Extracto
Sumoylation es una vía de modificación de la proteína ubiquitina después de la traducción que regula importantes procesos celulares incluyendo la estructura de los cromosomas, la función del cinetocoro , la segregación de cromosomas, la organización nuclear y subnuclear, transcripción y reparación del daño en el ADN. Hay evidencia creciente de que la vía de SUMO se dysregulated en el cáncer, aumentando la posibilidad de que la modulación de esta vía puede tener un potencial terapéutico. Para investigar la importancia de la vía de SUMO en el contexto de la proliferación de células de cáncer y el crecimiento tumoral, se aplicó ARN de horquilla corta basados en lentivirus (shRNA) para derribar genes de la vía sumo en células de cáncer humano. shRNAs para SAE2 y UBC9 redujo la actividad SUMO conjugación y inhibió la proliferación de células de cáncer humano. Para ampliar estas observaciones, hemos generado líneas doxiciclina inducible shRNA condicionales en células para SAE2 para lograr la caída aguda y reversible SAE2. Condicional desmontables SAE2 en células U2OS y HCT116 se desaceleró el crecimiento celular
in vitro
, y SAE2 caída inducida resultados múltiples terminales, incluyendo la apoptosis, endorreduplicación y la senescencia. células multinucleadas se convirtieron en senescente y se tiñeron positivas para el marcador de senescencia, SA-β Gal, y muestran niveles elevados de p53 y p21. En un intento de explicar estos fenotipos, se confirmó que la pérdida de actividad de la vía SUMO conduce a una pérdida de la topoisomerasa sumoylated IIα y la aparición de puentes de cromatina que pueden perturbar la citocinesis adecuada y llevar a multinucleadas. Por otra parte, desmontables de SAE2 induce la interrupción de los cuerpos nucleares de PML que puede promover aún más la apoptosis o senescencia. En un
in vivo
HCT116 modelo de tumor de xenoinjerto, condicional desmontables SAE2 fuerte retraso del crecimiento tumoral. Estos datos demuestran que se requiere la vía SUMO para la proliferación de células cancerosas
in vitro
y el crecimiento tumoral
in vivo
, que implican a la vía SUMO como una diana terapéutica potencial de cáncer
.
cita: El X, J Riceberg, Pulukuri SM, Grossman S, V Shinde, Shah P, et al. (2015) Caracterización de la pérdida de la función SUMO Pathway en las células cancerosas y la proliferación tumoral. PLoS ONE 10 (4): e0123882. doi: 10.1371 /journal.pone.0123882
Editor Académico: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, Estados Unidos |
Recibido: 24 Noviembre 2014; Aceptado: February 23, 2015; Publicado: 10 Abril 2015
Derechos de Autor © 2015 He et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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Financiación:. Takeda Pharmaceuticals International Co. proporcionó apoyo financiero completo para el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, la preparación del manuscrito, y los salarios de los autores XH, JR, SP, SG, VS, PS, JB, LD, JN, y NB, durante el tiempo en que se llevaron a cabo estudios. Las funciones específicas de estos autores se articulan en la sección 'autor' contribuciones
Conflicto de intereses:. Takeda Pharmaceuticals International Co. proporcionan apoyo financiero completo para el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, preparación de el manuscrito y los salarios de los autores XH, JR, SP, SG, VS, PS, JB, LD, JN, y NB, durante el tiempo en que se realizaron los estudios. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
Sumoylation es un proceso de modificación de la proteína ubiquitina conservadas evolutivamente que regula un conjunto diverso de procesos biológicos [1, 2]. SUMO (pequeño modificador relacionado ubiquitina) las proteínas son ~ 10 kD proteínas tipo ubiquitina que están unidos de forma covalente al sustrato residuos de lisina a través de una cascada enzimática análoga a la ubiquitinación de proteínas. El genoma humano codifica cuatro proteínas de la familia SUMO: SUMO1-SUMO4. SUMO1-SUMO3 se expresa de forma ubicua en todos los tipos de tejidos, mientras que SUMO4 se expresa principalmente en el riñón, los ganglios linfáticos y el bazo [1]. Las formas maduras de SUMO2 y SUMO3 son 97% de cuota de ~ 50% de homología de secuencia idéntica y sólo con SUMO1. SUMO1 se conjuga a proteínas diana como monómero, mientras que SUMO2 y SUMO3 pueden formar cadenas de poli SUMO como resultado de los residuos de lisina aceptor presente en el extremo N. La función de SUMO4 es menos claro como evidencia sugiere que no se procesa a una forma madura, conjugables como las otras isoformas SUMO [1, 2].
