Extracto
microARNs (miRNAs), aproximadamente 22 nucleótidos no codificantes moléculas de ARN, regulan una variedad de procesos fisiológicos o patológicos fundamentales, incluyendo el desarrollo embrionario y la tumorigénesis. Para obtener los perfiles de expresión de miRNAs integrales en embriones humanos, que caracteriza la expresión de los genes miARN en las semanas 4-6 del desarrollo embrionario humano utilizando microarrays miARN y se identificaron 50 miRNAs humanos de embrión específicos (HES-miRNAs). Por otra parte, se seleccionaron tres miRNAs no conservadas o primate-específicas, hsa-miR-638, -720 y -1280, y examinamos sus niveles de expresión en varios tejidos normales y tumorales. Los resultados muestran que la expresión de la mayoría de miRNAs es extremadamente baja durante el desarrollo embrionario humano temprano. Además, la expresión de algunos miRNAs no conservados o primates específico es significativamente diferente entre las correspondientes muestras de tejido normal y tumoral, lo que sugiere que los miRNAs están estrechamente relacionados con los procesos patológicos de diversos tumores. Este estudio presenta la primera descripción completa de los genes miARN expresión durante el desarrollo embrionario humano y ofrece evidencia inmediata de la relación entre el desarrollo embrionario temprano humana y la tumorigénesis
Visto:. Lin Y, Zeng Y, Zhang M, L Xue, Huang Z, Li W, et al. (2013) Caracterización de los perfiles de expresión microARN y el descubrimiento de los microARNs novedosos implicados en el cáncer durante el desarrollo embrionario humano. PLoS ONE 8 (8): e69230. doi: 10.1371 /journal.pone.0069230
Editor: Wei Yan, de la Universidad de Nevada, Facultad de Medicina, Estados Unidos de América
Recibido: 15 Marzo, 2013; Aceptado: 6 Junio 2013; Publicado: 2 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Lin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de alta Tecnología de Investigación y Desarrollo de China (Programa 863) de Grant 2006AA02A306, Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China subvención 30871245 y 31271511. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los microARN (miRNA) son ~ 22 nucleótidos (nt) no codificación de las moléculas de ARN que regulan la expresión génica a nivel de mensajero la degradación del ARN o la traducción, ejercen funciones esenciales en los procesos biológicos diferentes que van desde la regulación del ciclo celular, la diferenciación y el metabolismo, para el desarrollo de tejido y embrión normal, e incluso la tumorigénesis [1-4] . Alteraciones en la expresión de los genes miARN están implicados en la iniciación, progresión y metástasis de tumores humanos [5]. Poco a poco cada vez más evidencia sugiere una relación directa entre miRNAs y muchas enfermedades, especialmente el cáncer.
Utilizando varios métodos experimentales, estudios previos en la embriogénesis animales encontraron que ciertos miRNAs se registraron de forma continua, y la mayoría juegan un papel crucial en la diferenciación o el mantenimiento de la identidad del tejido [6-10]. El desarrollo humano en las primeras 8 semanas de la embriogénesis es potencialmente una de las zonas más interesantes de la investigación biológica. Específicamente, algunos tejidos y órganos importantes, incluyendo la neurogénesis y el desarrollo del hígado, comenzaron a formarse durante semanas 4-6 (Carnegie Etapas 10-17) de la embriogénesis humana [11]. Recientemente, nuestro grupo de investigación y otros han caracterizado los perfiles de transcripción de la expresión del ARNm de todo el genoma durante la embriogénesis humana utilizando microarrays [12,13]. Sin embargo, los genes miARN expresión humana en este período que queda por esclarecer.
Muchos estudios han demostrado que los miRNAs están implicados en diversos aspectos de la tumorigénesis y animal embriogénesis (revisado en 4,5,14-21). En 1892, los biólogos franceses LOBSTEIN y especularon Recamier la noción de origen embrionario de tumores por primera vez. En la década de 1970, el Dr. Pierce propuso el 'cáncer, la biología del desarrollo de una' teoría y señaló que la tumorigénesis estuvo íntimamente involucrado con la biología del desarrollo, en gran medida [22-27]. Actualmente, sin embargo, las pruebas pertinentes de la relación entre el desarrollo del embrión humano temprano y la tumorigénesis es aún limitada [28-32]. Para llenar este importante vacío en el conocimiento, por lo tanto, son necesarios más estudios.
