Extracto
vesículas extracelulares (EVs) son factores clave para el cáncer en los que juegan un papel integral en la comunicación célula-célula y la transferencia de moléculas pro-oncogénicas a células receptoras lo que se confiere un fenotipo canceroso. Aquí, nos purifica vehículos eléctricos que utilizan enfoques bioquímicos sencillos a partir de múltiples líneas celulares de cáncer y posteriormente caracterizamos estos vehículos eléctricos a través de varios métodos bioquímicos y biofísicos. Además, se utilizó la microscopía de fluorescencia para mostrar directamente la internalización de los vehículos eléctricos en las células receptoras en pocos minutos tras la adición de los vehículos eléctricos a las células receptoras. Se confirmó que la proteína transmembrana EMMPRIN, postulado que es un marcador de los vehículos eléctricos, era de hecho secreta a partir de todas las líneas celulares estudiadas aquí. Se evaluó la respuesta a la estimulación EV en varios tipos diferentes de líneas de células receptoras y se midió la capacidad de estos vehículos eléctricos purificados para inducir la secreción de varios factores muy upregulated en los cánceres humanos. Nuestros datos indican que los vehículos eléctricos purificados preferentemente estimulan la secreción de varias proteínas implicadas en la conducción de cáncer en células monocíticas, pero sólo albergan actividad limitada en las células epiteliales. Específicamente, se muestra que los vehículos eléctricos son potentes estimuladores de la MMP-9, IL-6, TGF-β1 e inducen la secreción de EMMPRIN extracelular, que juegan un papel importante en la conducción de la evasión inmune, la invasión y la inflamación en el microambiente tumoral. De este modo, mediante el uso de un enfoque integral que incluye, y los métodos espectroscópicos bioquímicos, biológicos, hemos comenzado a dilucidar las funciones estimuladoras
Visto:. Redzic JS, Kendrick AA, Bahmed K, Dahl KD, Pearson CG, Robinson WA, et al. (2013) extracelular vesículas secretada por líneas celulares de cáncer estimular la secreción de MMP-9, IL-6, TGF-β1 y EMMPRIN. PLoS ONE 8 (8): e71225. doi: 10.1371 /journal.pone.0071225
Editor: Charles Jialin Zheng, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 10 Agosto, 2012; Aceptado: 30 de junio de 2013; Publicado: 1 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Redzic et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por el NIH número de solicitud 1R01GM096019-01A1 a EZE Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
desprendimiento celular es un proceso que ocurre en todas las células como un medio para eliminar los componentes celulares que no sean necesarios, sin embargo, el papel crítico de vesículas secretadas en la comunicación celular está empezando a surgir [1], [2]. Las proteínas de membrana son eliminados a través de una serie de diferentes mecanismos que incluyen ectodominio derramamiento y la secreción de proteínas de membrana de larga duración a través de vesículas secretadas [3]. derramamiento Vesicular se produce por injerto hacia el exterior de la membrana plasmática con la liberación de un tipo de vesícula conocido como microvesículas o por injerto hacia el interior de la membrana con la eventual liberación de vesículas conocidos como exosomas [4]. A continuación, nos referiremos colectivamente a ambas microvesículas y exosomas como vesículas extracelulares (EVs). Este fenómeno de desprendimiento vesicular, es decir, derramamiento EV, también se ha observado en un número de diferentes enfermedades, incluyendo trastornos neurológicos, infección viral y cáncer [5] - [7]. De hecho, se produce desprendimiento EV en mayor medida en las células cancerosas en comparación con las células sanas y los resultados en la liberación de moléculas pro-oncogénicos que incluyen proteínas, ARN y ADN [8], [9]. Recientemente, varios papeles de los VE que han surgido permiten que estas partículas para conducir los procesos necesarios para el desarrollo y progresión del cáncer, tales como la angiogénesis, la inflamación y la resistencia a fármacos [10]. Hay varios mecanismos por los que los vehículos eléctricos pueden actuar sobre células receptoras. Por ejemplo, estos pueden incluir ya sea la estimulación directa de los receptores celulares de proteínas en la superficie EV o internalización de los vehículos eléctricos por la célula receptora, que ambos llevan a la estimulación posterior de vías de señalización [1], [11]. Las células cancerosas parecen utilizar vehículos eléctricos como un medio de comunicación célula-célula mediante la transferencia de su contenido (ADN, ARN y proteínas) a una célula receptora, con lo que conduce a una transformación de una no maligno a un fenotipo maligno de la célula receptora [12 ] - [14]. El contenido de proteína de la EVs juega un papel integral en la internalización y la actividad de los vehículos eléctricos. Por ejemplo, las proteínas EV se acoplan a las células receptoras que resulta en la absorción de los vehículos eléctricos [15], y los vehículos eléctricos, se mostró a transferir onco-proteínas resultantes en cambio fenotípico de la célula receptora [12] - [14]. Sin embargo, una de las restantes preguntas con respecto a la actividad EV es si existen diferencias en la actividad EV observada entre los distintos tipos de células destinatario, así como el que las proteínas pueden ser secretadas por los vehículos eléctricos. Con este fin, hemos evaluado las diferencias en la actividad estimuladora EV en varios tipos de células diferentes destinatarios sondeando la secreción EV-estimulada de varios factores diferentes que han demostrado jugar un papel importante en los cánceres humanos.