Sumoylation es una modificación de proteínas dinámico y reversible. precursores naciente sumo son proteolíticamente procesados por isopeptidases-SUMO específica (proteasas-sentrina específica; SENPs) para revelar un resto de glicina C-terminal. Estas proteínas SUMO maduros son activados por el heterodímero E1 SAE1 (AOS1) -SAE2 (SUMO enzima activadora de 2 o UBA2) en una reacción dependiente de ATP que promueve la formación del enlace tioéster entre la glicina C-terminal SUMO y una cisteína en SAE2. SUMO se transfiere entonces al residuo de cisteína catalítica de la suela UBC9 enzima E2 (también conocida como UBE2I). Finalmente, SUMO E3 ligasas, incluyendo las proteínas de la familia PIAS, RanBP2 y miembro del grupo Polycomb Pc2 [1], facilitan la formación de un enlace isopeptídico entre el SUMO Ubl y un residuo de lisina de destino en el sustrato. El sitio de modificación SUMO-canónica contiene el motivo de consenso ΨKxE (donde x se refiere a cualquier aminoácido, Ψ es un grupo alifático de aminoácidos ramificados). Sumoylation es un proceso dinámico que se invierte en última instancia por las proteasas SUMO, o SENPs, que permiten la reutilización de las proteínas SUMO para los ciclos subsiguientes Conjugación [2]. Similar a la ubiquitina interactuar dominios asociados con la vía de la ubiquitina, se han identificado motivos que interactúan SUMO (SIMS) que promueven Sumoylation proteína o mejorar las interacciones proteína-proteína SUMO dependientes. SIMs canónicas se caracterizan generalmente por un corto tramo de restos hidrófobos con una secuencia de consenso y /o residuos de serina fosforilados [3]. La utilidad potencial biológico de múltiples Ubls SUMO combinada con la prevalencia de la SIM puede ayudar a explicar la gran diversidad de procesos biológicos en los que participa Sumoylation.
Las consecuencias biológicas de Sumoylation incluyen cambios en la localización subcelular, proteico alterado la interacción de proteínas, actividad alterada y la estabilidad sustrato [1, 2]. Numerosos SUMO objetivos han sido identificados a través de estudios celulares y bioquímicos y muchos de estos sustratos están involucrados en los procesos y estructuras celulares claves, incluyendo el ciclo celular, la estructura cromosómica y la segregación, la biogénesis ribosomal, nucleocytoplasmic transporte, sub-nuclear de la estructura, la reparación del ADN, y expresión de genes [4-8]. Varios factores de transcripción, tales como KAP1, Sp3, p300, c-Jun y c-Myb, se han reportado como sustratos SUMO mediante el cual Sumoylation es capaz de promover tanto la activación de la transcripción y la represión [6, 7, 9]. Además, SUMO participa en el transporte nuclear a través de la Sumoylation dependiente de la localización nuclear de poro de RanGAP1, que permite el mantenimiento del gradiente de GTP RAN que es importante para la importación nuclear activa y exportación [4]. Dentro del núcleo, también se informó Sumoylation jugar un papel importante en la formación del cuerpo nucleares PML (NB) y el reclutamiento de proteínas PML asociada incluyendo Daxx y SP100 [10, 11].
De particular interés desde una perspectiva de cáncer es la evidencia sustancial de que Sumoylation es importante para una multitud de procesos críticos para la mitosis. En
S
.
cerevisiae
, cohesinas es sumoylated, y se requiere Sumoylation de cromátida hermana de cohesión [12]. La quinasa mitótica Aurora B, topoisomerasa IIα, y numerosas proteínas centroméricas y kinetochore También se informa de sustratos SUMO [13]. Los blastocistos aisladas de embriones de ratón knockout muestran Ubc9 hypocondensed defectos de la cromatina y la segregación cromosómica [14]. efectos similares en la segregación cromosómica también se han observado en estudios genéticos en
S
.
cerevisiae
, pez cebra y Drosophila, lo que sugiere un papel conservado evolutivamente para SUMO en la mitosis. Curiosamente, los estudios en Drosophila indican que las células en división son especialmente sensibles a la pérdida de SUMO función de la vía con respecto al que no se dividen, las células diferenciadas [15].