En este estudio, se identificaron los perfiles de expresión de genes miARN durante el desarrollo embrionario humano y caracterizados mediante microarrays de miRNAs. Los resultados muestran que casi todos los miRNAs de función conocida que son altamente expresado o exhiben cambios de expresión durante el desarrollo embrionario humano se han implicado en varias enfermedades malignas. Además, los tejidos de expresión investigaciones de varios miRNAs de función desconocida que son altamente expresado o se someten a cambios de expresión durante el desarrollo del embrión humano indican que la expresión de estos miRNAs fue significativamente diferente entre muestras de cáncer y los correspondientes tejidos normales, lo que sugiere que estos miRNAs también pueden desempeñar importantes papeles en la tumorigénesis. Estos resultados proporcionan evidencia con respecto a la estrecha relación entre la embriogénesis humana y la carcinogénesis, y revelan, además, que los miRNAs relacionados con el desarrollo embrionario con funciones desconocidas pueden estar implicados en el desarrollo y progresión del cáncer.
Materiales y Métodos
recogida de embriones y línea celular
recogida de embriones humanos se llevó a cabo como se describe anteriormente [13]. consentimiento por escrito adecuado se obtuvo de los pacientes y la aprobación obtenidas del Comité de Ética Médica del Hospital de la Universidad de Wuhan Zhongnan siguiendo las directrices nacionales.
microarrays y la bioinformática análisis
El ensayo microRNAs se ha realizado mediante microarrays un proveedor de servicios (LC Ciencias). El ensayo se inició con 2-5 g de la muestra de ARN total, que era de tamaño fraccionado utilizando un Microcon YM-100 de filtro centrífugo (Millipore). Los pequeños RNAs aislados (& lt; 300 nt) fueron 3'-extendieron con una cola de poli (A) polimerasa usando poli (A). Una etiqueta de oligonucleótido se ligó a la cola de poli (A) para más tarde la tinción de colorante fluorescente; dos etiquetas diferentes fueron utilizados para las dos muestras de ARN en experimentos de doble muestra. La hibridación se realizó durante una noche en un
μ
Paraflo ™ chip de microfluidos utilizando una bomba de la microcirculación (atáctico Technologies) [33,34]. En el chip de microfluidos, cada sonda de detección consistió en un segmento de nucleótidos codificante modificado químicamente complementaria para apuntar microRNA (de miRBase, http://www.mirbase.org/) u otro RNA (control o secuencias definidas por el cliente), así como una segmento espaciador de polietilenglicol para extender el segmento de codificación de distancia del sustrato. Las sondas de detección se generan a partir de
la síntesis in situ
usando PGR química (reactivo fotogenerada). Las temperaturas de fusión de hibridación se equilibran con modificaciones químicas de las sondas de detección. La hibridación utiliza 100 l de tampón 6xSSPE (0,90 M NaCl, 60 mM Na
2HPO
4, 6 mM EDTA, pH 6,8) que contenía 25% de formamida a 34 ° C. Después de la hibridación, detección de fluorescencia utilizado etiquetado con la etiqueta específica Cy3 y Cy5 tintes. imágenes de hibridación fueron recolectados a través de un escáner láser (GenePix 4000B, Molecular Device) y se digitalizaron usando software de análisis de imagen Arsenal-Pro (Media Cybernetics). Los datos se analizaron restando primero el fondo y la normalización de las señales usando un filtro LOWESS (localmente ponderado de regresión) [35]. Para los experimentos de dos colores, la relación entre los dos conjuntos de señales detectadas (log
2 transformado, equilibrada) y se calcularon los valores de p de las pruebas t; señales detectadas diferencialmente fueron aquellos con valores de p inferior a 0,01. La intensidad normalizada de la señal de 8 muestras (Semana 4 del desarrollo embrionario humano: ZN18, ZN46 /47, ZN75; Semana 5: ZN38, ZN43, ZN63-1; Semana 6: ZN61, ZN70) se utilizó el análisis de agrupamiento utilizando un uno análisis de la varianza (ANOVA) por un proveedor de servicios (LC Sciences). Los datos normalizados para todas las matrices se han depositado en la Expresión Génica Omnibus (GEO) en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI), accesibles a través de GEO serie número de acceso GSE46795 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo /query/acc.cgi?acc=GSE46795).
