Extracto
Antecedentes
citotoxicidad natural, mediada por células asesinas naturales (NK) juega un importante papel en la inhibición y eliminación de las células tumorales malignas. Para investigar el papel inmunorregulador de las células NK y su potencial como marcadores de diagnóstico, la actividad de las células NK (NKA) se analizó en el cáncer de próstata (CaP) pacientes, con especial hincapié en la distribución subconjunto de células NK.
Métodos
Los datos prospectivos de los patrones de distribución de subconjuntos de células NK NKA y se mide a partir de 51 pacientes inicialmente diagnosticados de CaP y 54 controles sanos. NKA fue representado por los niveles de IFN-gamma después de la estimulación de la sangre periférica con Promoca®. Para determinar la distribución de los subconjuntos de células NK, las PBMC se tiñeron con anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo. Entonces, CD16
+ CD56
tenue y CD16
-CD56
brillante células cerradas en CD56
+ CD3
-. Se analizaron las células utilizando un citómetro de flujo
resultados
NKA y la proporción de CD56
brillante células fueron significativamente inferiores en los pacientes con CaP en comparación con los controles (430,9 pg /ml frente a 975,2 pg /ml y el 2,3% vs. 3,8%, respectivamente;
p & lt; 0,001
). Ambos tendieron a disminuir gradualmente de acuerdo a la progresión de la etapa del cáncer (
p para la tendencia =
0,001
). Un significativamente mayor CD56
dim-a-CD56
se observó relación celular brillante en pacientes con CaP (41,8 vs. 30,3;
p & lt; 0,001
), junto con un aumento gradual de acuerdo a la etapa de la progresión del cáncer (
p para la tendencia =
0,001
), lo que implica una reducción significativa de CD56
brillante células en relación con la alteración de CD56
dim células. La sensibilidad y la especificidad de NKA en materia de detección de CaP fueron 72% y 74%, respectivamente (mejor valor de corte a 530,9 pg /ml, AUC = 0,786).
Conclusiones
La reducción de CD56
brillante células pueden preceder a la disfunción de las células NK, lo que lleva a la citotoxicidad contra el deterioro de células de CaP. Estas observaciones pueden explicar uno de los mecanismos que subyacen a la disfunción de las células NK observado en el CaP microambiente y prestar apoyo al desarrollo de futuras estrategias de inmunoterapia del cáncer
Visto:. Koo KC, Calce DH, Yang CM, Lee SB, Kim SM , Shin TY, et al. (2013) Reducción de la CD16
-CD56
brillante células NK subconjunto de Células NK Precede La disfunción en el cáncer de próstata. PLoS ONE 8 (11): e78049. doi: 10.1371 /journal.pone.0078049
Editor: Stephanie Filleur, Universidad Tecnológica de Texas Health Sciences Center, Estados Unidos de América
Recibido: 12 Junio, 2013; Aceptado: September 8, 2013; Publicado: 4 de noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Koo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por el Programa básico de Investigación de Ciencias a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (2012-0000807). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Un autor, SMK, es un empleado de ATGen que ayudaron con el proceso experimental. Sin embargo, esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
células asesinas naturales (NK) desempeñan una función importante en la innata y adaptativa respuestas inmunes contra transformación tumor o células infectadas por patógenos [1]. células NK ejercen citotoxicidad natural para eliminar las células malignas sin sensibilización o clase antes restricción MHC I [1], [2]. Además, las células NK estimulan la respuesta inmune adaptativa mediante la secreción de citocinas proinflamatorias para contrarrestar los mecanismos de escape promovidas por las células tumorales [3]. Se ha avanzado en la comprensión de la biología de las células NK; no obstante, sigue siendo más aclaraciones respecto a los efectos antitumorales de la actividad de células NK (NKA) y los patrones de distribución de subconjunto en el CaP.