Hay conexiones emergentes entre Sumoylation proteína y el cáncer. En las pantallas de RNAi en todo el genoma, varios componentes de la vía SUMO se calificó como genes esenciales para la proliferación celular [16]. Tanto
UBC9
y
SENP1
son necesarios para el desarrollo de embriones de ratón [14, 17]. Por otra parte, la enzima SUMO E1 (SAE1 /2), se identificó como sintético letal con c-myc en una pantalla de RNAi en todo el genoma, y SAE2 se requiere para el crecimiento de cáncer de mama dependiente de Myc en ratones [18]. En consonancia con este hallazgo, un estudio reciente encontró pérdida de Sumoylation inducida rápida regresión del linfoma accionado-Myc [19]. Los niveles elevados de UBC9 se han observado en varias enfermedades malignas y están asociados con resultados más pobres paciente; incluidos los de pulmón, colorrectal, de próstata, de ovario, cáncer de mama y melanoma [20-24]. Además, también se ha informado de niveles elevados de la SUMO E1, SAE estar asociada con un peor resultado en el cáncer de mama. Estos resultados justifican la evaluación adicional de enzimas de la ruta Sumoylation como el potencial de oncología dianas terapéuticas.
Validar el potencial para encontrar moduladores de molécula pequeña de la vía de SUMO, se ha informado de inhibidores de la SAE y UBC9 [25-28] aunque ninguno se encuentran actualmente en desarrollo clínico. Sin embargo, un inhibidor de una enzima E1 relacionada, la enzima de activación NEDD8 (NAE), se encuentra en desarrollo clínico [29, 30]. Este inhibidor, MLN4924 (pevonedistat), se une al sitio de unión de la adenilato de NAE-NEDD8 tioéster y utiliza un mecanismo asistido sustrato de la inhibición mediante el cual NAE cataliza la formación de un aducto de NEDD8-MLN4924 que actúa como un potente inhibidor de la enzima. SAE ha demostrado ser capaz de formar aductos de compuestos SUMO con un inhibidor de E1 no específica (compuesto 1), lo que demuestra la prueba bioquímica de concepto que SAE podrían ser objeto de esta manera [31].
Dada la relación emergente entre Sumoylation proteínas y el cáncer, hemos tratado de caracterizar los efectos de la pérdida de la función de la vía de SUMO en la proliferación de células de cáncer y el crecimiento tumoral. Se aplicaron los sistemas de shRNA estables y condicionales para derribar el SUMO E1 y E2 enzimas, SAE2 y UBC9, en líneas celulares de cáncer humano y SAE2 en modelos de xenoinjertos tumorales. SUMO vía knockdown resultó en múltiples resultados de terminales incluyendo la senescencia y apoptosis, lo que llevó a detener la proliferación potente y la muerte celular en las células cancerosas cultivadas. Para estudiar los posibles mecanismos, se confirmó la pérdida de TopoIIα Sumoylation y la interrupción de la LMP NBS en HCT116. Además, nuestros datos sugieren pérdida de Sumoylation retrasa la progresión tumoral en modelos de xenoinjertos, lo que sugiere vía sumo es un objetivo potencial de oncología.
Materiales y Métodos
Cultivo celular y reactivos
células HCT116, U2OS y Hela se obtuvieron de American Type Culture Collection. células HCT-116 y U2OS se cultivaron en medio 5A de McCoy suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor 10%. Las células HeLa se cultivaron en medio DMEM suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor 10%. células P300 se obtuvieron de Dr. Ron heno y se cultivaron en medio DMEM suplementado con suero inactivado por calor 10% bovino fetal, G418 0,5 mg /ml (geneticina) y 0,5 mg /ml de zeocina.