Tenemos vehículos eléctricos purificadas de individuos sanos, pacientes con cáncer y de varias líneas celulares de cáncer de mamífero diferentes. Nuestro método de purificación produjo una población heterogénea de vehículos eléctricos que varían en tamaño desde 20 hasta 300 nm que indica a partir de una mezcla de exosomas y microvesículas [4]. Se detectó la proteína de longitud completa transmembrana extracelular llamada metaloproteinasas de la matriz del inductor (EMMPRIN), un marcador propuesta de los vehículos eléctricos [16], en los vehículos eléctricos purificados a partir de varios diferentes muestras de fluidos biológicos y de todas las diferentes líneas de células que evaluamos aquí. Nosotros, por lo tanto, utilizamos EMMPRIN como un marcador para nuestros vehículos eléctricos purificados. La microscopía de fluorescencia demostró que nuestros vehículos eléctricos purificados fueron internalizados por la célula receptora en un tiempo relativamente corto, (5-15 minutos), y se localizan alrededor del núcleo, lo que confirma que nuestro método de purificación dio como resultado en los vehículos eléctricos activos capaces de transferir su contenido en las células receptoras . Nuestra evaluación de base amplia de varias líneas celulares de receptor diferentes muestra que los vehículos eléctricos purificadas a partir de estos diversos tipos de células cancerosas exhiben actividad estimulante preferencial de proteínas secretadas hacia monocitos pero no células epiteliales. De hecho, mientras que descubrimos que los vehículos eléctricos secretados por todas las líneas celulares estudiadas aquí contienen longitud completa EMMPRIN, los vehículos eléctricos también estimulan la secreción de longitud completa EMMPRIN sí en células de leucemia monocítica humana. Descubrimos que los vehículos eléctricos son potentes estimuladores de factor de crecimiento transformante beta-1 (TGF-β1), metaloproteinasa de la matriz 9 (MMP-9) y la interleucina-6 (IL-6). Esta actividad estimuladora de los vehículos eléctricos para inducir la secreción de TGF-β1, MMP-9, IL-6 y EMMPRIN, sugiere un papel de los vehículos eléctricos en la conducción de la progresión del tumor por factores importantes para la evasión inmune, la invasión y la inflamación [17] estimulante - [19 ]. Nuestros datos nos acerca a una mejor comprensión de la biología de los vehículos eléctricos secretadas, el tipo de célula preferencial está estimulada por los vehículos eléctricos, y las moléculas que son secretadas por las células receptoras a la estimulación con los vehículos eléctricos secretadas.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética para el humano (paciente /donante) Colección de fluidos biológicos
muestras de sangre periférica se recogieron en la Universidad de Colorado hospital de Oncología Clínica cutánea. tubos de tubos al vacío (tapa roja, Becton Dickinson, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.) se utilizaron para la recolección de suero. Las muestras se transportaron inmediatamente al laboratorio, se centrifugó a 1200 xg durante 10 minutos y luego congeladas a -80 ° C hasta que se necesite. heparina de litio que contiene tubos al vacío (tapa verde, Becton Dickinson, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.) se utilizaron para la recolección de plasma, transportados inmediatamente al laboratorio, se centrifuga a 800 × g durante 10 minutos a 4 ° C. Las muestras de plasma se congelaron a -80 ° C hasta que se necesite. El líquido ascítico se recogió de los grifos de derrame pleural en radiología intervencionista de la Universidad de Colorado Hospital utilizando un vacutainer (tapa roja, Becton Dickinson, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.). Las muestras se transportaron inmediatamente al laboratorio en hielo, se centrifugaron a 800 xg durante 5 minutos a 4 ° C para los desechos celulares eliminado. Las muestras se congelaron a -80 ° C hasta que se necesite. La colección de muestras de fluidos biológicos fue aprobada por el Consejo de Colorado Multi-Revisión Institucional (COMIRB#05 a 0309), y se recogieron muestras tras el consentimiento informado por escrito.