de alta densidad de múltiples tumores de órganos y tejidos normales microarrays (catálogo MC5003), que contiene 18 tipos de tumores (20 casos por cada tipo) y los correspondientes controles normales (5 casos según el tipo), fueron adquiridos de los Estados Unidos Biomax. Los oligonucleótidos miARN y revueltos para
in situ
hibridación se compraron como sondas marcadas con digoxigenina ácido nucleico cerrado (LNA) de Exiqon (Dinamarca). La secuencia de las sondas de detección LNA fueron: LNA-638: 5'-DIG-AGGCCGCCACCCGCCCGCGATCCT-3 '; LNA-720: 5'-DIG-TGGAGGCCCCAGCGAGA-3 '; y LNA-1280: 5'-DIG-GGGTGGCAGCGGTGGGA-3 '. LNA-U6: 5'-DIG-CACGAATTTGCGTGTCATCCTT-3 'y LNA-scramble: 5'-DIG-GTGTAACACGTCTATACGCCCA-3' se utilizaron como sondas de control positivo y negativo, respectivamente. El
In situ
la hibridación de la matriz de tejido para miRNAs experssion se realizó con un proveedor de servicios (Shaanxi Chaoying Biotecnología CO, LTD, Shaanxi China), y las diapositivas fueron leídos por dos investigadores independientes. La intensidad de la tinción se anotó como negativo (- /0)., Débil (+ /1), moderada (++ /2), o fuerte (+++ /3) como se describe anteriormente [36,37]
miARN reacción en tiempo real en cadena de polimerasa (PCR)
miARN ensayo de RT-PCR se realizó a través de un proveedor de servicios (LC Ciencias). En pocas palabras, cuantificaciones miARN se examinaron utilizando TaqMan
® microARN Ensayos y mezcla maestra de PCR TaqMan Universal y analizados por el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7000. RNU24 se utilizó como un control interno para determinar la expresión de los genes miARN relativa. Cada muestra se realizó por triplicado.
Estadística
analiza
Se realizó un análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) utilizando los datos normalizados para la semana 4-6 para identificar miRNAs cuya expresión cambiado. Para comparar la expresión de miRNAs en tejidos normales y cancerosas humanas, dos colas
t
pruebas se realizaron con las puntuaciones por encima de las muestras.
Resultados y Discusión
Caracterización de los genes miARN de Student los perfiles de expresión durante el desarrollo embrionario humano
Para identificar los perfiles de expresión de genes miARN de embriones humanos, miARN microarrays ensayos se realizaron en muestras de embriones humanos (semanas 4, 5 y 6 después de la fertilización) mediante la tecnología μParaflo®, y los microarrays se analizaron los datos en bruto. La gama cubre todas las transcripciones de los genes miARN disponibles en la base de datos Sanger miRBase (liberación 10,1). Para más detalles, consulte los procedimientos experimentales y datos suplementarios (Tabla S1 disponible en línea). En consecuencia, miRNAs intensidades de señal que exhiben mayor que 32 fueron considerados como de expresión detectado. Después de la normalización, un fuerte umbral de la señal de detección de los genes miARN se definió como 500 (Figura 1). Designamos estos 50 miRNAs (~ 6%), en el que la señal de expresión era mayor que 500 de cualquier etapa en la semana 4, 5, o 6 durante el desarrollo embrionario humano, como miRNAs específicos de embrión humano (HES-miRNAs) (Tabla 1 ).
MiRNA niveles de expresión durante el desarrollo embrionario humano (semanas 4, 5, y 6 después de la fecundación) con una mayor intensidad de la señal 32 se consideraron como expresión detectado. Un umbral fuerte señal de detección de miRNA se definió como 500 después de la normalización. MiRNAs con una señal de fluorescencia mayor que 500 en cualquier etapa en las semanas 4, 5 o 6 se definieron como HES-miRNAs.
MiARN
Semana 4 Semana 5
Semana 6
hsa-miR-1031020.97589.63775.30hsa-miR-106a3717.471283.56988.08hsa-miR-106b705.36336.58217.08hsa-miR-107837.20446.95520.07hsa-miR-10b1679.971511.97688.29hsa-miR-1224805.009396.8510671.26hsa-miR-1246356.13816.55100.26hsa-miR-125a-5p387.96827.091146.67hsa-miR-125b558.09937.533407.28hsa-miR-126513.43257.52195.18hsa-miR-126867.10212.18725.03hsa-miR-1275238.04928.53413.71hsa-miR-1280189.87292.811238.08hsa-miR-130a522.76130.33161.38hsa-miR-130b827.85593.00936.95hsa-miR-151-5p713.59579.19423.27hsa-miR-15b1041.17788.21368.30hsa-miR-161080.15395.87286.75hsa-miR-174108.911437.681210.55hsa-miR-181a312.21269.73741.07hsa-miR-181b192.98187.58873.77hsa-miR-182341.78579.71453.59hsa-miR-191482.51483.55631.69hsa-miR-199a-3p1284.651201.391165.51hsa-miR-19b758.72559.73223.40hsa-miR-206791.121067.481658.21hsa-miR-20a3614.131105.53804.23hsa-miR-20b1471.15540.45323.50hsa-miR-2142654.733566.049605.29hsa-miR-23b745.25594.28767.96hsa-miR-251871.251553.321021.11hsa-miR-26a4645.233390.432536.21hsa-miR-320a1849.633185.424495.39hsa-miR-320b1358.111904.943209.74hsa-miR-320c1666.092358.804068.96hsa-miR-320d790.281072.821897.73hsa-miR-361-5p751.92719.17643.41hsa-miR-423-5p553.06888.43400.99hsa-miR-432499.71807.49534.52hsa-miR-4511355.12622.2018.66hsa-miR-483-5p480.512580.411537.07hsa-miR-574-5p163.53375.89709.17hsa-miR-6384622.856092.422891.58hsa-miR-663290.15525.9244.41hsa-miR-720101.92181.661255.10hsa-miR-92a11338.0811838.016909.45hsa-miR-92b4171.404315.192556.64hsa-miR-93872.20552.87445.45hsa-miR-936323.52512.7235.61hsa-miR-99b510.57635.731232.78Table 1. Lista de específico del embrión humano-miRNAs.