Todas las líneas celulares estaban infectados para expresar una orientación no shRNA, SAE2 shRNA o UBC9 shRNA utilizando partículas de lentivirus envasados (Sigma Misión shRNA biblioteca de clones #: SH1 SAE2: TRCN0000007470; SH2 SAE2: TRCN0000007472; SH1 Ubc9: TRCN0000007205; SH2 Ubc9: TRCN0000007206; sh3 Ubc9: TRCN0000011077). Las células infectadas fueron seleccionados por puromycin durante 2 días, dejaron recuperar durante 24 h y luego se utilizan para la transferencia de western y una variedad de ensayos de crecimiento. Se lisaron las células P300 para medir la actividad luciferasa de luciérnaga con Steady-Glo Luciferase Assay System (Promega).
fueron diseñados células HCT116 y U2OS para contener un vector que expresa un shRNA promotor Tet-inducible no la orientación o una horquilla de orientación SAE2 humano. Por estas células, el shRNA era un 22-mer tallo-bucle clonado bajo el control de un promotor inducible Tet-y transportados en el vector pTRIPZ (Open Biosystems). Las líneas se generaron por ingeniería mediante transducción estable con partículas lentivirales empaquetados. Las células infectadas fueron seleccionados por puromycin durante 2 días, dejaron recuperar durante 24 h y después se trataron con 1 ug /ml de doxiciclina (Sigma). SH1: TATTCCTACTTTCAATACAGCA; SH2: TTCAATTTGGACATCTGGTGCT; sh3: TTGACTTTGTACTTCAGCCCAG; sh4:. TTTACATCTAGAACCTGCTGGT
análisis Western
lisados de células enteras o extractos tumorales se fraccionaron por no reductor SDS-PAGE y a inmunotransferencia con anticuerpos a SAE2 (por lisados de células: anticuerpo policlonal de conejo generado por Millennium , el anticuerpo fue validado en las líneas celulares que sobreexpresan SAE2; para el extracto del tumor: Epitomics T0083, conejo), Ubc9 (Epitomics 2426-1, conejo), SUMO1 (Epitomics S2227, conejo), SUMO2 /3 (Tecnologías de Señalización celular 4971, conejo), RanGAP1 (ab2081 Abcam, cabra), p53 (Cell Technologies señalización 9282, conejo), p21 (Santa Cruz sc-397, conejo), se escindió de la caspasa 3 (Tecnologías de señalización celular 9661, conejo), TopoIIα (Cell Technologies 12286, conejo señalización) . Todos los anticuerpos primarios se utilizaron dilución 1: 1000. anticuerpos marcada con HRP secundaria a IgG de cabra (Millipore, dilución 1: 2000) se utilizaron para RanGAP1 anticuerpo primario y transferencias se desarrollaron con el reactivo ECL (Amersham). Para otros anticuerpos primarios, el anticuerpo secundario fue el anticuerpo Alexa-680-etiquetados de conejo /ratón IgG (Invitrogen, dilución 1: 5000) y las transferencias fueron imágenes utilizando el sistema Li-Cor Odyssey Infrared Imaging. Tubulina (Sigma) se transfirió para el control de carga.
inmunofluorescencia, y gammagrafía
se cultivaron p>
Proliferación y el análisis del ciclo celular
Después de la selección, las células se sembraron en seis y placas (2000 células /pocillo) con medio + o-doxiciclina y se incubaron durante 12 días. Las células se fijaron con 4% para-formaldehído y teñidas con una solución de cristal violeta 0,5% para identificar la presencia de colonias de células.
células HCT116 que albergan horquillas tet inducibles se trataron con doxiciclina durante 6 días y las células recogidas se fija en el 70% durante la noche de etanol a 4 ° C. Las células fijadas se centrifugaron para eliminar el etanol, y los sedimentos se volvieron a suspender en yoduro de propidio y RNasa A en PBS durante 1 hora en hielo protegidas de la luz. distribuciones del ciclo celular se determinaron usando citometría de flujo (FACS Calibur, Becton Dickinson) y se analizaron usando software Winlist (Verity).
tinción SA-β-Gal se llevó a cabo usando el kit de detección de la senescencia (Abcam) de acuerdo con las instrucciones de fabricación.
las células U2OS tratadas con 7 días Doxycycline se marcaron con BrdU durante 0,5 h, y G1, S y G2 /M poblaciones se midieron mediante el kit de flujo BrdU APC (BD Biosciences). Representante de datos se muestra a partir de experimentos independientes.
