Extracto
La activación constitutiva del factor de transcripción factor kappa B (NF-kB) nuclear está implicado en la tumorigénesis y quimio-resistencia. A medida que el regulador clave de NF-kappa B, IKKβ es un objetivo terapéutico importante para varios tipos de cáncer. Trichothecin (TCN) es un metabolito aislado de un hongo endofítico de la planta a base de hierbas
Maytenus Hookeri Loes.
En este estudio, se evaluó la actividad antitumoral de TCN y encontraron que TCN marcadamente inhibe el crecimiento de células cancerosas con constitutivamente activado NF-kB. TCN induce G0 detención del ciclo celular /G1 y la apoptosis en células de cáncer, la activación de las proteínas pro-apoptóticas, incluyendo la caspasa-3, -8 y PARP-1, y la disminución de la expresión de proteínas anti-apoptóticas Bcl-2, Bcl-XL, y survivina. ensayo de actividad de reportero y el análisis de los genes diana expresión ilustran que TCN funciona como un potente inhibidor de la vía de señalización NF-kB. TCN inhibe la fosforilación y degradación de I? B? Y bloquea la translocación nuclear de p65, y por lo tanto inhibe la expresión de NF-kB objetivo genes XIAP, ciclina D1, y Bcl-XL. Aunque TCN no interfiere directamente con IKKβ quinasa, que suprime la fosforilación de IKKβ. La sobreexpresión de IKKβ constitutivamente activado abortado TCN induce la apoptosis de las células cancerosas, mientras que desmontables de IKKβ endógeno con células de cáncer de siRNA sensibilizados hacia la apoptosis inducida por TCN. Por otra parte, TCN mostró un efecto notablemente más débil en las células normales. Estos hallazgos sugieren que TCN puede ser un candidato terapéutico potencial para el tratamiento del cáncer, la orientación de señalización NF-kB
Visto:. Su J, Zhao P, L-Kong, Li X, J Yan, Zeng Y, et al. (2013) Trichothecin induce la muerte celular en el NF-kB activado constitutivamente células de cáncer humano a través de la inhibición de la fosforilación IKKβ. PLoS ONE 8 (8): e71333. doi: 10.1371 /journal.pone.0071333
Editor: Linda Bendall, Westmead Millennium Institute, Universidad de Sydney, Australia |
Recibido: 11 Abril, 2013; Aceptado: June 27, 2013; Publicado: 1 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Su et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de los 100 talentos Programa de la Academia de Ciencias de china (Y. Li), el Programa de Desarrollo de la Investigación básica del Estado Mayor de china (Nº 2009CB522300), la Fundación de Ciencias Naturales de china (No.81173076), y la parte superior Reclutado talento de Ciencias y Tecnología de la provincia de Yunnan (2009CI120). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
NF-kB factores de transcripción se componen de cinco subunidades homólogas: de RelA (p65), RelB, cRel (Rel), NF-κB1 (p50 y p105 su precursor) y NF-κB2 (p52 y p100 su precursor) , que funcionan como homodímeros y heterodímeros diferentes [1], [2]. En la vía canónica NF-kappa B, las células pueden ser estimuladas por diferentes estímulos, incluyendo especies reactivas de oxígeno, factor de necrosis tumoral alfa, interleuquina 1-beta, lipopolisacáridos bacterianos, etc. Tras la activación, la subunidad inhibidora I? B? Es fosforilada por la quinasa I? B ( IKK) complejo, que luego se ubiquitinated y degrada a través de la vía del proteasoma, que estimula la translocación del complejo p65 /p50 en el núcleo y activar la expresión de genes aguas abajo [3], [4].