Después de la normalización, un fuerte umbral de la señal de detección de los genes miARN se definió como 500 (Figura 1), y 50 miRNAs (~ 6%, 50/835), en el que la señal de expresión fue mayor de 500 de cualquier etapa en la semana 4 , 5 o 6 durante el desarrollo embrionario humano, fueron designados como miRNAs humanos de embrión-específica (HES-miRNAs). CSV Descargar CSV
La expresión perfiles muestran que la expresión de la mayoría de miRNAs es baja durante el desarrollo embrionario humano temprano, en el que aproximadamente el 80% de miRNAs (666 de 835 miRNAs) que exhiben intensidad de la señal se considera como la expresión no detectado (Figura 1 y Tabla S1). Estos datos son similares a los resultados que la mayoría de los miRNAs no fueron detectados durante el desarrollo temprano del pez cebra [10]. Se muestran los ensayos de agrupamiento jerárquico de expresión HES-miARN (Figura 2A) y 169 miRNAs que exhiben intensidad de la señal más del 32 (Figura S1) durante el desarrollo embrionario humano. En la Figura 2A, se identificaron los siguientes tres grupos de expresiones HES-miRNAs: Categoría A, upregulated en la semana 6; b clúster, regulado por disminución en la semana 6; y el grupo C, upregulated en la semana 4. En la figura S1, se identificaron cuatro grupos de 169 miRNAs: los grupos 1, 2, 3 y 4. Cluster una miRNAs en la figura 2A se incrementaron durante las tres etapas embrionarias humanas (semana 6 & gt; la semana 5 & gt; 4 semanas), y se incluyen algunas especies reportadas miARN que se enriquecen en diversos procesos de desarrollo y enfermedades (por ejemplo, hsa-miR-122, -206, -214, -181 familia, y la familia -125) [38]. miRNAs grupo C que disminuyeron durante las tres etapas embrionarias humanas (en la semana 4 & gt; la semana 5 & gt; la semana 6) incluyen algunos miRNAs que también se enriquecieron en diversos procesos de desarrollo y enfermedades (por ejemplo, hsa-miR-451, -106, -16 , y -17) (Figura 2A) [38]. Sin embargo, la expresión de muchos miembros del grupo B que aumentaron desde la semana 4 a la semana 5, pero disminuyeron desde la semana 5 hasta la semana 6, tienen funciones desconocidas en los procesos de desarrollo y la enfermedad.
(A) Cincuenta HES-miRNAs eran divididos en 3 grupos: los grupos a, B y C. La flecha muestra los miRNAs que fueron seleccionados para validar los datos de microarrays utilizando microARN QRT-PCR (Figura 3). El asterisco muestra la no conservadas o primates específicos HES-miRNAs (Figura S4). El triángulo hueco indica miRNAs harborring la misma secuencia de la región simiente en clúster c. (B) La figura 2B muestra la secuencia madura de seis miRNAs (miR-17, -106a, -106b, -20, -20b, -93) con la región de semilla idéntica etiquetados con sombra de color rojo claro. gráfico (C) Pie muestra el análisis del patrón funcional (ontología de genes) de los objetivos conservadas (1245), transcripciones predichos por TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_60/), de los seis miRNAs.
