCLC (arriba) y los tumores (parte inferior). El sombreado verde representa la pérdida, mientras que el rojo representa la ganancia y negro representa ningún cambio. (B) Expresión de los miembros de la vía de E2F /Rb por RT-PCR. Los datos se presentan como caja de parcelas de los niveles de expresión absolutos derivados de los datos de PCR normalizada escala. La línea central en cada caja representa la mediana, mientras que el cuadro representa el rango intercuartil, con las barbas que se extiende hasta el último punto de datos no atípico (definida como 1,5 × el rango intercuartil). Los valores atípicos se representan como cruces. (C) la sobreexpresión significativa de EZH2 se observó en SCLC comparación con las muestras de NSCLC, coincidiendo con el exceso de activación de la vía E2F /Rb. (D) IHC se realizó usando técnicas estándar con un anticuerpo anti-EZH2 primaria y se tomaron imágenes a 200 × magnificación. Se demuestran los ejemplos típicos de expresión de la proteína EZH2 en el epitelio bronquial, carcinoides y tumores SCLC.
En tiempo real PCR análisis de los niveles de transcripción demostró un sorprendente patrón de activación de E2F, ya que al menos dos miembros de la activación de E2F eran sobreexpresado en un 10 × sus niveles normales en todas las líneas de células SCLC, mientras Rb1 ARNm era muy reducido en la mayoría de las líneas celulares de SCLC (Figura 1B y Tabla S2). Estos niveles de desregulación son significativamente mayores que los observados para un panel de líneas celulares de cáncer basado en una cola de Mann-Whitney U test, el apoyo a la naturaleza específica de estos eventos SCLC (SCLC vs CPNM:
E2F1
p = 0,0034,
E2F2
p = 2.310 × 10
-5,
E2F3
p = 1.744 × 10
-5,
Rb1
p = 0,0078; figura S2). La desregulación de las transcripciones E2F y Rb1 es complementario a los últimos resultados de Byers et al que detectaron SCLC nivel de proteína específica desregulación de Rb y E2F1 en un estudio de perfiles proteómicos de SCLC, NSCLC y líneas de células pulmonares normales [11].
en conjunto, parece que la ruta de Rb está desregulado no sólo por la pérdida de Rb copias /función, sino también a través de las ganancias genómicas de los factores de transcripción E2F en SCLC. En conjunto, esto sugiere que la vía de E2F /Rb se activa en todas las muestras de SCLC en este estudio, ya sea por pérdida de
RB1
o copiar ganancia de un
E2F
gen miembro. Sobre la base de nuestro análisis de los datos externos, esto es cierto en las cohortes de tumores SCLC clínicos adicionales [5].
La sobreexpresión del E2F /Rb Objetivo EZH2
El modelo llamativo de E2F desregulación /Rb en las líneas y los tumores de células de SCLC nos llevó a examinar los genes aguas abajo de los factores de transcripción E2F. Uno de los objetivos de la vía de E2F /Rb que recientemente ha sido descrito como un oncogén en múltiples tipos de cáncer es
EZH2
. EZH2 es un gen del grupo Polycomb (PcG) con un papel en el desarrollo embrionario y la diferenciación a través de la regulación epigenética transcripcional de los genes críticos para el mantenimiento de las propiedades madre, de células embrionarias y el establecimiento de linaje especificidad [34] - [36]. Se controla directamente la metilación del ADN de varios genes diana, incluyendo
WNT1
, corroborando estudios anteriores en los que se observaron múltiples impactos genéticos para cerrar la vía Wnt en el CEP líneas celulares [16], [36]. EZH2 sobreexpresión se ha observado en muchos subtipos de cáncer, incluyendo: próstata, mama, vejiga, cáncer de pulmón de células escamosas y carcinomas hepatocelulares [37] - [44]. En el caso de cáncer de pulmón de células escamosas, la expresión EZH2 se ha observado en las células escamosas displásicas y tumores, pero no en las células epiteliales bronquiales normales, lo que sugiere
EZH2