NF-kB señalización juega un papel importante en la regulación de la inflamación, la tumorigénesis y el desarrollo del cáncer [5] - [7]. En una amplia variedad de cánceres, incluyendo tumores malignos hematógenas (tales como leucemia, linfoma y mieloma múltiple), y tumores sólidos (tales como de pulmón, mama y páncreas) -NF-kappa B se activa persistentemente [8], [9]. La activación de NF-kappa B hasta regula la expresión de genes anti-apoptóticos que codifican Bcl-xL, XIAP, cIAP1 y cIAP2, así como genes de proliferación como la ciclina D1 y la IL-6 [10] - [13]. la actividad de NF-kB también está estrechamente relacionada con la metástasis de tumores y el cáncer de quimio-resistencia. la activación de NF-kappa B induce la transcripción de genes implicados en la angiogénesis, un proceso crítico en la formación de tumores y la metástasis [14]. Por otra parte, los inhibidores de NF-kappa B mejoran la sensibilidad de los cánceres a agentes quimioterapéuticos, tales como paclitaxol, TNF-α y el juicio [15] - [17]. Dada la conexión entre NF-kappa B y el cáncer, el desarrollo de inhibidor de NF-kappa B tiene gran potencial en la represión de ciertos tipos de la proliferación del cáncer, además de mejorar las terapias existentes contra el cáncer [18], [19].
Maytenus hookeri Loes.
se ha utilizado como un remedio popular durante mucho tiempo en el sudoeste de china, debido a su cáncer y las actividades anti-inflamatorias. Anteriormente, fue identificado maitansina por su efecto contra el cáncer por microtúbulos interfieren [20], [21]. El derivado de maitansina, DM1, se ha utilizado en emtansina trastuzumab (T-DM1), un nuevo fármaco desarrollado para el tratamiento del cáncer de mama HER2-positivo [22]. Sin embargo, los componentes químicos responsables de las actividades contra el cáncer de esta planta se merecen más exploración.
Trichothecin (TCN) está aislada del hongo endofítico de
Maytenus Hookeri Loes
. En informes anteriores de nuestro y otros demostraron que TCN está involucrado en algunas actividades antitumorales, pero el perfilado antitumoral o mecanismos subyacentes de estas acciones se carece [23] - [25]. En el presente estudio, se encontró que TCN inhibe el crecimiento de células humanas de cáncer mediante la inhibición de la señalización de NF-kB. Nuestros datos muestran que TCN suprime la activación de IKKβ mediante la supresión de su fosforilación, inhibe la expresión de NF-kB genes diana, e induce la detención del ciclo celular y la apoptosis de células de cáncer. Como un nuevo inhibidor de la ruta de NF-kB, TCN puede llegar a ser un candidato a fármaco potencialmente prometedora en el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer.
Materiales y Métodos
Líneas Celulares
líneas celulares de cáncer humano, HepG2, A549, PANC-1 y HL-60, línea celular de riñón embrionario humano HEK 293T, línea de células del epitelio bronquial humano BEAS-2B y riñón humano túbulo proximal línea celular epitelial HK-2 fueron adquiridos de ATCC. línea de células epiteliales del colon humano (CCD-841-CON) fue amablemente dotado por el Dr. Lin, Li, del Instituto de Bioquímica y Biología Celular, Academia de Ciencias de China (Shanghai, China) [26]. Las células fueron cultivadas en 5% de CO
2 a 37 ° C en medio RPMI-1640, medio MEM o DMEM que contenía 10% (v /v) de suero bovino fetal (Hyclone, Logan, UT).
Reactivos
Los anticuerpos monoclonales para P65 NF-kappa B, PARP-1, caspasa-8, Bcl-xL, caspasa-3, ciclina D1, Bcl-2, survivin, fosfo-IKKβ (Ser177), y β-actina así como anticuerpos policlonales a I? B?, fosfo-I? B? (PS32 /PS36) se adquirieron de Santa-Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). El anticuerpo policlonal de XIAP se obtuvo de Proteintech (Chicago, IL). El anticuerpo monoclonal para p65 fosfo-NF-kappa B y el anticuerpo policlonal a un total de IKKβ se adquirieron de Tecnologías de Señalización Celular (Boston, MA). NF-kB p65 plásmido informador de luciferasa (PNF-kappa B-Luc) se adquirió de Beyotime Instituto de Biotecnología (China). El plásmido pCMV-SPORT6 insertado con la secuencia se obtuvo de RelA humano que dirige la expresión de p65 de Thermo Scientific (Rockford, IL). Alexa Fluor 546 de anticuerpo secundario conjugado, Lipofectamine 2000, Z'-Lyte ™ kit de ensayo de quinasa y IKKβ proteína humana recombinante se obtuvieron de Invitrogen Life Technologies-(Carlsbad, CA). kit de ensayo reportero de luciferasa-Dual se obtuvo de Promega (Madison, WI). Duplex siRNAs con dos residuos de timidina (dTdT) en el extremo 3 'de la secuencia se sintetizaron en GenePharma (Shanghai, China). Recombinante humano TNF-α se adquirió de PeproTech (Rocky Hill, NJ). A menos que se indique lo contrario, todos los demás reactivos se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Los compuestos
TCN y otros compuestos ensayados fueron extraídos de
Trichothecium roseum
LZ93, un hongo aislado de endofítico
Maytenus hookeri Loes.