Entre el HES-miRNAs (Tabla 1 y Figura 2A), algunas se han confirmado experimentalmente que desempeñar un papel fundamental en la diferenciación y la enfermedad. Por ejemplo, el mamífero miRNA específico del hígado, miR-122, que tenía el nivel de expresión más alto de semana 6 del desarrollo embrionario humano, con frecuencia se suprime en carcinomas hepatocelulares primarios [39,40], y también es esencial para la hepatitis C virus RNA la acumulación en las células hepáticas cultivadas [10,41-47]. Hsa-miR-214 se relaciona con el desarrollo muscular y la formación ósea, y está implicado en el cáncer gástrico y de ovario [48-53]. Hsa-miR-92a /b, como miembros de la familia miR-17 ~ 92, está implicado en muchos tumores sólidos y leucemia [54-57]. Hsa-miR-106a participa en la regulación de la generación de células madre pluripotentes inducidas, la regulación postranscripcional de la interleucina-10 expresión, cáncer gástrico, y astrocitoma [58-61]. Por lo tanto, nuestros resultados apoyan firmemente la idea de que existe una marcada similitud entre el desarrollo embrionario temprano y la tumorigénesis [22].
Por otra parte, estos miRNAs altamente expresados, así como aquellas que tienen una baja expresión, pueden desempeñar diferentes funciones reguladoras en diferentes etapas del desarrollo embrionario humano. Alternativamente, estos miRNAs con altos niveles de expresión tienen una fuerte especificidad de tejido, tal como HSA-mir-122
.
Entre clúster c, es increíble que nos dimos cuenta de 6 miRNAs (HSA-miR-17, -106a, -106b , -20Â, -20b y -93), que contiene la misma región AAAGUG semilla sequcence (Figura 2B), se downregulated en la semana 6 del desarrollo embrionario humano, y podría desempeñar las funciones biológicas similares en la embriogénesis humana. Los laboratorios Hannon y Hammond proporcionado resultados experimentales directos que estos microRNAs, codificadas por el cúmulo de miR-17-92 y sus parálogos (al-106a-MIR 363 conglomerados y grupos 25 miR-106b-), tienen actividad oncogénica en tumores sólidos [62 ]. Ventura y sus colegas documentaron fuertes evidencias de que la supresión de la agrupación miR-17-92 resultó en pulmones gravemente hipoplásicos y reducción del número de células pre-B en ratones, conduciendo finalmente a los embriones más pequeños incluso la muerte postnatal inmediata [63]. Teniendo en cuenta el papel fundamental de estos miRNAs en el desarrollo y la tumorigénesis, que predijo todos los objetivos de estos miRNAs 6 por TargetScan, y luego se volvieron a analizar los objetivos conservadas (1245 transcripciones). Durante las primeras etapas del desarrollo embrionario humano, un evento importante asociado con la transición del desarrollo de la fase de proliferación celular temprano para la organogénesis y histogénesis es que el número de células madre o células no diferenciadas se reduce debido a que más células comienzan a diferenciarse en diferentes órganos /tejido- tipos de células específicos. Durante las primeras etapas del desarrollo embrionario humano, un evento importante asociado con la transición del desarrollo de la fase de proliferación celular temprano para la organogénesis y la histogénesis se presenta. análisis de patrones funcionales (ontología de genes) de la meta conservada (1245 transcripciones) de 6 miRNAs muestra que la gran mayoría de estos genes en las categorías GO relacionados con la regulación biológica, la regulación del proceso biológico, proceso metabilic, proceso celular, proceso del organismo multicelular y proceso de desarrollo (Figura 2C). Informó recientemente algunos de los objetivos de miR-17 ~ 92 de la familia, tales como CDKN1A (p21) [64], BIM [65], RUNX1 [66], dos de ellos están incluidos en estas categorías, vaya, lo que sugiere que estos genes son lugar insustituible en el control de ciclo celular, apopotosis celular, y la diferenciación de las células progenitoras hematopoyéticas. Y estos resultados podrían ayudar a entender mejor el papel de HES-miRNAs en la embriogénesis humana y la tumorigénesis.
Además, para validar la calidad de los datos de microarrays miARN, cuatro miRNAs (HSA-miR-125 ter, -720 , -1280, y -20b, Figura 3 y Figura S2) cuya expresión niveles cambiado significativamente durante el desarrollo fueron validados mediante ensayos en tiempo real RT-PCR TaqMan® miARN. Las tendencias de los genes miARN expresión fueron consistentes con lo observado en los datos de microarrays miARN (Figura 3 B, C, D, y E).
Cuatro miRNAs [hsa-miR-125 ter (B), hsa-miR-720 (C), hsa-miR-1280 (D), y hsa-miR-20b (e)], que se expresa de forma diferente (p & lt; 0,05, Figura 3A) y (p & lt; 0,10, Figura S2) durante semanas 4, 5 y 6 del desarrollo embrionario humano, fueron escogidos. QRT-PCR se realizó y U6 snRNA se utilizó como control interno para determinar la expresión de los genes miARN relativa.