experimentos de xenoinjertos del tumor
Este estudio fue aprobado por el Comité de Oncología Takeda Company Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) (protocolo 09-011). 8 semanas de edad NCR nu /nu (Taconic Farm Inc.) se utilizaron en todos los estudios in vivo. Todos los animales se sometieron a un período de aclimatación de al menos 3 días antes de ser utilizados para fines experimentales (4 ratones en cada jaula). Para todos los procedimientos realizados en este estudio, los animales fueron anestesiados usando una inducción de una mezcla isoflorane /oxígeno 4-5% en una cámara de caja y después se mantuvo a 1-2% isoflorane /oxígeno. la sedación adecuada de los animales fue confirmada por pellizco del dedo del pie. Para los estudios de progresión del crecimiento tumoral, los ratones se inocularon con 2 × 10
6 células HCT116 o HT29 que albergan no focalización o SAE2 shRNAs por vía subcutánea en el flanco derecho, y el crecimiento tumoral se controló con mediciones de la pinza (para cada grupo, el total de 4 se utilizaron ratones -6). Cuando el volumen medio del tumor alcanzó aproximadamente 200 mm
3, los animales fueron tratados con irradiado 0,0625% Doxycycline Diet (Dieta Lab) de forma continua, que proporcionó 1-6 mg de Dox por ratón /por día. RFP imágenes fluorescentes se realizó en animales anestesiados utilizando un generador de imágenes Xenogen antes y después comenzó doxiciclina dieta. Durante el estudio, todos los animales que se reunió con los siguientes requisitos fueron retirados del estudio y la eutanasia: 1. Pérdida de peso: El peso corporal de los animales se monitorizó durante todo el estudio y los animales fueron sacrificados si se incurre en la pérdida de peso del 15% entre las observaciones. 2. El tamaño del tumor: Si el volumen del tumor alcanzó el 10% del peso corporal, el tamaño del tumor mayor de 2 cm interferir con el comer, beber, orinar, defecar o caminar. 3. Ulceración /necrosis del sitio del tumor. 4. Parálisis: La pérdida de función en cualquiera de las extremidades anteriores o miembros posteriores. 5. Otros criterios que iniciarán el seguimiento y la eutanasia si no responde a tratamiento paliativo diaria incluyen: deshidratación, hipotermia, respiración anormal, bajo nivel de actividad, el dolor evidente, y mal estado general del cuerpo. Al final del estudio, todos los animales fueron sacrificados mediante asfixia con CO2 seguida de una toracotomía para confirmar la muerte.
Resultados
Lentivirus basado desmontables gen de la ruta SUMO inhibe la proliferación de células de cáncer
in vitro
para confirmar que se requiere la vía SUMO para la supervivencia de las células cancerosas, se aplicó un lentivirus shRNA sistema basado desmontables de forma estable genes de la vía de SUMO en líneas celulares de cáncer humano. Dos shRNAs independientes dirigidas a SAE2 (SUMO E1) o UBC9 (SUMO E2) fueron infectados en células U2OS (figura 1A). Por inmunotransferencia, SAE2 shRNAs (SH1 y SH2) redujo de manera eficiente nivel de proteína y los niveles SAE2 UBC9-SUMO tioéster en consecuencia-regulado (Figura 1A), lo que indica la inhibición SUMO E1 disminuciones funcionales activación SUMO E2. Del mismo modo, dos UBC9 shRNA (SH1 y SH2) reduce tanto la UBC9 total y los niveles de tioéster UBC9 SUMO (figura 1A). En consonancia con los niveles de SUMO E1 y E2 reducidas, se observó niveles de SUMO2 /3 proteínas conjugadas (Figura 1A, panel inferior) reducido, lo que sugiere SAE2 y UBC9 shRNA están inhibiendo funcionalmente Sumoylation en las células.
(A) SAE2 o UBC9 caída reducida actividad de la vía SUMO. células U2OS se infectaron de forma estable con shRNAs lentivirus que expresan, seleccionado con puromicina y a inmunotransferencia para las proteínas indicadas. SH1 y SH2 son dos shRNAs para cada gen. (B) SAE2 o UBC9 caída de-reprimió un reportero SUMO-represivo. U2OS células estables que albergan un reportero de la luciferasa SUMO-represiva (células P300) se infectaron con shRNAs se indica. La actividad de luciferasa se midió en el día 5 después de la selección de puromicina. (C) SAE2 o UBC9 desmontables nivel reducido tioéster UBC9 en reportero células P300. inhibición (D) SUMO suprime la formación de colonias. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos y se tiñeron para cristal violeta después de 12 días.