, tal como se describe anteriormente [24] (estructuras designadas en la Figura 1A y la Figura S1 a): perfil.
(a) estructura química de trichothecin. efectos (B) citotóxica de las células de trichothecin a concentraciones sucesivas. Después del tratamiento 48 h, la viabilidad celular se determinó usando ensayos de MTT. (C) Anexina V-FITC análisis /PI de la apoptosis en las células tratadas con TCN para 24 h. (D) HL-60, HepG2, A549 y las células PANC-1 se trataron con TCN durante 24 h y los lisados celulares se sometieron a análisis de transferencia Western con anticuerpos indicados. ß-actina se utilizaron como controles de carga. Cada columna representa la media ± DE de triplicados en tres experimentos independientes.
Ensayo de citotoxicidad e IC
50 Determinación
La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de MTT. Las células se trataron con los compuestos indicados en concentraciones de 0,064, 0,32, 1,6, 8 y 40 mM en placas de 96 pocillos. Después de 48 h, se añadió 0,1 mg de MTT a cada pocillo, para una concentración final de 20%. Las células se incubaron a continuación a 37 ° C durante 4 h y la absorbancia se midió a 595 nm por espectrofotometría. El IC
50 valores se determinaron por análisis de regresión no lineal utilizando el software GraphPad Prism (GraphPad, Inc., San Diego, CA).
Luciferase reportero de ensayo
células HEK 293T se transfectadas transitoriamente con plásmidos pRL-TK (Promega, Madison, WI) pNF-B-Luc y usando Lipofectamine 2000 para 4 h en una placa de 96 pocillos. Las células fueron pre-incubadas con diferentes concentraciones de compuestos durante 1 h, y posteriormente se activan con 25 ng /ml de TNF-α por 18 h. Las actividades de luciferasa se midieron usando el kit Dual-Luciferase reportero de ensayo.
Western Blotting
lisados de células totales se prepararon por lisis directa en 2 x tampón de Laemmli (0,125 M Tris-HCl, pH 6,8, 4% de SDS, 20% de glicerol, 10% β-mercaptoetanol, y 0,004% de azul de bromofenol). Las muestras fueron luego fraccionados en gel de acrilamida al 12%, se transfirieron a una membrana de PVDF (Bio-Rad), y se incubaron con anticuerpos primarios específicos seguidos de los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa correspondientes. Las proteínas de interés se visualizaron por detección quimioluminiscente en una mini4000 ImageQuant LAS (GE Healthcare).
Inmunofluorescencia La tinción
Para el experimento p65 translocación, se cultivaron células HepG2 en portaobjetos de cámara durante 24 h y pre- se incubaron con TCN a 37 ° C durante 1 h, seguido por la estimulación de TNF-α por 20 min. Para la detección de la fosforilación IKKβ, las células se pre-incubaron con TCN a 37 ° C durante 1 h seguido por la estimulación de TNF-α durante 10 min. Las células fueron fijadas en tampón fosfato salino con 4% de paraformaldehído durante 20 min, y posteriormente se permeabilizaron en tampón fosfato salino con 0,1% Triton X-100. Para observar la localización de la subunidad p65, las células se incubaron con anticuerpo anti-p65 y el anticuerpo secundario conjugado FITC correspondiente antes de la tinción de los núcleos con DAPI. Para la detección de la fosforilación IKKβ, las células se incubaron con anticuerpo anti-fosfo-IKKβ y correspondiente Alexa Fluor 546 anticuerpo secundario. Las imágenes fueron observadas después usando un microscopio de fluorescencia (Eclipse Ti, Nikon).