Humano-Ratón Analisis comparativo de miARN expresión durante el desarrollo embrionario
Para comparar la miARN perfiles de expresión entre los humanos y el desarrollo embrionario del ratón, se realizó un análisis comparativo con respecto a los perfiles de expresión de microARN publicados anteriormente en embriones de ratón que cubren el desarrollo prenatal (E9.5, E10.5, E11.5 y) [8], que se corresponden con las semanas 4, 5, y 6 del desarrollo embrionario humano [67,68]. Teniendo en cuenta los miRNAs idénticos en humanos y de ratón, se construyó un análisis de intersección entre 835 miRNAs humanos en este estudio y 390 miRNAs ratón, y se identificaron 195 miRNAs homólogos (Tabla S2). Los ensayos de agrupación jerárquica de miRNAs homología humanos y de ratón se muestran en la Figura S3A y diagramas de Venn B. (Figuras S3C y S3D) mostró que 38 o 32 miRNAs homología de humano-ratón se upregulated o downregulated, respectivamente, durante el desarrollo embrionario humano y de ratón. Entre estos miRNAs, let-7 miembros de la familia, el miR-34a, el miR-221/222, miR-145, miR-125 ter, miR-15a y miR-223 se ha demostrado que desempeñan funciones múltiples durante el desarrollo y la patogénesis de diversos mamíferos órganos [38]. Estos resultados sugieren, además, que algunos miRNAs homólogos humanos y de ratón son importantes para el desarrollo y la patogénesis, mientras que los que no son homólogas es probable que participan en diferentes procesos de desarrollo que reflejan la divergencia evolutiva entre el humano y el ratón.
propiedades conservadoras de HES-miRNAs
un estudio previo mostró que muchos genes miARN conocidos tienen un patrón de conservación típica, persistente a lo largo de los racimos, lo que sugiere implicaciones evolutivas y funcionales [69]. Sin embargo, una parte sustancial de microRNAs se confirman como miRNAs no conservados o primate específicos debido a que muchos nuevos miRNAs humanos se han identificado de forma continua [70]. Para definir la conservación de HES-miRNAs, hemos utilizado el miRviewer [71], lo que demuestra la conservación de los genes miARN agrupadas por nombre. Como se muestra en la figura S4, la mayoría de HES-miRNAs son altamente conservados, y sus funciones son bien conocidos. Sorprendentemente, entre HES-miRNAs, ocho miRNAs, hsa-miR-638, -663, -720, -936, -1246, -1268, -1275, -1280 y, son extremadamente no conservada, a pesar de que la mayoría son primate- específico (Figura S4) [70,72]. Notablemente, la expresión los valores de pico de 5 de estos miRNAs, MIR-638, -663, -936, -1246, -1275 y, son a las 5 semanas del desarrollo embrionario humano. En otras palabras, estos miRNAs pueden funcionar sólo en una etapa del desarrollo embrionario humano específico. Por otra parte, se sabe muy poco acerca de las funciones biológicas de estos miRNAs en la organogénesis y la patogénesis de mamíferos. Sin embargo, debido a que la expresión de estos miRNAs no conservadas o primate específicos es alta durante el desarrollo embrionario humano, estos miRNAs probablemente juegan papeles fundamentales en la organogénesis y /o patogénesis de mamífero. De hecho, algunos estudios indican que estos no conservadas o primate específica HES-miRNAs puede estar asociado con todo tipo de enfermedad [73-82]. La función de éstos no conservadas o primate-específica HES-miRNAs que queda por determinar.
Análisis comparativo de la expresión de HSA-miR-638, -720 y -1280 en los tejidos normales y malignos
Muchos estudios han indicado que los miRNAs están involucrados en diversos aspectos de los procesos de desarrollo de los animales y la enfermedad [4,16-21,38,83-89]. A fin de validar la relación entre el HES-miRNAs y diversos tumores malignos sólidos, nos centramos en tres no conservadas o primate-específica HES-miRNAs, hsa-miR-638, -720 y -1280 (Tabla 1), de gran expresa o exhibir cambios de expresión durante la semana 4-6 del desarrollo embrionario humano para la investigación funcional adicional. Hemos examinado si la expresión de la tres HES-miRNAs difiere significativamente entre los diferentes tumores humanos y el tejido normal correspondiente.