Para medir cuantitativamente la inhibición Sumoylation en SAE2 o UBC9 caída en las células, se aplicó un ensayo indicador basado en células para medir SUMO actividad. Potenciamos células U2OS estables con un indicador de luciferasa SUMO represiva [5]. Las células expresan una proteína de fusión N-terminal GAL4-p300 (referido como GAL4-p300N partir de entonces) y albergaban un sitio de unión GAL4 delante del promotor de un gen de la luciferasa. p300 N-terminal contiene dos sitios de Sumoylation conocidos. Cuando sumoylated, GAL4-p300N recluta represores de la transcripción al sitio GAL4 que inhibe la transcripción de la luciferasa. De-Sumoylation de GAL4-de-p300N reprime el indicador de luciferasa. Como se muestra en la figura 1B, SAE2 shRNAs y UBC9 shRNAs aumento de la señal de luciferasa en comparación con un control de shRNA. Concordantemente, los niveles de proteína y SAE2 Ubc9 se redujeron de manera eficiente en estas células (Figura 1C) que confirman que SAE2 y UBC9 desmontables reducen la actividad funcionalmente Sumoylation.
Para estudiar el efecto de la inhibición SUMO sobre la proliferación celular, hacemos enchapado en células U2OS expresando SAE2 o UBC9 shRNAs y realizaron un ensayo de formación de colonias 2D. Como se muestra en la figura 1D, SAE2 y UBC9 shRNAs (SH1 y SH2) potentemente bloqueado la formación de colonias
in vitro
. También se midió el crecimiento celular mediante el ensayo de duplicación de la población. De acuerdo con la figura 1D, SAE2 caída resultó en lento duplicación de la población celular (S1A Fig). Se observaron resultados similares en HCT116 y células Hela (datos no mostrados). Estos datos confirman que Sumoylation es necesaria para la proliferación de células cancerosas.
Condicional SAE2 caída atenúa la actividad de la vía SUMO
Al crecer las células U2OS con SAE2 shRNAs, nos dimos cuenta de que las células que sobrevivieron después de múltiples pases mostraron una mucho menor caída SAE2 comparación con las células de paso de los primeros, lo que indica que el SUMO shRNAs se seleccionaron negativamente en esta población de células en proliferación. Para lograr caída aguda y regulable SAE2, generamos cuatro miR30 basada SAE2 shRNAs (SH1-sh4) [32] con una RFP (proteína fluorescente roja) indicador bajo el control del promotor TRE. El vector lentiviral también tiene un transactivador rtTA para formar un sistema de tet-en shRNA que es inducible con doxiciclina (Dox) [32]. U2OS células fueron infectadas con el condicional SAE2 shRNAs y tratados con Dox durante 5 días. Como se muestra en la figura 2A (panel superior), tratamiento previo de Dox, condicionada SAE2 shRNAs reducido de manera eficiente y niveles SAE2 SAE2-thioster mientras que un shRNA de control (c) no afectó el nivel de SAE2 sin carga y tioéster. Por inmunotransferencia para UBC9, mostramos que la caída condicional SAE2 niveles de los tioésteres UBC9-SUMO (Figura 2A, panel central) redujo. A través de la supervisión de la RFP reportero co-expresada a partir del promotor TRE, se detectó la inducción RFP sobre DOX tratamiento durante 36 horas (Fig S2), lo que indica la inducción eficiente del sistema Tet-El shRNA.
células U2OS (A) estaban infectados con Dox inducible SAE2 shRNAs (SH1-sh4) o el control shRNA (c). Las células se trataron con Dox durante 5 días (+) o sin tratar (-). lystes de proteína se sometieron a inmunotransferencia para las proteínas indicadas. TUBULINA sirve como control de carga. células U2OS (BD) que expresan condicional SAE2 shRNAs fueron tratados con Dox y immunoblotted con RanGAP1 (B), SUMO1 (C) y /3 anticuerpos Sumo2 (D).