células
NK se definen fenotípicamente por su expresión de CD56 y la falta de expresión de CD3 [4]. De acuerdo con densidades de membrana de CD56 y CD16, las células NK CD16 se clasifican en
+ CD56
tenue y CD16
-CD56
subconjuntos brillantes [5]. La mayoría son CD56
dim células que ejercen principalmente potente citotoxicidad [6]. Por el contrario, CD56
brillante células median baja citotoxicidad, pero adquieren una mayor actividad citolítica de CD56
dim células tras la activación debido a la liberación de citocinas proinflamatorias como IFN-γ [7]. El nivel de IFN-γ, es decir, NKA, se asocia generalmente con el pronóstico oncológico, lo que implica el papel esencial de expresión subconjunto de células NK diferencial en la regulación inmune de las células tumorales [8]. NKA ha demostrado para servir un papel importante en la vigilancia y en la eliminación de las células tumorales [9]. Los estudios han demostrado que el bajo NKA conduce a altos niveles de ocurrencia tumor y la metástasis, y que su grado se correlaciona con la invasividad de tumores malignos [10]. Por el contrario, de alta NKA se ha demostrado que se correlaciona con una menor incidencia de tumores, y su infiltración en ciertos tumores, es decir, melanoma, cabeza y cuello carcinomas de células escamosas, es un indicador de un mejor resultado oncológico [11], [12] .
Hay más pruebas de que una respuesta inmune deteriorada es un factor crucial en la patogénesis del cáncer de próstata (CaP) [13], [14]. disfunción de las células NK se ha implicado en CaP junto con una variedad de tumores [15], [16]. A pesar de varios mecanismos propuestos, incluyendo número reducido, citoquinas inmunosupresoras, y el receptor de desequilibrio repertorio, la patofisiología de la disfunción de las células NK en el CaP no se entiende completamente [5]. En cuanto al papel de NKA en la supresión tumoral, el aprovechamiento de los mecanismos de las células NK podría ser claramente un componente importante para el éxito de la inmunoterapia contra el CaP. El antígeno prostático específico (PSA) es el marcador sérico más ampliamente usado que ha revolucionado la detección precoz y el tratamiento del CaP. Sin embargo, la relativa falta de especificidad con el cáncer y la falta de un valor umbral superior o inferior son mayores inconvenientes.
Para abordar estas cuestiones, NKA y las distribuciones de CD56
tenue y CD56
subconjuntos brillantes se analizaron entre pacientes y controles CaP. Nuestros resultados indican que la inmunorregulación en el CaP se deteriora debido a la reducción en NKA precedido por redistribución de los subconjuntos de células NK. Además, la evaluación de la capacidad diagnóstica de NKA reveló que se puede aplicar como un marcador de apoyo además de PSA.
Materiales y Métodos
1. Los pacientes y los controles
Este análisis prospectivo transversal involucrado a 51 pacientes con diagnóstico reciente de CaP confirmado por biopsia debido a una elevación del PSA observó en los exámenes de salud de marzo a diciembre de 2012. Los 54 controles emparejados por edad fueron auto-Volunteered individuos sanos cuyo volumen prostático, PSA y DRE estaban dentro de rangos normales aceptados. Ninguno de los pacientes había recibido tratamiento previo para CaP, se sabe que tienen inmunológica u otras afecciones malignas, y estaban todos libres de infección activa o inflamación según la evaluación de conteo de glóbulos blancos & lt; 10.000 células /l y la proteína C-reactiva & lt; 1,0 mg /L (Tabla 1). Todos los controles estaban libres de condiciones inflamatorias sin exposición previa a los agentes inmunosupresores. Independiente aprobación se obtuvo del Comité de Ética de la Universidad de Yonsei (4-2011-0660), con todas las muestras de sangre recogidas después de obtener el consentimiento informado antes de la prostatectomía radical. Todos los participantes proporcionaron su consentimiento para participar en el estudio actual escritos.
2. NK actividad de las células
La actividad citotóxica de las células NK se determinó usando el NK Vue-Kit® (ATGen, Sungnam, Corea). Se recogió sangre entera usando BD Vacutainer heparina
tubos N1. se incubó 1 ml de sangre total durante 24 horas, a 37 ° C, bajo 5% de CO
2 con la dosis indicada de Promoca® y 1 ml de medio RPMI 1640. Se recogieron sobrenadantes libres de células, y los niveles de IFN-gamma se determinaron de acuerdo con los protocolos del fabricante.