apoptosis de las células de ensayo
apoptosis celular se analizó utilizando el kit de Anexina V-FITC /PI La apoptosis (BD Biosciences, Franklin Lakes , NJ) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 1,2 × 10
6 células /pocillo. Después de 24 h de tratamiento con el compuesto a las concentraciones indicadas, se recogieron las células y después se lavaron dos veces con PBS frío, y luego se resuspendieron en un tampón de unión que contiene Anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI). Después de incubación durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad, la intensidad de fluorescencia se midió usando un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ).
Ciclo Celular Análisis
células HepG2 ( 5 × 10
5cells /pocillo en placas de 12 pocillos) se incubaron con TCN para puntos indicados de tiempo (8, 16 y 24 h) y concentraciones (1,25, 2,5 y 5 m). Las células se recogieron y se lavaron dos veces con PBS y se fijaron con 70% durante la noche etanol. Las células fijadas se lavaron con PBS, y luego incubadas con 20 l de RNasa A (1 mg /ml) durante 30 min y se tiñeron con solución de yoduro de propidio (PI) (50 mg /ml de concentración final) en la oscuridad durante 1 h. La intensidad de fluorescencia se analizó mediante citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Los porcentajes de las células distribuidas en diferentes fases del ciclo celular se determinaron utilizando FlowJo 7.6.1.
La sobreexpresión de IKKβ CA
El dirigir la expresión de un constructo IKKβ constitutivamente activa (S177E, S181E) (IKKβ CA) se obtuvo de Addgene (Catálogo No.11105) [27]. células HepG2 se transfectaron con los plásmidos usando Lipofectamina 2000. Algunos 12 h después de la transfección, las células se trataron con TCN para adicional 24 h.
ARN de interferencia
células HepG2 fueron transfectadas transitoriamente con un control mezclado siRNA (5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3 ') y IKKβ-siRNA (5'-GGUGGAAGAGGUGGUGAGCTT -3') [28], respectivamente, a una concentración de 150 pmol plato /60 mm usando Lipofectamine 2000. se añadió después el compuesto probado resultante a las células transfectadas 48 horas después de la transfección.
IKKβ ensayo de la actividad quinasa
el ensayo de quinasa IKKβ se realizó con el kit Z '-Lyte ™ ensayo de quinasa siguiendo los protocolos del fabricante. En resumen, las proteínas humanas recombinantes IKKβ se incubaron con la mezcla de reacción de la quinasa con cantidades crecientes de TCN o estaurosporina, un inhibidor de quinasa, durante 1 h. Después, la reacción se detuvo con el reactivo de parada y la fluorescencia se detectó con excitación a 400 nm y las emisiones de 445 nm y 520 nm usando el lector de placas EnVision multimodo.
Resultados
TCN Inhibe la célula el crecimiento e induce la apoptosis en NF-kB constitutivamente activado células del cáncer
Hemos investigado la actividad anticancerígena de TCN por el ensayo de viabilidad celular MTT en cuatro líneas de células cancerosas que alberguen constitutivamente activado NF-kB [29] - [32]. En todas las líneas celulares ensayadas, TCN exhibió una inhibición del crecimiento evidente (Figura 1B). El IC
50 valores en HL-60, las células HepG2, A549 y PANC-1 fueron 0,18, 0,82, 0,39, y 0,28 M, respectivamente. Anexina V-FITC /PI tinción se analizó adicionalmente para la apoptosis celular con citometría de flujo. Después del tratamiento con 5 TCN mu M durante 24 h, la apoptosis celular en HL-60, HepG2, A549 y las células PANC-1 notablemente elevadas a 61,13%, 44,03%, 34,93% y 24,47%, respectivamente. Mientras tanto, la apoptosis en líneas celulares humanas normales BEAS-2B, HK-2 y CCD-841-CON se no afectada por el tratamiento TCN, incluso a la concentración más alta 5 mM, lo que sugiere TCN posee selectividad contra las células cancerosas (Figura 1C). El análisis de transferencia Western demostró también que TCN indujo significativamente la activación de la caspasa-8 y la caspasa-3, así como la escisión de PARP-1 en las cuatro líneas celulares de cáncer. El nivel de proteína Bcl-2, un regulador clave de la vía apoptótica intrínseca, fue también el regulado por el tratamiento TCN. Por otra parte, el nivel de survivin, una proteína anti-apoptótica, disminuyó dramáticamente en las células tratadas TCN, especialmente en las células HepG2 (Figura 1D).