Para estudiar si condicional SAE2 shRNA suprimida Sumoylation en las células, que mide el total de SUMO conjugados, así como el conocido gen diana SUMO RanGAP1 [4] en la célula caída SAE2. Ambos conjugados SUMO1 y Sumo2 se redujo significativamente en desmontables células SAE2 en el día 5 con el tratamiento con Dox (Figura 2C y 2D, carriles + Dox, SH2 y SH3). Además, al aguda caída SAE2, el nivel de sumoylated RanGAP1 se redujo a los 5 días después del tratamiento Dox y la reducción alcanzó su punto máximo en el día 8 (figura 2B). Esta observación es consistente con reportado prolongada vida media de SUMO modificado RanGAP1 [33]. También probamos el sistema shRNA condicional en células HCT116 y observamos caída aguda similar de SAE2 y la inhibición Sumoylation acompañados (Fig S3). Nuestros resultados mostraron que shRNAs condicional de forma aguda puede tumbar SAE2 para atenuar la actividad de la vía SUMO en las células cancerosas.
apoptosis inducida condicional SAE desmontables, endorreduplicación y la senescencia
Para hacer frente a la forma aguda la proliferación celular impactos desmontables SAE2
in vitro
, se realizó un ensayo de formación de colonias en Dox tratada y HCT116 células U2OS expresar condicional SAE2 shRNAs (figura 3A). Consistente con caída estable, el tratamiento Dox formación de colonias bloqueado significativamente en tres grupos SAE2 shRNAs (SH2-SH4), pero no en el grupo control shRNA (Fig 3A y Fig S4A).
células HCT116 (A) se infectaron con Dox inducible SAE2 shRNAs o control shRNA (ctrl). Las células se sembraron en placas de 6 pocillos en medio que contiene Dox (0.5ug /ml) y se tiñeron para cristal violeta después de 12 días. (B) Derribo de SAE induce la apoptosis. población G1 Sub se analizó por FACS con y sin tratamiento Dox. Las barras de error indican S. D. (C) SAE2 caída induce la senescencia celular. Las células se tiñeron para la actividad β-SA-Gal después de 9 días de tratamiento Dox. (D) la tinción PI y análisis FACS de células HCT116 tras SAE2 caída. se indicó sub G1 y población de células nucleadas en multiples.
Para explorar las posibles fenotipos que promueven SAE2 detención del crecimiento mediada desmontables-, que analizaron marcadores de apoptosis y el ciclo celular en las células desmontables SAE2. Por tinción PI y citometría de flujo, se observó el aumento de la población de células sub-G1 en las células HCT116 sobre condicional desmontables SAE2 (figura 3B), lo que sugiere que algunas células están experimentando apoptosis. Por ensayo de incorporación de BrdU, se observó una disminución en el porcentaje de células en fase S en células U2OS knockdown SAE2 (S4B FIG). Además de la apoptosis y el crecimiento celular reducido, a partir de 6 días de tratamiento Dox post continuo, desmontables células HCT116 SAE2 también mostraron un fenotipo multi-nucleado con ampliada y aplanados morfología que se observa comúnmente en células senescentes. Esta población de células teñidas positivo para la actividad SA-β-Gal (figura 3C), lo que indica que estas células han iniciado un programa de senescencia. Además, las células fluyen a análisis de citometría de contenido de ADN nuclear en Dox tratados mostraron incremento en el contenido de ADN 8N a partir de células HCT116 que albergan SAE2 shRNAs, lo que sugiere que la alteración de Sumoylation conduce a Endorreduplicación (Fig 3D). Estos resultados sugieren que la reducción de Sumoylation conduce a un deterioro de la citocinesis defectos mitótico, que probablemente contribuye a la apoptosis observada y la senescencia.