3. Subconjunto de células NK Distribución
3.1. Preparación de PBMC.
Se obtuvieron y analizaron dentro de las 4 h de la recogida de 3 ml de sangre venosa heparinizada. PBMCs se aislaron por centrifugación en gradiente de densidad utilizando tubos de preparación de células CPT® (BD Vacutainer®) a 1600 g durante 20 min a 20 ° C. Las PBMCs recogidas (1-2 x 10
6 células /ml) se lavaron y se resuspendieron en 5% de suero bovino fetal (FBS) + solución salina tamponada con fosfato (PBS).
3,2. La tinción de anticuerpos.
Para la expresión de CD3, CD16, y CD56 en las células NK, las PBMC se tiñeron con Alexa-anti-CD3, PE-anti-CD16, y FITC-anti-CD56 conjugados con fluorocromo anticuerpos monoclonales (BD Biosciences). Después de la tinción durante 30 minutos a 4 ° C, las células se lavaron extensamente y se fijaron en 1% de paraformaldehído-PBS hasta la evaluación.
3,3. La citometría de flujo.
Para determinar el porcentaje total de células NK cerrada en el CD3
-CD56
+ población de células, al menos 10.000 células diana fueron adquiridos por LSRII citometría de flujo (BD Biosciences). La distribución de CD16
+ CD56
dim células NK CD16 y
-CD56
brillante células NK cerradas desde el CD3
-CD56
población celular se presenta como el porcentaje del total + células NK. Para cada muestra, los datos fueron analizados por FlowJo 8.1.1.1 (árbol de la estrella, Inc., Ashland, Oregón, EE.UU.).
4. Clasificación de la etapa del cáncer
estadificación del CP se determinó de acuerdo con el 7
ª American Joint Committee on Cáncer (AJCC) sistema TNM. La distribución por etapas y las características patológicas se muestran en la Tabla 2. Patología fue confirmada por un único patólogo.
5. Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron mediante pruebas de Mann-Whitney U al comparar los datos de dos grupos no apareados y pruebas de Kruskal-Wallis con corrección de Bonferroni post hoc cuando se comparan más de dos grupos. La precisión de NKA y de la CD56
dim-a-CD56
relación brillante en la detección de PCa se determinó mediante la operación del receptor área bajo la curva (AUC) características de origen. Se utilizó el análisis de correlación para evaluar las asociaciones entre NKA, CD56
dim-a-CD56
relación brillante, y las variables clinicopatológicas. Los análisis estadísticos se realizaron con SPSS (v.18.0).
Resultados
1. Los datos demográficos
A todos los pacientes y los controles fueron clínica y patológicamente investigados con respecto a los factores que se muestran en la Tabla 1. Factores que pueden influir en el propio estado inmunológico manifiestan diferencias entre los grupos.
2. Frecuencia de las células NK y Distribución de CD56
tenue y CD56
brillantes subconjuntos de células NK
Los datos de citometría de flujo Representante muestra la distribución de la población total de células NK CD3 representado como
-CD56
+ células (Fig. 1A) y dos subconjuntos principales, CD16
+ CD56
tenue y CD16
-CD56
brillante, expresados como un porcentaje del total de células NK (Fig. 1B). Total de frecuencias circulantes NK no fueron diferentes entre los pacientes y los controles o entre grupos de etapa de cáncer (Figura 2A;. Tabla 2). Sin embargo, una disminución preferencial en la frecuencia de CD56
brillante células se observó en los pacientes. Además, CD56
brillante células tendían a disminuir gradualmente de acuerdo con la progresión del cáncer etapa, es decir, la extensión extracapsular, LN o metástasis de órganos adyacentes (Fig 2B;. Tabla 2). Un significativamente mayor CD56
dim-a-CD56
se observó brillante proporción de células NK en pacientes en comparación con los controles, con una tendencia a aumentar de acuerdo a la progresión de la etapa (
p para la tendencia =
0.001
) (Tabla 2).