TCN inhibe NF-kB de señalización e induce la detención del ciclo celular HL-60 y en G0 /G1
El efecto de TCN en la señalización NF-kB se probó en células HEK 293T transfectadas transitoriamente con un reportero de NF-kB (pNF-kB-Luc) .La expresión del gen reportero fue claramente activado por TNF -α, que fue inhibida eficazmente por TCN (Figura 2A). Para comprobar si TCN inhibe la intrínseca NF-kB en las células cancerosas, se estudió la expresión de NF-kB genes diana en los cuatro NF-kappa B activado líneas celulares de cáncer tratados con TCN. Los niveles de proteína de p65, XIAP, ciclina D1, y Bcl-xL fueron claramente regulados hacia abajo en las células tratadas TCN (Figura 2B). Dado que se requiere ciclina D1 para la progresión del ciclo G1 /S de células, se investigó el efecto de TCN en la detención del ciclo celular. células HepG2 fueron tratados con 2,5 M TCN. detención del ciclo celular G0 /G1 Obviamente se detectó tan pronto como 8h. Sin embargo, con prolong del tratamiento, se observó aumento de las células de la fase sub-G1, lo que indica la apoptosis celular inducida por TCN (Figura 2C).
células HEK 293T (A) fueron transfectadas transitoriamente con pNF-κB- plásmidos Luc seguido de tratamiento con TCN para 1 h antes de ser estimuladas con 25 ng /ml de TNF-α por 18 h. (B) Lisados fromcells trató con TCN durante 24 h se sometieron a análisis de transferencia de western con p65, XIAP, ciclina anticuerpos Bcl-xL y D1. células HepG2 (C) se trataron con 2,5 mM TCN para 8, 16 y 24 h. Las células se recogieron y se sometieron a análisis del ciclo celular. El porcentaje de células de diferentes fases del ciclo celular se analizó mediante FlowJo. Los experimentos se realizaron de forma independiente por triplicado, los resultados se presentan como medias y desviaciones estándar. La significación estadística se analizó mediante un modelo lineal, ** p & lt;.
0,01
Además, investigó los efectos de trichothecolone, un derivado de TCN, en el crecimiento celular y la actividad de NF-kB. Trichothecolone es otro metabolito aislado de hongo endofítico de
Maytenus Hookeri Loes.
, Que comparte el mismo núcleo padre con TCN, con la notable excepción de un sustituyente diferente a las 4-OH [24]. Como TCN, trichothecolone también inhibió el crecimiento celular y la actividad del indicador NF-kappa B (Figura S1), pero ambas actividades son mucho más débiles, lo que sugiere que el sustituyente en 4-OH de esta clase de compuestos es crítica para sus actividades biológicas.
TCN inhibe la fosforilación y degradación de I? B? y Bloques p65 nuclear translocación
se verificaron el efecto de TCN en la translocación nuclear de p65, un sello distintivo de la activación de la señalización de NF-kB. tratamiento con TNF-α induce la translocación de NF-kappa B desde el citoplasma al núcleo, y TCN bloqueado significativamente el proceso de translocación en las células HepG2 (Figura 3A). La sobreexpresión de p65 invierte notablemente el efecto inhibidor de TCN en la transcripción del reportero NF-kappa B (Figura 3B). A continuación, prueba el efecto de TCN sobre la fosforilación de I? B? y la degradación. TCN inhibe TNF-α fosforilación I? B? Inducida de una manera dependiente de la dosis y marcadamente bloqueó la degradación de I? B?. Más agudamente, encontramos que TCN inhibe la fosforilación de p65 en Ser536 (Figura 3C), lo que contribuye a la degradación de I? B? Y la activación de NF-KB de señalización [33], [34].