Detección de cuerpo entero EMMPRIN en fluidos biológicos
suero, muestras de plasma y líquido ascítico Humanos se filtraron utilizando un filtro de 0,22 micras para eliminar cualquier célula y los restos celulares. 10 g de EMMPRIN humano biotinilado anticuerpo policlonal (I + amp; D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.) se utilizó para inmunoprecipitar (IP) EMMPRIN de cada muestra. El IP se llevó a cabo durante 2 horas a 4 ° C con rotación seguido de una incubación con 40 l de perlas de estreptavidina (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU.) durante 2 horas a 4 ° C con rotación. PNGasaF (New England Biolabs, Ipswich, MA, EE.UU.) se utilizó para deglycosylate la fracción IPed en una enzima de 01:10 a probar relación según el protocolo del fabricante. Se añadieron 5 l de 10 x tampón de carga SDS a la muestra y se hierven durante 10 minutos antes de la carga en un Bis-Tris gel de SDS-PAGE al 4-12% (Invitrogen, Grand Island, NY, EE.UU.) después se transfirió a un polivinilideno Immobilon membrana de fluoruro (PVDF) (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.) para análisis de transferencia Western. La membrana se bloqueó en leche al 2% durante 30 minutos después se incubaron en anticuerpo monoclonal EMMPRIN humano (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.) preparado utilizando una dilución 1:1000 en 2% de leche durante 1 hora. Después de la incubación del anticuerpo primario, la membrana se lavó con 1 X solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 30 minutos. IgG anti-ratón conjugado con HRP (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.) se preparó usando una dilución 1:4000, aplicado a la membrana y se incubó durante 1 hora seguido por un lavado adicional en 1 X PBS durante 30 minutos. detección de bandas de proteínas se realizó con el kit de detección de quimioluminiscencia ECL usando un kit de detección de Perkin Elmer (Perkin Elmer, Waltham, MA, EE.UU.).
cultivo de células
células MCF-7 fueron una especie regalo del doctor Heide Ford (Departamento de Farmacología de la Universidad de Colorado en Denver de Medicina) [20]. MDA-MB-231 células fueron una especie de regalo del Dr. Jennifer Richer (Departamento de Patología de la Universidad de Colorado en Denver de Medicina) [21]. U937, THP-1, las líneas celulares Molm13 y fibroblastos de prepucio humano (HFF) fuera una especie de regalo del Dr. James Degregori (Departamento de Bioquímica y Genética Molecular de la Universidad de Colorado en Denver de Medicina) [22] - [24]. L3.6pL células fueron una especie de regalo del Dr. Isaías J. Fidler (Departamento de Biología del Cáncer de la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center) [25]. Todas las células se cultivaron a 37 ° C con 5% de CO
2. células MCF-7 y MDA-MB-231 se cultivaron en medio DMEM suplementado con alta glucosa, L-glutamina, piruvato de sodio, 1% de penicilina /estreptomicina /anfotericina-B y suero bovino fetal al 10% (FBS; Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE.UU.). células L3.6pL se cultivaron en medio DMEM suplementado con L-glutamina, piruvato de sodio, 5 mM de aminoácidos no esenciales, 25 mg /ml plasmocin, 1% de penicilina /estreptomicina /anfotericina-B y 10% de FBS. U937, Molm13, las células THP-1 y HFF se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con L-glutamina, 1% de penicilina /estreptomicina /anfotericina-B y 10% de FBS.
Purificación de EVs
líneas celulares adherentes (MCF-7, MDA-MB-231, y L3.6pL Hek293Fpl) utilizado para la purificación de vesículas se cultivaron en placas de 150 mm hasta que las células eran 70% confluentes. Se eliminó el medio y las células se lavaron con 1 x PBS dos veces. Los medios apropiados suplementado con 3% de FBS agotado de vehículos eléctricos a través de ultracentrifugación se añadió a las células [26].