SAE2 shRNA fenotipo es rescatado por un no silencible ADNc
Para descartar la fuera de objetivo efectos de RNAi, se realizó un experimento de rescate con siRNA construcciones de ADNc refractario. Las células que expresan tet-a shSAE2 se infectaron con el vector vacío, de tipo salvaje no silencible SAE2 (SAE2
en peso), o un mutante inactivo SAE2 C173A ADNc (SAE2
mut) no silencible. Sin DOX tratamiento, los niveles de SUMO conjugados son similares dentro de estas líneas de células infectadas, examinado por Western blot (Figura S5). Después de 6 días de tratamiento continuo Dox, en comparación con el control de vectores, SAE2
WT rescatados parcialmente la baja regulación de SAE2-SUMO y los niveles de tioéster UBC9-SUMO y parcialmente restaurado SUMO2 /3 conjugados en las células que expresan shSAE2. Por el contrario, las personas inactivas SAE2
mut expresado no para rescatar el tioéster SAE2-SUMO, el tioéster Ubc9-SUMO SUMO conjugados (Figura 4A). Como confirmación adicional de que la SAE2 no silencible puede rescatar funcionalmente la actividad de la vía SUMO, se realizó el mismo ensayo de apoptosis sub-G1 y tinción SA-β-Gal. El tipo salvaje SAE2, pero no el C- & gt; Una enzima mutante muerto SAE2, parcialmente rescatado multinucleación shSAE2 inducida y la senescencia y muerte celular asociada (Fig 4B y 4C). Estos datos apoyan que los defectos de la mitosis y apoptosis de fenotipos SAE2 shRNA están probablemente causados por el deterioro de la actividad de la vía de destino SUMO.
células HCT116 (A) que expresan tet-inducible en shSAE2 (C = ctrl shRNA, 2 = SH2, 4 = sh4) se infectaron con el vector, de tipo salvaje no silencible SAE2 o no silencible C & gt; Una enzima mutante SAE2 muertos. Las células se trataron con Dox durante 6 días. Proteína lisados se inmunotransfirieron con anticuerpos indicados. (B) de tipo salvaje no silencible SAE2 rescata shSAE2 induce la muerte celular. población G1 Sub se analizó por FACS. Las barras de error indican S. D. (C) SA-β-Gal tinción de células que expresan la combinación indicada retrovirus.
La inhibición de la vía de SUMO conduce a defectos decatenation ADN y la interrupción PML NB
Una cuestión clave es cómo la pérdida de la actividad SAE2 conduce a endorreduplicación y la apoptosis. Después de 5 días de tratamiento continuo con doxiciclina, las células que expresan SAE2 shRNAs desarrollaron morfología nuclear anormal (Fig 5A). Las células desarrollan con frecuencia núcleos grandes y por lo general muestran núcleos múltiples lóbulos (Figura 5A), puentes de ADN delgados que conectan dos núcleos (Figura 5A, flecha), y micronúcleos (Figura 5A, punta de flecha). anomalías de la mitosis multipolar ejes incluyendo también fueron observados (Figura 5B). Estos resultados recuerdan el fenotipo observado con defecto en decatenation ADN, donde la falla segregación de los cromosomas entrelazados puede generar puentes de ADN que conducen a la mitosis anormal, alteración de la citocinesis y puede reducir la proliferación y viabilidad [34]. Estudios previos han informado de que la topoisomerasa IIα (TopoIIα) es un sustrato SUMO y Sumoylation es importante para la actividad TopoIIα in vitro [35-37]. Las transferencias Western en las células HCT116 que expresan shRNA control o SAE2 revelaron endógena especies sumoylated TopoIIα y desmontables de SAE2 inhibieron TopoIIα Sumoylation (figura 5C)
.
células HCT116 (AB) que expresan tet inducible SAE2 shRNA (SH2) o el control shRNA (ctrl) fueron tratados con Dox que contiene medio (0.5ug /ml) durante 5 días. Las células se fijaron y se tiñeron con DAPI para ver la morfología de los núcleos. células HCT116 (C) que expresan tet inducible SAE2 shRNA (SH2) o control shRNA (ctrl) fueron tratados con Dox durante 4 días a continuación, inmunotransferencia con anticuerpo TopoIIα. imágenes de inmunofluorescencia (D-E) de las células HCT116 que albergan inducible shRNA con 5 días de tratamiento de Dox. Las células se tiñeron con PML (D) o anticuerpos (E) Daxx. (F) SAE2 caída se asocia con un aumento de los niveles de p53. U2OS células que expresan condicional SAE2 shRNAs fueron tratados con Dox y inmunotransferencia con anticuerpos p53 y p21.
Desde Sumoylation está involucrado en muchos procesos celulares, y se observó evidencia de tanto la apoptosis y la senescencia, se investigaron los efectos alteración de la vía de SUMO en cuerpos nucleares de PML. cuerpos nucleares de PML son los organizadores de la matriz nuclear que regulan los procesos clave como la apoptosis y la senescencia. (N = 4).