Uso de la MC5003 de microarrays de tejidos y sondas altamente específicos y sensibles de oligonucleótidos de LNA modificados, los perfiles de expresión de la 3 miRNAs en los tejidos normales y cancerosas se detectaron utilizando
In situ
hibridación. sondas y U6 snoRNA scramble-miR fueron utilizados como sondas de control positivo y negativo, respectivamente. Los resultados estadísticos demuestran que la expresión de hsa-miR-638 es upregulated significativamente en tejidos de cáncer de hígado hepatocelulares (n = 20) frente a los tejidos normales del hígado (n = 5) (p = 0,0092), y en el cuello del útero tejidos de carcinoma de células escamosas ( n = 18) frente a los tejidos normales de cuello uterino (n = 7) (p = 0,0003). En contraste, la expresión de HSA-miR-638 se downregulated significativamente en los tejidos de adenocarcinoma de estómago (n = 19) frente a los tejidos normales del estómago (n = 6) (p = 0,0095) (Figura 4A). Estos datos están de acuerdo con los resultados de Tsukamoto et al. mostrando regulación a la baja de este miARN en el cáncer gástrico [90]. hsa-miR-720 expresión está regulada positivamente de manera significativa en el cuello del útero tejidos de carcinoma de células escamosas (n = 18) frente a los tejidos normales de cuello uterino (n = 6) (p = 0,0086), en el pulmón tejidos de carcinoma de células escamosas /adenocarcinoma (n = 17) frente a los tejidos normales de pulmón (n = 6) (p = 0,0386), en los tejidos cystadenocarcinoma /adenocarcinoma de ovario (n = 18) frente a tejido de ovario normal (n = 6) (p = 0,04045), y en los tejidos de carcinoma urotelial (n = 17 ) frente a tejidos normales vesica urinaria (n = 5) (p = 0.03504) (Figura 4B). Además, la expresión hsa-miR-720 es downregulated significativamente en los tejidos malignos de la mucosa intestinal (n = 19) frente a los tejidos normales de la piel (n = 9) (p = 0,0017) (Figura 4B). La expresión de hsa-miR-1280 es downregulated significativamente en los tejidos de carcinoma de células escamosas de piel de la cabeza y el cuello (n = 20) frente a los tejidos normales de la piel (n = 9) (p & lt; 0,0001), en los tejidos malignos de la mucosa intestinal (n = 20 ) frente a tejidos de la piel normal (n = 9) (p = 0,0009), y en los tejidos de adenocarcinoma de páncreas (n = 17) frente a tejidos pancreáticos normales (n = 6) (p = 0,0270) (Figura 4C). Por el contrario, la expresión de HSA-mir-1280 es aumentada significativamente en los tejidos de carcinoma de células escamosas de cuello uterino (n = 17) en comparación con los tejidos normales de cuello uterino (n = 7) (p = 0,01076) (Figura 4C). Los ejemplos representativos de tres miRNAs que son expresados diferencialmente en los tejidos tumorales frente a tejidos normales se muestran en las Figuras 5, S5, S6, y S7. Los resultados sugieren que estas HES-miRNAs están estrechamente relacionados con los procesos patológicos de los diversos tumores.
de alta densidad múltiple tumor de órganos y microarrays de tejidos normales que contienen 500 de tejido-puntos con 18 tipos de tumores y tejidos normales de control correspondientes . ácido nucleico (LNA) sondas bloqueadas marcadas con digoxigenina (LNA-638, LNA-720, y LNA-1280) se utilizaron para detectar específicamente la expresión de los genes miARN en el chip de tejidos. (A) La expresión aberrante de hsa-miR-638 en microarrays de tejidos. Importantes sobre regulación de miR-638 se puede observar en el cáncer de hígado hepatocelular y carcinoma de células escamosas de cuello uterino. miR-638 baja regulación se encuentra en el adenocarcinoma de estómago en comparación con los tejidos normales correspondientes (p = 0,0092, p = 0,0003, p = 0,0095 y, respectivamente) (B) la expresión aberrante de hsa-miR-720 en microarrays de tejidos. Hsa-miR-720 es upregulated significativamente en cuello uterino carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma de células escamosas de pulmón, adenocarcinoma de ovario y carcinoma urotelial en comparación con los tejidos normales correspondientes (p = 0,0086, p = 0,0386, p = 0,0404 y p = 0,035, respectivamente ). Hsa-miR-720 es downregulated significativamente en la mucosa intestinal de los tejidos malignos en comparación con los tejidos normales de la piel (p = 0,0017). (C) La expresión aberrante de hsa-miR-1280 en microarrays de tejidos. Hsa-miR-1280 es downregulated en el carcinoma de células escamosas, el tejido maligno de la mucosa intestinal, y el adenocarcinoma de páncreas en comparación con los tejidos normales correspondientes (P & lt; 0,0001, p = 0,0009 y p = 0,0270, respectivamente). HSA-mir-1280 es aumentada significativamente en los tejidos de carcinoma de células escamosas de cuello uterino en comparación con los tejidos normales de cuello uterino (p = 0,01076). los niveles de expresión de miARN (eje y) con una puntuación = 0, 1, 2, o 3, indican negativa, débil, media o fuerte intensidad de la tinción, respectivamente. n indica el número de las muestras estudiadas. NT indica muestras de tejido normal; CT indica muestras de tejido carcinoma. Student de dos colas
t
se realizaron pruebas para comparar la expresión de los genes miARN en los tejidos normales y cancerosas.