activación también podría ser un evento temprano en NSCLC [39]. expresión Adicionalmente, los estudios de varios tipos de cáncer se han relacionado con la agresividad de EZH2, la invasión y la resistencia a cisplatino que implican un papel para EZH2 en el comportamiento agresivo del tumor [43], [45] - [47]
En nuestro estudio,. análisis de la expresión de EZH2 en el CPNM y CEP líneas celulares reveló un estado notable de la hiperactivación en el CPCP en comparación con las células NSCLC (Mann-Whitney U test, p = 4,52 × 10
-6; Figura 1C). Nuestros resultados sugieren que EZH2 es, en promedio, 42 veces sobreexpresa en líneas SCLC en comparación con 13 veces sobreexpresa en líneas celulares de NSCLC. Para confirmar si la sobreexpresión de EZH2 también está presente en los tumores, se analizaron los datos de un estudio conjunto de expresión de ADNc independientes [13], que perfila un conjunto independiente de 11 líneas celulares y un panel de 15 tumores SCLC primarias, además de 12 adenocarcinomas (subtipo NSCLC). Aunque los niveles exactos veces el cambio no eran directamente equivalente (posiblemente debido a las diferencias entre la RT-PCR y cDNA microarray rango dinámico), la tendencia en los niveles de expresión es sorprendentemente similar a nuestro estudio, con una cantidad significativamente más alta expresión de EZH2 en líneas celulares de SCLC y tumores en comparación con las muestras de NSCLC (Figura S2). Esto es consistente con los resultados de Byers et al que recientemente se observó una mayor expresión de la proteína EZH2 en líneas celulares de SCLC [11].
Para confirmar que los niveles de ARNm se traducen en un aumento de los niveles de proteína en los tumores clínicos, se realizó inmunohistoquímica en una array de tejidos de tumores SCLC, carcinoide y los tejidos pulmonares normales, y observe un aumento de la tinción de EZH2 en las muestras tumorales de SCLC (n = 13), en comparación con los carcinoides, y el epitelio bronquial (Figura 1D, el cuadro S3). Bracken et al [38] sugiere que tanto
E2F
la amplificación directa de ADN y
RB1
alteración puede conducir a la desregulación de la expresión EZH2. El EZH2 significativo sobre-expresión que hemos descrito en SCLC no es probable debido a las ganancias de número de copia bajo nivel que observamos en las líneas celulares de SCLC y tumores, ya que estudios previos han sugerido que, en promedio, la ganancia de 2 veces el número de copias está asociado con un promedio de 1,5 veces el cambio en los niveles de ARNm asociados [38], [48], lo que sugiere que la sobreexpresión de EZH2 en el CPCP, está controlado principalmente por la interrupción E2F /Rb, en lugar de alteraciones del número de copias directas.
Para evaluar aún más nuestra hipótesis de que E2F /Rb alteración conduce a la activación EZH2, se evaluaron las asociaciones entre EZH2 y E2F /RB1 niveles de expresión de mRNA en dos bases de datos públicas de SCLC. En un conjunto de datos de microarrays de 56 líneas SCLC, hemos encontrado correlaciones positivas entre EZH2 y E2F1 (r
2 = 0,3957, p = 0,0013) y E2F2 (r
2 = 0,3124, p = 0,0095), y no hay correlaciones significativas entre EZH2 y E2F3 (r
2 = 0,1689, p = 0,1067) o RB1 (r
2 = 0,0712, p = 0,6989) (Tabla S4). En 15 tumores SCLC con datos de RNA-secuenciación, se observó una fuerte correlación positiva entre EZH2 y E2F1 (r
2 = 0,5179, p = 0,0253) y E2F2 (r
2 = 0,6357, p = 0,0064), y no hay correlaciones significativas entre EZH2 y E2F3 (r
2 = -0.1571, p = 0,7166) y RB1 (r
2 = -0.1929, p = 0,2450) (Tabla S4). El hecho de que RB1 no se correlacionó significativamente con la expresión de E2F en estos conjuntos de datos probablemente refleja la baja expresión general de RB1 a través de estas muestras, y el papel de la fosforilación en función de RB1, que no se contabiliza en estos datos. Estos resultados proporcionan una prueba más de que la activación de E2F1 y E2F2 está asociada con la activación de EZH2.