(A) HepG2 células pretratadas con 2.5 M TCN se estimularon con 25 ng /ml de TNF-α por 20 min y se procesaron para inmunotinción con anticuerpo anti-p65. Los núcleos de las células se tiñeron con DAPI (azul) y p65 se visualizó por fluorescencia verde. (B) las células HEK293T fueron transfectadas transitoriamente con pNF-B-Luc y los plásmidos de expresión de p65 seguido de tratamiento previo de 0,3 M TCN y la estimulación con 25 ng /ml de TNF-α. A continuación se midió la actividad del indicador. Se recogieron las células (C) HepG2 tratadas previamente con TCN después de la estimulación con 25 ng /ml de TNF-α por 10 min. Los lisados celulares se analizaron entonces mediante anticuerpos blot utilizando occidentales contra fosfo-I? B?, fosfo-p65 y I? B?. Los experimentos se realizaron de forma independiente por triplicado y los resultados se presentan como medias y desviaciones estándar. El análisis estadístico se realice con la prueba t de Student, * p & lt;. 0,05
TCN inhibe la fosforilación de IKKβ inducida por el TNF-α
I? B? y p65 son ambos sustratos de IKKβ quinasa, que se activa al someterse a la fosforilación (Ser 177 y Ser 181) y posteriormente fosforila I? B? [35], [36], se comprobó la fosforilación de IKKβ en células HepG2 tratadas TNF-alfa por inmunofluorescencia y análisis de transferencia Western. Se encontró que el nivel de fosforilados IKKβ disminuyó drásticamente después del tratamiento TCN, con el nivel total de proteínas IKKβ inalterada (Figura 4A y B). Para determinar si TCN interfiere con la actividad de la quinasa IKKβ directamente, un ensayo de actividad quinasa se llevó a cabo utilizando la proteína recombinante humana purificada IKKβ usando estaurosporina, un inhibidor de quinasa potente, como el control positivo. El resultado mostró que TCN no afectó a la actividad de la quinasa de IKKβ recombinante (Figura 4C). Estos datos demostraron que TCN inhibe la señalización NF-kappa B mediante la supresión de la activación de IKKβ vía el bloqueo de su fosforilación
.
fosforilación (A) IKKβ se detectó por el anticuerpo fosfo-IKKβ en las células HepG2 se estimularon con 25 ng /ml de TNF alpha de 10 min. Las células se fijaron, permeabilizaron y examinados por microscopio de fluorescencia. (B) Análisis de transferencia Western que muestra la inhibición de la fosforilación de IKKβ en células tratadas con 2.5 M TCN. Las células se recogieron después se estimularon con 25 ng /ml de TNF-α por 10 min. (C) la actividad IKKβ quinasa se analizó con IKKβ recombinante utilizando el kit de ensayo de quinasa Z'-Lyte ™. La fluorescencia se detectó a 400 nm para las longitudes de onda de excitación y 445 nm y 520 nm para las longitudes de onda de emisión. Los experimentos se realizaron de forma independiente por triplicado y los resultados se presentan como medias y desviaciones estándar.
Cell TCN cáncer apoptosis inducida está mediada por la inhibición de la fosforilación IKKβ
se investigó
muerte celular inducida TCN en las células que sobreexpresan forma constitutivamente activa (CA) de IKKβ [27], [28]. Como se muestra en la Figura 5A, la sobreexpresión de IKKβ CA en células HepG2 suficientemente activado NF-kB de señalización en el ensayo de actividad de la luciferasa. tratamiento TCN antagoniza con TNF-α en la activación de la señalización de NF-kappa B, mientras que IKKβ CA transfección invierte de manera eficiente el efecto inhibidor de TCN. Consistentemente, la sobreexpresión de IKKβ CA aborta la apoptosis celular inducida TCN en las células HepG2 (Figura 5B). Mientras tanto, el análisis de transferencia Western mostró la desactivación de la caspasa-3, PARP-1 y la regulación positiva de survivin de IKKβ CA (Figura 5C).