(B) de datos de citometría de flujo representativos de dos grandes subconjuntos de células NK detectado en la sangre periférica. A la izquierda, caja superior: CD16
+ CD56
dim subconjunto de células NK. Derecha, cuadro inferior:. CD16
-CD56
brillante subconjunto de células NK
No se observaron diferencias significativas de la población total NK entre pacientes y controles, y dentro de los grupos de teatro. (B) Diagrama de caja diagramas que muestran resultados de la distribución de citometría de flujo de CD56
CD56
brillantes distribuciones de subconjuntos tenue y dentro de las células NK en total entre los controles y los pacientes, agrupados de acuerdo a la etapa del cáncer. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 en relación con los controles
3.. NK Cell Actividad
Los resultados obtenidos se presentan en la Fig. 3 y en la Tabla 2. Como se ha indicado, los pacientes mostraron significativamente menor NKA. De acuerdo con la progresión de la etapa, aquellos con etapas más altas mostraron una mayor reducción de NKA (
p para la tendencia
& lt;
0,001
).
** p & lt; 0,01 en relación con controles.
4. El análisis mediante curvas ROC
curvas ROC y mejores valores de corte se utilizaron para calcular la sensibilidad y especificidad de los parámetros relacionados con las células NK (Tabla 3). La sensibilidad y especificidad de NKA con respecto a la detección de CaP fueron 72% y 74%, respectivamente, mientras que la CD56
dim-a-CD56
relación brillante célula mostró una sensibilidad del 66% y una especificidad del 71% ( Fig. 4A). En un análisis más detallado, la sensibilidad y la especificidad de NKA se determinaron de acuerdo con dos valores de PSA agrupados como 4 a 10 ng /ml, que es la zona gris de diagnóstico, y los niveles mayores que 10 ng /ml. En una especificidad conjunto de 74%, NKA para los valores de PSA dentro de la zona gris mostró una sensibilidad más alta (73% vs. 70%) y el AUC (0,82 ± 0,06 vs. 0,76 ± 0,07) en relación con valores de PSA mayor de 10 ng /ml (Fig. 4B).
(AUC = área bajo la curva). curvas (B) ROC comparar las actuaciones de la actividad de células NK de medición de acuerdo con PSA agrupados como; 4-10 ng /ml y mayor que 10 ng /ml. (AUC = área bajo la curva).
5. NK la actividad celular y CD56
dim-a-CD56
Relación brillante célula en función de variables clinicopatológicas
NKA mostró correlaciones negativas con el PSA, la etapa del cáncer, y el CD56
dim-a-CD56
relación brillante. Por otra parte, CD56
brillante proporción de células dim-a-CD56 mostró correlaciones positivas con PSA y el estadio del cáncer (Tabla 4). NKA y CD56
dim-a-CD56
relación brillante se comparó entre los controles y los pacientes agrupados de acuerdo con variables clínico (Tabla 5). Aunque CD56
dim-a-CD56
relación brillante no pudo discriminar a los pacientes con puntuaciones de Gleason & lt; 7 y aquellos sin extensión extracapsular de los controles, todos los demás subgrupos eran distinguibles de los controles por NKA y CD56
dim-a -CD56
relación brillante. Análisis en los subgrupos de pacientes entre reveló significativamente mayor CD56
dim-a-CD56
relación brillante en pacientes con metástasis LN confirmado patológicamente (
p = 0,043;
datos no presentados).