EVs de 5 × 10
5 células /ml de células U937 se cultivaron en T 75 en matraces RPMI 1640 y el 3% de la vesícula libre de FBS. En el tiempo de recolección, las células se sedimentaron por centrifugación durante 5 minutos a 1100 rpm y se recogió el sobrenadante. El sobrenadante de todas las células se recogieron cada 48 horas y el ácido etilendiaminotetraacético 4 mM (EDTA) (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE.UU.) se añadió al sobrenadante inmediatamente después de la recolección. El sobrenadante se centrifugó a 8000 rpm durante 10 minutos para eliminar los residuos celulares y después se filtró utilizando un filtro de 0,22 micras. El uso de un peso molecular 100 kDa cortó membrana de filtro (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.) el sobrenadante se concentró hasta un volumen de 1 a 2 ml. Los vehículos eléctricos de la muestra concentrada se purificaron utilizando una columna de Superosa 6 cromatografía de exclusión por tamaño preparatoria (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU.) equilibrada en 1 X PBS, pH 7,5. El contenido total de proteínas purificadas de los vehículos eléctricos se midió utilizando el ensayo de proteína total de Bradford (BioRad, Hercules, CA, EE.UU.).
Identificación de la Encuadre de cuerpo entero EMMPRIN dentro purificada EVs
Las fracciones de volumen vacío desde la cromatografía de exclusión molecular se reunieron y concentraron a 500 l. 10 g de EMMPRIN humano biotinilado anticuerpo policlonal (I + amp; D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.) se utilizó para inmunoprecipitar (IP) EMMPRIN de cada muestra. El IP se llevó a cabo durante 2 horas a 4 ° C con rotación seguido de una incubación con 40 l de perlas de estreptavidina (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU.) durante 2 horas a 4 ° C con rotación. PNGasaF (New England Biolabs, Ipswich, MA, EE.UU.) se utilizó para deglycosylate la fracción IPed en una enzima de 01:10 a probar relación según el protocolo del fabricante. Se añadieron 5 l de 10 x tampón de carga SDS a la muestra y se hierven durante 10 minutos antes de la carga en un Bis-Tris gel de SDS-PAGE al 4-12% (Invitrogen, Grand Island, NY, EE.UU.) después se transfirió a un polivinilideno Immobilon membrana de fluoruro (PVDF) (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.) para análisis de transferencia Western. La membrana se bloqueó en leche al 2% durante 30 minutos después se incubaron en anticuerpo monoclonal EMMPRIN humano (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.) preparado utilizando una dilución 1:1000 en 2% de leche durante 1 hora. Después de la incubación del anticuerpo primario, la membrana se lavó con 1 X solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 30 minutos. IgG anti-ratón conjugado con HRP (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.) se preparó usando una dilución 1:4000, aplicado a la membrana y se incubó durante 1 hora seguido por un lavado adicional en 1 X PBS durante 30 minutos. detección de bandas de proteínas se realizó con el kit de detección de quimioluminiscencia ECL usando un kit de detección de Perkin Elmer (Perkin Elmer, Waltham, MA, EE.UU.).
análisis de espectrometría de masas de la Secretada vehículos eléctricos
Después de la IP de EMMPRIN de las muestras de suero, a 10 l de muestra se sometieron a electroforesis utilizando un Bis-Tris gel SDS-PAGE al 4-12%. bandas de gel para la espectrometría de masas se visualizaron con colorante azul Comassie. Una banda en el rango de 25 a 35 kDa se cortó del gel y se cortó en cuadrados de 1 mm. A continuación, la banda de gel se lavó varias veces en 25 mM de bicarbonato de amonio /acetonitrilo al 50% solución (mM ABC /50% de ACN 25) para eliminar el exceso de colorante azul Comassie. La muestra se redujo con ditiotreitol 1 mM (DTT, Oro Biotecnología, St. Louis, MO, EE.UU.) durante 30 minutos a 70 ° C y después se alquiló con yodoacetamida 20 mM (IA, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) durante 45 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Las muestras se lavaron en agua destilada doble durante 15 minutos mientras se mezcla (vórtice), seguido de lavado mM ABC ACN 25/50% y finalmente lavado ACN 100%. Las muestras se secaron a continuación usando un sistema de vacío de velocidad de 10 l de 10 mg /ml de tripsina (Promega, Madison, WI, EE.UU.) se añadió a las bandas de gel y se dejó que la digestión de proceder durante la noche a temperatura ambiente. Las muestras se analizaron en un espectrómetro de masas híbrido ultra LTQ FT-(Thermo Fisher, Bremen, Alemania). desalado péptido y la separación se logró utilizando un sistema de HPLC bomba capilar /nano dual (Agilent 1200, Palo Alto, CA, EE.UU.). La ejecución de nano-bomba fue de 60 minutos a un caudal de 350 nl /min. Un gradiente de 41 minutos de 12% de ACN a 35% de ACN se utiliza para separar los péptidos. La ejecución de LC se controló mediante la grabación de forma secuencial las exploraciones de MS, en la celda de ICR, mientras que tres MS2 exploraciones se obtuvieron en la trampa de iones a través de CID. destilador crudo (UCSF, CA, EE.UU.) se utilizó para crear des-isotoped, las listas de pico centroided de los espectros en bruto (FGM formato). Estas listas de pico se contrastan con todas las entradas humanos en la base de datos de proteínas SwissProt usando el servidor de la mascota ™ (versión 2.2, Matrix Science). Para las búsquedas, las tolerancias de masas eran +/- 10 ppm para los picos de EM, y +/- 0,6 Da para los iones de fragmentos de MS /MS. especificidad tripsina se utiliza para permitir que se perdió 1 de escisión. Las modificaciones de la oxidación de metionina, la proteína de la acetilación N-terminal y el péptido N-terminal formación de ácido piroglutámico se permitió para. Una esperan valor de & lt; 0,05 fue considerado significativo
nanopartícula de seguimiento de evaluación de medición
seguimiento de nanopartículas análisis (NTA) es uno de los métodos utilizados para la detección de vehículos eléctricos secretadas dentro de una muestra dada.. Superose cromatografía de exclusión de tamaño de 6 fracciones de alto peso molecular se analizaron utilizando NTA Versión 2.2 Build 0375 instrumento (NanoSight, Amesbury, Wiltshire, Reino Unido). Las muestras se ensayaron a una dilución 1:10,000 y 1 ml de la muestra diluida se utilizó para el análisis.
microscopía de fluorescencia
1 × 10
6 células /ml de células se centrifugaron a 1100 rpm durante 5 minutos para sedimentar las células. Las células se fijaron con 200 l de formalina al 1% (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE.UU.) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se centrifugaron como anteriormente, se eliminó el sobrenadante y las células se lavaron con 1 x PBS dos veces. Las células se incubaron en 20 l de anticuerpo conjugado EMMPRIN-FITC (Ancell, Bayport, MN, EE.UU.) preparado a una dilución 1:50 y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las células se lavaron con 1 X PBS dos veces tras el período de incubación. tinción nuclear se realizó a temperatura ambiente durante 10 minutos con 1 l /ml de 4 ', 6-diamino-2-fenilindol (DAPI) mancha (Invitrogen, Grand Island, NY, EE.UU.). Las células se lavaron dos veces con 1 X PBS y se montaron en portaobjetos de microscopio.
Para evaluar la interacción y la localización de los vehículos eléctricos con células THP-1, los vehículos eléctricos se incubaron con tinción de Rojo Texas durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuro. EVs se centrifugaron durante 90 minutos a 100.000 xg en el rotor TLA-55. El sobrenadante se aspiró y el sedimento se lavó en 1 X PBS y luego girar de nuevo como más de 2 veces. Se eliminó el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en 20 l de 1 X PBS. EVs teñidas se añadieron entonces a las células y se incubaron en diferentes momentos que van desde 5 minutos hasta 24 horas a 37 ° C. Las células se visualizaron utilizando una Nikon Eclipse Ti (Nikon Instruments Inc., Melville, NY, EE.UU.) con un microscopio invertido Nikon 1.4 objetivo 100X PlanApo NA. Las imágenes fueron capturadas con una cámara Andor iXon EMCCD 888E (Andor Technologies, South Windsor, CT, EE.UU.). Análisis de imágenes y cuantificación se realizó utilizando el software de imágenes NIS Elementos (Nikon Instruments Inc., Melville, NY, EE.UU.). Todas las imágenes tomadas fueron adquiridos a temperatura ambiente. Tiempo de adquisición de imágenes eran 80 ms, 500 ms y 300 ms para los canales azul, verde y rojo, respectivamente. Las imágenes fueron procesadas para las figuras utilizando ImageJ y luego se producen usando Corel Draw.