Las células HEK 293T (A) se transfectaron transitoriamente con IKKβ CA o vector vacío para 12 h, después se trataron previamente con 2,5 M TCN y se estimularon con 25 ng /ml de TNF-α por 18 h. Las células se sometieron a análisis de la actividad de luciferasa. células HepG2 (B) se transfectaron transitoriamente con IKKβ CA o vector vacío durante 12 h, y después se trataron con 2,5 mM TCN para 24 h. Las células se sometieron a análisis de la apoptosis. células HepG2 (C) se transfectaron con IKKβ CA o vector vacío durante 12 h, y después se trataron con 2,5 mM TCN para 24 h. Las células sometidas a análisis de transferencia Western para la expresión de las proteínas indicadas. (D) las células HepG2 se transfectaron transitoriamente con un siRNA revueltos o IKKβ-siRNA durante 48 h, se trató con 2,5 M TCN durante 24 h y se sometieron a análisis de apoptosis. células HepG2 (E) transfectadas transitoriamente con siRNA revueltos o IKKβ-siRNA se trataron con 2,5 mM TCN para 24 h. Los lisados celulares se recogieron y se sometieron a análisis de transferencia Western con los anticuerpos especificados. Los experimentos se realizaron de forma independiente por triplicado y los resultados se presentan como medias y desviaciones estándar. El análisis estadístico se realiza con la prueba t de Student, * p & lt;.
0,05
A continuación, se comprobó el efecto de IKKβ caída en la actividad apoptótica de TCN. En comparación con el tratamiento con TCN solos, desmontables de IKKβ con células HepG2 siRNA sensibilizados a la apoptosis inducida por TCN, con la proporción de apoptosis aumentando a 43,11% (18,17% en el tratamiento TCN solo) (Figura 5D). Como se muestra en la Figura 5E, la expresión de IKKβ en HepG2 se redujo en parte por el tratamiento de IKKβ siRNA. En consonancia con el aumento de la inducción de la apoptosis celular, la regulación por disminución de las proteínas anti-apoptóticas (survivina, XIAP y Bcl-2) por TCN se mejoró en desmontables células IKKβ, y la escisión de la caspasa-3 se aumentó también (Figura 5E) . Mientras tanto, la transfección con un control mezclado siRNA no tuvo efecto sobre la respuesta de las células HepG2 a tratamiento TCN (Figura 5D, 5E).
Discusión
Dada la conexión entre NF-kappa B y el cáncer, el desarrollo de inhibidor de NF-kappa B tiene un gran potencial en la represión de ciertos tipos de la proliferación del cáncer, así como la mejora de las terapias de cáncer existentes. Durante las últimas décadas, una amplia variedad de compuestos naturales y sintéticos se han encontrado capaz de suprimir la señalización de NF-kappa B, sino a través de una variedad de diferentes mecanismos. PS-341, un inhibidor del proteasoma, ha sido un fármaco de primera línea que se utiliza en el tratamiento del mieloma múltiple durante más de una década, que funciona mediante la inhibición de la actividad intrínseca NF-kB mediante el bloqueo de la degradación de I? B? [37]. Mientras tanto, Eriocalyxin B, un ent-Kauranoid aislado de
Isodon eriocalyx
, inhibe la activación de NF-kB al interferir con la unión de ambos p65 y p50 al elemento de respuesta [38].
IKKβ juega papel central en la activación de la vía de señalización NF-kB tanto canónica y no canónica. Tras la activación, la señalización de NF-kappa B conduce a la auto-polyubiquitination de factor de necrosis tumoral receptor asociado factor de 6 (TRAF6). El TRAF6 ubiquitinada, se movilizan factor de crecimiento transformante-β-quinasa activada 1 (TAK1) y la quinasa I? B (IKK), que consta de dos subunidades catalíticas, IKK1 (IKK) y IKK2 (IKKβ), y una subunidad reguladora, NEMO (modulador esencial de NF-kB, IKKγ), de modo que TAK1 puede fosforilar y activar IKKβ. La auto-fosforilación También se informó de estar involucrado en la activación de IKKβ [39], [40]. Debido a observado con frecuencia papel que la activación de IKKβ juega en la generación de cáncer, la proliferación y la metástasis, IKKβ se ha considerado una diana de fármaco prometedor para los tratamientos del cáncer [41], [42]. Aprobado por la FDA de fármaco huérfano para el tratamiento de cáncer de páncreas, CDDO-Me, también conocido como RTA 402, bloquea la ruta de NF-kB a través de la inhibición directa de IKKβ en Cys-179 [43].