efecto de la manipulación E2F en EZH2 Expresión
A continuación realizó desmontables experimentos E2F para evaluar directamente las consecuencias de E2F la modulación de los niveles de expresión EZH2 en SCLC. caídas de E2F1, E2F2 ShRNA-mediada, y E2F3 mostró reducciones en los niveles de proteína EZH2, encajando con nuestra hipótesis de que E2Fs modulan la expresión de EZH2 en el CPCP (Figura S3 A). Además, hemos realizado experimentos de sobreexpresión en células epiteliales bronquiales humanas inmortalizadas (HBEC) [49], que son un modelo no maligno utilizado para estudiar la patogénesis molecular de cáncer de pulmón de células no pequeñas, ya que hasta la fecha, no hay no maligno neuroendocrino modelo disponible en la actualidad para evaluar el potencial de transformación de los genes en un tipo específico de célula precursora SCLC. Hemos observado un aumento de la expresión de EZH2 a la inducción de E2F2 (Figura S3 B). Los efectos de la E2F desmontables y sobreexpresión en los niveles de EZH2 tomadas junto con las correlaciones positivas que observamos entre E2F y los niveles de expresión de ARNm de EZH2 sugieren que la activación de E2Fs conduce a un aumento correspondiente en los niveles de EZH2. Estas observaciones apoyan la hipótesis de que el aumento de expresión de los miembros de E2F conduce a la activación de EZH2 en el CPCP.
Objetivos
PRC2 se hypermethylated en SCLC
La IDF ha sido de gran interés en muchos tipos de tumores en los últimos años , debido a su papel en el silenciamiento de transcripcionalmente la expresión de genes supresores de tumores a través de remodelación de la cromatina y la dirección de la metilación del ADN. proteínas PcG forman varios complejos de proteínas que reprimen la transcripción a través de la modificación posterior a la traducción de las histonas, tri-metilación específica de la lisina 27 de la histona en 3 (H3K27me3). Una alta proporción (50-80%) de los genes que están aberrantemente epigenetically silenciada por el promotor hipermetilación del ADN en la mayoría de los cánceres humanos son los marcados por la Polycomb represivas Complejo 2 (PRC2) durante la embriogénesis, donde las marcas de las histonas represivas funcionan para "apagar" célula determinar el destino genes, otorgando capacidades de auto-renovación no diferenciadas a células madre embrionarias [50] - [53]. Teniendo en cuenta que la EZH2 es el miembro catalítica crítica del complejo PRC2, y la capacidad de este complejo para reclutar a las enzimas
de novo
ADN (metilación DNMT3a /b), que estaban interesados en determinar si el promotor CpG metilación en SCLC tumores ocurrido preferentemente en genes marcados por PRC2 en las células madre embrionarias. Por lo tanto, se analizó el estado de metilación de EZH2-PRC2 genes diana en las muestras de tumor primario [22]. Los datos están disponibles en el Gene Expression Omnibus.
Se encontró una proporción abrumadora de determinados genes por EZH2 y el complejo PRC2 que se hypermethylated en tumores SCLC en comparación con los epitelios de las vías respiratorias normales de individuos sanos (Figura 2). Después de aplicar criterios de filtrado estrictos, se identificaron 2756 sondas hypermethylated (valor de p & lt; 0,05, delta β & gt; = 0,2), y 1372 hypomethylated sondas (valor de p & lt; 0,05, delta β & lt; = -0.2) en el CPCP en relación con las vías respiratorias epiteliales sana Células. Fuera de las sondas 3497 asociados con genes conocidos por ser blancos EZH2 de células madre embrionarias [22], encontramos 18% (640 sondas) de estos genes para ser hypermethylated, en comparación con sólo el 3% (93 sondas) hypomethylated en el CPCP. Sorprendentemente, EZH2-PRC2 genes diana representaron el 23% de todas las sondas hypermethylated en estos tumores en general. En comparación con los blancos no PRC2, el enriquecimiento de los genes diana PRC2 en nuestro conjunto de la sonda hypermethylated fue estadísticamente significativa (prueba exacta de Fisher, p = 2,2 × 10
-16). Estos datos sugieren que, análogo al trabajo de varios otros grupos en una variedad de tipos de cáncer [50] - [55], SCLCs muestran un perfil de la hipermetilación del promotor muy concordantes con el patrón de genes silenciados en las células madre embrionarias por el complejo PRC2. Proponemos que en el CPCP, EZH2 causada por la sobreexpresión resultados nivel del ADN de E2F /Rb vía de interrupción en el reclutamiento de enzimas metiladoras
de novo de ADN y el establecimiento de un "de células madre como" perfil hypermethylator.