midiendo el cambio en la expresión EMMPRIN Al Vesícula Estimulación
La citometría de flujo análisis de las células THP-1 se tiñeron con anticuerpo conjugado con FITC EMMPRIN se realizó para determinar si hay algún cambio en el nivel de expresión EMMPRIN superficie celular tras el tratamiento con vehículos eléctricos. EMMPRIN intensidad media de fluorescencia (MFI) se midió usando el Beckman Coulter Cell Lab Quanta SC citómetro de flujo en las células no tratadas, las células tratadas con 1 X PBS (tampón células tratadas) y las células EV tratados. Se tomaron todas las medidas 24 horas después de la estimulación y se realizaron utilizando toda la población celular, es decir, 1 × 10
6 células /ml estimulada durante 24 horas.
midiendo el cambio en la secreción de EMMPRIN Al Vesícula Estimulación
el sobrenadante del control, tampón tratada y tratada EV se recogieron muestras para determinar si hay algún cambio en la cantidad de EMMPRIN secretada a la estimulación. 100 l del sobrenadante se deglycosylated como se describió anteriormente, y las proteínas se separaron mediante electroforesis SDS-PAGE. secreción EMMPRIN se midió usando análisis de transferencia Western como se describió anteriormente.
Ensayos de actividad
La secreción de MMP-9 e IL-6 se midió en múltiples líneas celulares utilizando la detección de ensayo inmunoenzimático (ELISA) Enzyme Linked (ELISA Tech, Aurora, CO, EE.UU.). Para las células en suspensión, 5 × 10
5 células /ml fueron utilizados por 0,5 ml de medio en una placa de 12 pocillos. Para células adherentes, las estimulaciones se llevaron a cabo en placas de 12 pocillos con células a 70-80% de confluencia. Todos los ensayos de actividad se realizaron en medio libre de suero. El sobrenadante de las células estimuladas se recogió a las 24 horas después de la estimulación y se almacena en la -20 ° C hasta que se necesite. 100 l del sobrenadante se aplicó a la placa de ELISA. TGF-β1 se secreta en la forma latente, por lo tanto, las muestras se acidificaron a pH 2 usando 1 M de ácido clorhídrico (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE.UU.) y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente para generar la forma inmunorreactiva de TGF-β1 . Las muestras se neutralizan con hidróxido de sodio 1 M (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE.UU.). 100 l de la muestra activada se aplicó a la placa de ELISA. Las mediciones se llevaron a cabo según el protocolo del fabricante (ELISA Tech, Aurora, CO, EE.UU.).
Resultados
Encuadre de cuerpo entero EMMPRIN sirve como un marcador general de los vehículos eléctricos secretadas en los fluidos biológicos, así como de células cultivadas
la presencia de la forma EMMPRIN extracelular (s) se evaluó por primera vez en varios tipos de fluidos biológicos incluyendo sueros humanos, plasma, y fluido de ascitis para determinar si EMMPRIN puede ser utilizado como un marcador general de la presencia de los vehículos eléctricos como se ha sugerido recientemente [16]. Las muestras se filtraron usando un filtro de 0,22 micras para eliminar cualquier célula o restos celulares y se inmunoprecipitaron (IPED) utilizando un anticuerpo EMMPRIN. Tras la desglicosilación, se detectó la forma de longitud completa de la proteína (28 kDa) en el suero y plasma humanos tanto de donantes sanos y pacientes de cáncer, así como en el fluido ascítico recogido de pacientes con cáncer sin niveles observables de cualquier forma escindidos dentro de estos biológica líquidos (véase la Fig. S1A y la Fig. S1B para sueros y ascitis fluido humano, respectivamente). Se utilizó el análisis de espectrometría de masas de tríptico resúmenes para confirmar inequívocamente que EMMPRIN está en la muestra de suero IPed, Fig. S1C. Varios péptidos de mapeo para el ectodominio de EMMPRIN se detectaron y se utiliza para confirmar la presencia de EMMPRIN extracelular dentro de las muestras de suero, la fig. S1C. La presencia de una proteína transmembrana plena longitud tal EMMPRIN identificado aquí es consistente con una secreción general de proteínas transmembrana a través de los vehículos eléctricos en todos los fluidos biológicos, sin embargo, esto se muestra adicionalmente en lo que sigue.