En el estudio actual, describimos TCN, un inhibidor potente de NF-kappa B, bloqueado activación IKKβ mediante la supresión de su fosforilación y posteriormente inhibe la expresión de los genes diana de NF-kB vía de señalización, incluyendo XIAP, ciclina D1 y Bcl-xL, que regulan la supervivencia celular y celular proliferación. Como resultado, TCN indujo apoptosis celular y la detención del ciclo celular en NF-kB células de cáncer humano constitutivamente activadas, sin afectar las células normales con baja actividad basal de NF-kappa B (Figura S2). Teniendo en cuenta los complejos acontecimientos que asocian con la activación de IKKβ, los mecanismos precisos de cómo TCN deteriora la fosforilación de IKKβ son dignos de mayor investigación.
Los metabolitos de hongos endófitos colonizadora en la medicina herbal se ha encontrado que poseen diversas actividades biológicas [44 ], [45]. agentes contra el cáncer de muchas plantas anfitrionas se encuentran en metabolitos de los hongos endófitos, tales como Taxol, que se aisló a partir de hongos endófitos
Taxomyces andreanae
en
Taxus brevifolia
[46]. En el presente estudio, TCN, junto con 6β-hydroxyrosenonolactone, trichothecolone, roseocardin y roseotoxin B fueron aislados de hongos endofítico LZ93 de
Maytenus Hookeri Loes. Opiniones y se pusieron a prueba por sus actividades contra el cáncer (Figura S1). Entre los compuestos que aislado, TCN demostró ser el más potente. Estos hallazgos indican que las propiedades de TCN podría ser uno de los posibles mecanismos que subyacen a las actividades de eficacia y anti-cáncer de
Maytenus Hookeri Loes.
Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren que TCN, como un potente inhibidor de la señalización de NF-kB, tiene valor terapéutico prometedor para el tratamiento del cáncer y merece una mayor exploración.
Apoyo a la Información
Figura S1. Los bio-actividades de los compuestos aislados de hongos endofítico LZ93 de
Maytenus Hookeri Loes. Gratis (A) Las estructuras químicas de 6β-hydroxyrosenonolactone (6β-HRL), trichothecolone, roseocardin y roseotoxin B. (B) citotóxica efectos inducidos por trichothecin, trichothecolone, 6β-hydroxyrosenonolactone, roseocardin y roseotoxin B a 40 micras de HL-60, HepG2, A549 y células PANC-1 después del tratamiento de 48 h. (C) Efecto de trichothecin, trichothecolone, 6β-hydroxyrosenonolactone, roseocardin y roseotoxin B en la activación de NF-kappa B inducida por TNF-α. células HEK 293T fueron transfectadas transitoriamente con plásmidos seguidos por el pretratamiento con DMSO, o 0,3, 0,6 pNF-B-Luc y pRL-TK, 1,25 M TCN, o concentraciones sucesivas de 2,5, 5, 10 M de trichothecolone, 6β-hydroxyrosenonolactone, roseocardin o roseotoxin B para 1 h antes de la estimulación 25 ng /ml de TNF-α por 18 h. Progresivamente más oscuro sombreado de cada barra indica una mayor concentración
doi:. 10.1371 /journal.pone.0071333.s001 gratis (JPG)
figura S2. Diagrama esquemático de la inhibición de TCN IKKβ y la ruta de NF-KB.
Al estimulada por TNF-α, un panel de quinasas se someterá a la ubiquitinación y la fosforilación, lo que resulta en la activación de NF-kappa B a través de IKKβ medicado degradación de I? B? y translocación de p65. TCN inhibe la fosforilación de IKKβ, que a su vez resulta en la apoptosis y la inhibición del crecimiento en células de cáncer
doi:. 10.1371 /journal.pone.0071333.s002
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