valores beta de metilación de 1683 genes específicos para PRC2 H3KMe3 en células madre embrionarias de ratón se representan gráficamente para cada grupo. Estos genes mapeados 1683 a 3497 sondas Illumina HM27, de los cuales se hypermethylated 18% (640 sondas) y 3% (93) son sondas hypomethylated en tumores SCLC en relación con las vías respiratorias normales. Los genes específicos para H3KMe3 en las células madre embrionarias de ratón por EZH2 y el complejo PRC2 se hypermethylated preferentemente tumores SCLC que justifiquen la EZH2 es funcionalmente activa en SCLCs.
EZH2 es requerido para un rápido crecimiento en líneas celulares de SCLC
Seguidamente, evaluó el potencial oncogénico de EZH2 en el CPCP, utilizando caídas lentiviral mediada en dos líneas celulares de SCLC (H524, HTB175). Ambas líneas de derribo demostraron una reducción notable en el crecimiento en comparación con los controles vacíos vector (prueba t de Student, P & lt; 0,05) (Figura 3). Corroborar nuestros resultados, un estudio reciente con perfiles proteómicos de líneas celulares de SCLC demostró la sobreexpresión de EZH2 en el CPCP y demostró una reducción del crecimiento en células H69 sobre siRNA desmontables transitoria [11]. Las funciones pro-proliferativos y anti-diferenciación de EZH2 son consistentes con la presentación clínica y patológica altamente agresivo y no diferenciada de SCLC. El fuerte carácter pro-proliferativa de EZH2, también podría explicar en parte la tolerancia de las células de SCLC a niveles tan elevados de E2F ARNm, ya que algunas proteínas E2F son capaces de funciones anti-proliferativos y pro-apoptóticas cuando se sobreexpresa [15], [28] -. [30], [38]
(A, e) Para confirmar desmontables de EZH2, ARN fue extraído de las líneas transfectadas y se realizó qPCR. Expresión en líneas desmontables (E1) se muestra en relación con los controles PLKO. (B, F) Confirmación de los niveles de proteína de EZH2 en las líneas desmontables se realizó utilizando métodos de transferencia Western estándar. Tanto qPCR y transferencia Western verificaron los niveles de EZH2 se redujeron en más del 50% en las células H524 HTB-175 y sobre knockdown mediada por shRNA. (C, D, G, H) Para evaluar la viabilidad de
EZH2
caída relación con las células controles se realizaron ensayos de MTT. Desmontables de EZH2 causó una disminución significativa y reproducible de la viabilidad celular en ambas líneas celulares de SCLC (t-test, p & lt del estudiante; 0,05).
Conclusiones
A partir de este trabajo, se propone que la vía de E2F /Rb no es interrumpido sólo a través de la pérdida o mutación de Rb, sino también a través de ADN ganancias número de copias de los factores de transcripción E2F. Proponemos que este mecanismo impulsa la sobreexpresión específica de varios genes diana incluyendo EZH2, lo que resulta en la activación del complejo PRC2 y la promoción de la metilación aberrante en SCLC. Nuestros resultados corroboran los estudios anteriores y tienen fuertes implicaciones para el tratamiento del SCLC.
rutas mitogénicas múltiples, tales como MAPK desregulación también son capaces de conducir la función E2F en ausencia de golpes ascendentes específicos en SCLC, tales como la frecuente