Paneles de un tejido normal del estómago a través de muestras de adenocarcinoma de estómago t espectáculo y paneles u través z espectáculo . La señal de la tinción de azul indica la expresión de HSA-miR-638. La tinción con rojo muestra el núcleo de la célula (200μm escala que la figura 5a). j2 muestra un mayor aumento (5x) del área indicada en la figura 5j, y z2 muestra un mayor aumento (5x) del área indicada en la figura 5Z.
En resumen, nuestros estudios en el presente documento revelan que la expresión los niveles de la mayoría de miRNAs durante la embriogénesis humana son muy bajos. Designamos 50 (~ 6%) de los 835 miRNAs reguladas en las semanas 4 a 6 del desarrollo embrionario humano como HES-miRNAs, y demostró que algunos no conservadas o primate específica HES-miRNAs están involucrados en la tumorigénesis, apoyando así la hipótesis que las primeras acciones de desarrollo embrionario muchas similitudes con el desarrollo del cáncer en el comportamiento biológico, así como molecularmente [22]. Sin embargo, las funciones de la no conservadas o primate-específica HES-miRNAs aún no se han establecido experimentalmente, lo que nos ayudará a entender aún más la red de modulación molecular complicada que se produce durante el desarrollo embrionario humano.
Apoyo a la Información
Figura S1.
La agrupación jerárquica análisis de la expresión de 169 miRNAs que presenta intensidades de señal superior a 32 miRNAs (n = 169) fueron divididos en 4 grupos: los grupos 1, 2, 3, y 4. La flecha muestra los miRNAs que se seleccionaron ser validados por microARN QRT-PCR (Figura 3). El asterisco muestra la no conservadas o primate-específica HES-miRNAs (Figura S4)
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figura.. La agrupación
análisis de la expresión de los genes miARN (
p Hotel & lt; 0,10) durante el desarrollo embrionario humano rojo y verde indican niveles altos y bajos de expresión, respectivamente
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Figura S3.
Conservadas miARN patrones de expresión y las características biológicas de los homólogos humanos y de ratón durante el desarrollo embrionario. Agrupación jerárquica sin supervisión análisis de la expresión de los genes miARN per fi les en los seres humanos (semanas 4, 5, y 6, Figura S3 A) y las muestras de embrión de ratón (E9.5, E10.5, E11.5 y, Figura S3 B). Los datos de microarrays de embrión de ratón fueron publicados en 2006 por Mineno y colegas. El color de cada celosía Refleja el nivel de expresión de los genes miARN en la muestra correspondiente. El aumento de las intensidades de rojo indicar que una especificidad c miARN tiene una mayor expresión en la muestra dada. El aumento de las intensidades de color verde indican que este miARN tiene menor expresión. Los diagramas de Venn representan los miRNAs de intersección entre los seres humanos (semana 4, 5 y 6) y las muestras de embrión de ratón (E9.5, E10.5, y E11.5) y muestran que 38 y 32 miRNAs homología de humano-ratón se upregulated (C .) y downregulated (D), respectivamente, durante el desarrollo embrionario humano y de ratón
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figura S4.
Conservación análisis de la HES-miRNAs. El miRviewer muestra la conservación de los genes miARN-HES, agrupadas por nombre. El miRNAs que sólo pueden ser descubiertos en los primates humanos u otros, incluyendo el miR-638, -663, -720, -936, -1246, -1268, -1275, -1280, y se separaron a continuación. El aumento de las intensidades de color verde indica que una especificación c miARN (o familia miARN) tiene una mayor conservación de la especie dada. Los números entre paréntesis indican los números de los miRNAs en una familia dada miARN. La mayoría comparten resultados similares de conservación
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Figura S5.
hsa-miR-638 expresión en el adenocarcinoma de cuello del útero y los tejidos normales correspondientes. Los paneles A través de muestras de adenocarcinoma uterino úteros t demostración y paneles de U a través de z muestran tejidos normales cuello del útero. La señal de la tinción de azul indica la expresión de HSA-miR-638. La tinción con rojo muestra el núcleo de la célula (200μm escala que la figura S5a)
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Figura S6.
hsa-miR-720 expresión en el adenocarcinoma de cuello del útero y los tejidos normales correspondientes.