Con el fin de proporcionar una constante y fuente fiable de los vehículos eléctricos para los ensayos posteriores a la sonda directamente sus roles estimulantes, los vehículos eléctricos se purificaron a partir de varias líneas celulares de cáncer de mamíferos diferentes. EMMPRIN se probaron para determinar si esta proteína transmembrana podría ser utilizado como un marcador general de los vehículos eléctricos para todas estas líneas celulares análogos a los vehículos eléctricos purificadas a partir de fluidos biológicos como anteriormente. Dos líneas celulares de cáncer de mama, MCF-7 y MDA-MB-231, se utilizaron y EVs purificadas a partir de esas líneas celulares se designan como EV
MCF-7 y EV
MDA, respectivamente. Además, tanto una línea celular de leucemia monocítica, U937, y una línea celular de cáncer de páncreas, L3.6pL, se utilizaron con los vehículos eléctricos derivados de estas líneas de células denotadas como EV
U937 y EV
L3.6pL, respectivamente. Los sobrenadantes de las células cultivadas en el medio adecuado suplementado con antibióticos y 3% de SFB gratuitas EV se recogieron cada 48 horas.
De los métodos utilizados anteriormente empleados para purificar los vehículos eléctricos secretadas, se optó por utilizar la cromatografía de exclusión de tamaño [27] . Específicamente, cromatografía de exclusión por tamaño Superose 6 se utilizó para seleccionar para las grandes fracciones de peso molecular, Fig. 1A (cuadro rojo). EMMPRIN se detectó en la fracción EV recogido de todas las líneas celulares analizadas aquí, Fig. 1B, lo que indica que la secreción EMMPRIN es un proceso que ocurre ampliamente.
A) de exclusión por tamaños perfil de elución de cromatografía de la purificación del medio condicionado por aislar a los vehículos eléctricos. El cuadro rojo corresponde al pico de elución para los vehículos eléctricos purificados. B) EMMPRIN es secretada a través de los vehículos eléctricos en todas las líneas celulares ensayadas, como se muestra por la transferencia Western sondado para EMMPRIN en las fracciones de vesícula purificó usando cromatografía de exclusión de tamaño. C) Análisis de seguimiento de nanopartículas detecta los vehículos eléctricos en la muestra purificada y valida nuestro método de exclusión de tamaño para purificar los vehículos eléctricos a partir de medios condicionados. D) La microscopía electrónica se utiliza para visualizar los vehículos eléctricos secretadas. Los datos mostrados son para EV
MDA.
Por lo tanto, nuestros estudios indican que aquí extracelular, la longitud total de la secreción EMMPRIN a través de los vehículos eléctricos es un fenómeno que ocurre ampliamente en lugar de un proceso específico de tipo celular y puede ser EMMPRIN utilizado como un marcador general de la presencia de los vehículos eléctricos.
Confirmación y Validación de los vehículos eléctricos purificados mediante el Análisis de Rastreo de nanopartículas, Microscopía Electrónica y espectrometría de masas
Hemos utilizado varios métodos comúnmente empleados para la detección y visualización EV para validar nuestro método de purificación EV más allá de nuestra presencia confirmada de EMMPRIN como marcador EV general (fig. 1A, B). Específicamente, se utilizó el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) para la determinación de la distribución del tamaño de los vehículos eléctricos en las muestras. Sobre la base de la distribución del tamaño de los vehículos eléctricos detectados usando NTA (Fig. 1C), se puede concluir que las líneas celulares utilizadas en este estudio secretan una población heterogénea de vehículos eléctricos que varían en tamaño desde 20 hasta 300 nm. El rango de tamaño indica que estas vesículas comprenden vehículos eléctricos más pequeños, conocidos como exosomas (10-100 nm), y los vehículos eléctricos de mayor tamaño conocidos como microvesículas (100-1000 nm). Tenga en cuenta que más de fraccionamiento en gradiente de sacarosa y análisis de transferencia Western posterior identificado EMMPRIN en ambas poblaciones EV (datos no presentados), lo que indica que EMMPRIN es un marcador general de ambos tipos de vehículos eléctricos. La microscopía electrónica (EM) se utiliza para visualizar los vehículos eléctricos secretadas a partir de diferentes líneas de células como se muestra para EV purificada
MDA (Fig. 1D). Los datos de EM también mostró una heterogeneidad en el tamaño de la vesícula como se determinó con NTA. análisis de espectrometría de masas también produjo la identificación de varios otros marcadores EV tales como CD63, CD81 y Anexina V como se muestra en la Tabla 1, con lo que además de validar el método de purificación utilizado aquí. Por lo tanto, dada la distribución del tamaño detectado con NTA y EM y la identificación de proteínas específicas EV, llegamos a la conclusión de que nuestro método de purificación produce una mezcla de exosomas y microvesículas.