Discusión
el objetivo del presente estudio fue aclarar la función de las células NK en la respuesta inmune contra el CP. Se han propuesto varios mecanismos de desarrollo de PCa y la progresión, incluyendo hormonal, alteraciones metabólicas, y la respuesta inmune [6], [17]. Hay pruebas de que diferentes poblaciones de linfocitos están implicados en la inmunosupresión mediada por células que conduce a la aparición y progresión de CaP [13], [18], [19]. Sin embargo, existe poca información sobre el papel funcional de las células NK en la respuesta inmune a CaP. Para solucionar este problema, se investigó NKA como marcador para niveles de IFN-γ y la distribución de los subconjuntos de células NK en pacientes con CaP. Los resultados de nuestro estudio indican que la alteración es de suponer que NKA precedida por una reducción de CD56
brillante células, y que el nivel de NKA podrían utilizarse como marcador diagnóstico de apoyo para el PSA.
1. La reducción preferencial de CD56
brillante células NK en pacientes con CaP
Las células NK se clasifican funcionalmente en CD56
tenue y CD56
subconjuntos brillantes. CD16
+ CD56
células oscuras son células efectoras con altas cantidades de gránulos citolíticos que expresan potente citotoxicidad contra las células tumorales [4]. CD16
-CD56
brillante células liberan citocinas proinflamatorias como IFN-γ que acciona los mecanismos inflamatorios que regulan la iniciación del tumor, immunoevasion, la supervivencia, y el crecimiento [20], [21]. Descubrimientos recientes han revelado que CD56
brillante células constituyen la mayoría de las células NK en los tejidos linfoides y que no son sólo una pequeña subpoblación entre las células NK, pero son precursores inmaduros de CD56
dim células [22]. Este trabajo se centra en este subconjunto particular, en cuanto a su importancia en la regulación de la respuesta mediada por células NK contra las células tumorales.
Investigación sobre los patrones de distribución de subconjuntos de células NK reveló una disminución significativa de CD56
brillante células sin alteración de CD56
dim células. Los estudios previos sobre diversos huéspedes portadores de tumores han informado interrelaciones bastante distintas entre CD56
tenue y CD56
subconjuntos brillantes. En contraste con nuestros resultados, una reducción de CD56
dim células sin alteración de CD56
brillante células se observó en el cáncer gástrico y de esófago [23]. Por otra parte, se observó una reducción de CD56
brillante células de cáncer de mama, cabeza y cuello, y una distribución equitativa de CD56
dim células de CaP; resultados que son consistentes con el presente estudio [7], [17].
2. La alteración de CD56
brillante células NK como un mecanismo de respuesta al tumor microambiente
Nuestro estudio observó principalmente una reducción preferencial de CD56
brillante células sin alteración de CD56
dim células. Aunque la causa subyacente aún no se ha definido claramente, dos posibles explicaciones se pueden plantear; proceso de maduración y el proceso de contratación.
Como se ha mencionado, se aceptan CD56
células brillantes como precursores CD56
células tenues, con cada subconjunto representando una etapa distinta maduración [24]. Posiblemente, una demanda excesiva de las células efectoras en respuesta al tumor puede haber provocado una transición de inmaduras CD56
brillante células CD56 en
dim células. Una explicación similar ha sido propuesto para la reducción de CD56
brillante células en pacientes con cánceres de cabeza y cuello [7]. Sin embargo, esto presupone un aumento concomitante de CD56
células tenues, que no se observó en el presente estudio.
Una explicación alternativa es que sin la demostración CD56
brillante células periféricas pueden haber sido reclutados para linfoide sitios de tejido como los LN metastásicos para adquirir la citotoxicidad. Esta idea se basa en observaciones anteriores de que CD56
brillante células preferentemente se acumulan en el área de la célula T de los LN hasta ser activado para producir citoquinas proinflamatorias [7], [22,22]. Por otra parte, la observación de que CD56
brillante células aisladas de humanos se convierten en los LN citotóxica en gran medida de la estimulación por IL-2 sugiere que las células NK reclutados a los LN podrían representar una piscina inmadura de células efectoras [25]. Un significativamente mayor CD56
dim-a-CD56
proporción de células brillante en pacientes con se observó patológicamente confirmado la metástasis LN en nuestro estudio, lo que implica que estas células circulantes pueden haber sido reclutados para los LN patológicos o secundarios en respuesta a un tumor. Esto es de relevancia porque los LN son por lo general los sitios de metástasis primarias y CD56
células brillantes son el subconjunto principal que se encuentra en los LN que contrarrestan las células metastásicas [26]. Para confirmar este problema, sería interesante examinar si CD56
brillante células se acumulan en los LN LN metastásicas tras la disección.