vehículos eléctricos son rápidamente internalizados en las células receptoras
EV modulación de la función de la célula receptora ha sido propuesto para ser al menos parcialmente dependiente de su captación y transferencia de la carga inicial (véase la revisión de López-Verrilli [28]). De acuerdo con tal mecanismo propuesto, se encontró que los vehículos eléctricos purificados se internalizados en minutos por células de leucemia monocítica THP-1 (Fig. 2) y células de leucemia U937 monocíticas (Fig. S4) lo que confirma la actividad biológica de nuestros vehículos eléctricos purificados. En concreto, visualizamos la internalización de los vehículos eléctricos manchadas Rojo Texas como Puncti distinta en células teñidas con un anticuerpo EMMPRIN-FITC que permitió la visualización de la membrana celular (Fig. 2, derecha). Por lo tanto, en estos experimentos se utilizó el hecho de que se EMMPRIN inicialmente altamente expresado en la superficie celular receptor como marcador de la membrana celular. Imágenes individuales de a través del volumen celular Z-pilas se recogieron para confirmar que los vehículos eléctricos son de hecho internalizados en lugar de simplemente localizados en la superficie celular. También se cuantificó el porcentaje de células que internaliza los vehículos eléctricos contando la frecuencia de células positivas EV. Los datos promedio de tres mediciones independientes muestra que la internalización de vesículas se produce en el 76% de las células. Por lo tanto, la internalización de la vesícula no es una ocurrencia rara, pero un acontecimiento frecuente. Estos datos también muestran la localización de Rojo Texas EVs teñidas en la membrana celular, lo que indica que los vehículos eléctricos es probable incorporados en o asociado con la membrana celular, así como ser internalizada.
imágenes de microscopía de fluorescencia de las células THP-1 tratadas con rojo Texas vehículos eléctricos de colores. Panel izquierdo - THP-1 células teñidas con DAPI y EMMPRIN FITC. La señal de rojo es la señal de auto-fluorescencia de la célula. Panel central - THP-1 células tratadas con la tinción de Rojo Texas solo. La señal observada es la misma que en la imagen izquierda y se corresponde con el fondo rojo Texas y señal de la célula auto-fluorescencia. Panel derecho - células THP-1 tratadas con Rojo Texas vehículos eléctricos manchadas y visualizados después de un período de incubación de 5 minutos. La membrana celular se tiñe con anticuerpo EMMPRIN-FITC, los vehículos eléctricos se muestran en rojo y el núcleo teñidos con DAPI se muestra en azul. La barra de referencia es de 10 micras.
vehículos eléctricos estimulan la secreción de varios factores asociados con el cáncer
ensayos de actividad iniciales.
Inicialmente se revisaron varias líneas celulares de receptor para determinar el cual, si las hay, las células cultivadas fueron sensibles a nuestra EV purificada
MCF y EV
MDA. En concreto, la MMP-9 y la secreción de IL-6 (Fig. S2 y Fig. S3, respectivamente) se controló a la estimulación con EV
MCF-7 y EV
MDA usando análisis de inmunoabsorción enzimática (ELISA), ya que ambos de estas proteínas se upregulated en múltiples tipos de cáncer junto con el marcador EMMPRIN de los vehículos eléctricos [29], [30]. En general, nuestros datos muestran que hay selectividad preferencial en el tipo celular provocar una respuesta a la estimulación EV. Por ejemplo, las células monocíticas U937 eran más sensibles en la secreción de IL-6 y MMP-9 a la estimulación con vehículos eléctricos, en comparación con las células epiteliales. Hicimos observar un aumento en la secreción de IL-6 en tanto HFF y las células MBA-MB-231 a la estimulación con EV
MDA, sin embargo, ni la secreción de IL-6 o MMP-9 se estimuló con EV
MCF 7. Por lo tanto, ya que las células U937 obtuvieron la respuesta más notable a la estimulación con ambos tipos de vehículos eléctricos usados en estos ensayos ELISA iniciales, nos centramos en las células monocíticas, THP-1 y U937, en ensayos de actividad subsiguientes.
vehículos eléctricos estimulan purificadas la secreción de EMMPRIN sugerente de un bucle de retroalimentación positiva.
Dado que estudios previos han demostrado que EMMPRIN está involucrado en un bucle de retroalimentación positiva en algunas líneas celulares [31], el próximo querían evaluar el efecto de los vehículos eléctricos en expresión en la superficie celular EMMPRIN y la secreción de monocitos. THP-1 células fueron estimuladas con 10 g de proteína total para cada tipo de vesículas, es decir, EV
MCF-7 y EV
MDA, y se incubaron a 37 ° C durante 24 horas. Como se muestra en la Fig.