3. NK disfunción de las células como consecuencia de la reducción de CD56
brillante células NK
NKA se investigó para determinar la influencia de la reducción de CD56
células brillantes en la actividad citolítica contra las células tumorales. En paralelo a las observaciones con CD56
brillante células, NKA se observó a ser menor en los pacientes con CaP, junto con una tendencia a disminuir gradualmente de acuerdo a la etapa de la progresión del cáncer. Estos resultados son consistentes con los informes anteriores que mostraban NKA se ve comprometida en un amplio espectro de tumores sólidos y hematológicos [8], [10], [27]. Se han propuesto varios mecanismos de NKA comprometido, tales como disminución del número de células NK infiltrantes de tumor [23], el aumento de los receptores de superficie para factores inmunes supresoras [28], y la inactivación de células efectoras [10].
Correlaciones observada entre NKA y CD56
dim-a-CD56
relación brillante célula puede ser de relevancia directa para sugerir un mecanismo adicional que la debilidad de NKA es una consecuencia de la reducción de CD56
brillante células. CD56
brillante células son conocidas por ser las principales fuentes de IFN-γ [22], como se observa en
in vitro
estudios en los que CD56
se muestra brillante células a proliferar preferentemente en co-cultivo con inmadura las células dendríticas y los lipopolisacáridos para producir IFN-γ [29]. Además, la estimulación de CD56
brillante células con células de carcinoma transducidas resultó en una mayor capacidad para producir IFN-γ e impartir alta citotoxicidad [6]. Además,
in vivo
estudios han demostrado que las amígdalas CD56
brillante células producen IFN-γ antes de la maduración en las células efectoras [25]. Por el contrario, se observó una reducción de CD56
brillante células para inducir la secreción alterada de IFN-γ en pacientes con rinitis alérgica [30]. Teniendo en cuenta estos resultados apoyan que la secreción de IFN-γ depende directamente de CD56
brillante células, se sugiere que la reducción de CD56
brillante células es un mecanismo potencial involucrado en baja NKA, lo que conduce a la citotoxicidad fallidos contra células de CaP.
4. NK la actividad celular, un marcador de diagnóstico de apoyo para PSA
curvas ROC reveló que NKA puede servir como un marcador de apoyo para PSA en el diagnóstico del CaP. Aunque está claro que el PSA proporciona el valor más alto para diagnóstico CaP, una limitación importante es su falta de especificidad de cáncer que provoca riesgos y costes innecesarios, especialmente en la zona gris de diagnóstico [31]. A pesar de los retos actuales se esfuerzan por desarrollar nuevos métodos de detección de CaP, ninguno ha superado claramente los beneficios contra los inconvenientes [14]. Esta investigación plantea la posibilidad de que NKA se puede utilizar en combinación con PSA para proporcionar un valor diagnóstico adicional, especialmente para aquellos dentro de la zona gris de diagnóstico.
Este estudio se basó en los controles frente a los pacientes con diagnóstico de CaP debido a la elevada PSA en un examen de salud de rutina. Por lo tanto, la ausencia de pacientes con CaP con PSA normal (& lt; 4 ng /ml) fue la principal limitación de este estudio, lo que dificultó la comparación directa de rendimiento diagnóstico entre PSA y NKA. Se necesita un estudio de población extendida para confirmar nuestros hallazgos preliminares y para evaluar la rentabilidad.
Conclusiones
Este estudio observacional proporcionado nuevos hallazgos que CD56
brillante células juegan un papel importante en la adaptación respuesta contra células de CaP. Esta noción se presta más apoyo que los estudios longitudinales con respecto a la vigilancia inmunológica de las células NK claramente merecen una investigación adicional para conducir potencialmente a nuevas estrategias de inmunoterapia para mejorar los resultados oncológicos de CaP.