Extracto
Los líquenes producen diversas sustancias químicas únicas que se pueden utilizar para fines farmacéuticos. Para la detección de metabolitos secundarios novela de líquenes que muestran actividad inhibidora frente a la motilidad celular del cáncer de pulmón, hemos probado extractos de acetona de 13 muestras de líquenes recogidos en Chile. Physciosporin, aislado de
Pseudocyphellaria coriacea gratis (Hook f & amp;. Taylor) D. J. Galloway & amp; P. James, se identificó como un compuesto eficaz y mostró una actividad inhibitoria significativa en los ensayos de migración y la invasión contra las células de cáncer de pulmón humano. Physciosporin tratamiento reduce tanto los niveles de proteína y ARNm de N-cadherina con la consiguiente disminución de los niveles de marcadores de la transición epitelio-mesénquima, como el caracol y giro. Physciosporin también suprimió KITENIN (KAI1 C-terminal tetraspanin interactuar) mediada por la actividad de AP-1, tanto en la ausencia y presencia de factor de estimulación de crecimiento epidérmico. En tiempo real el análisis de PCR cuantitativa mostró que la expresión del gen supresor de metástasis, KAI1, se aumentó, mientras que la del gen de la metástasis potenciador, KITENIN, se disminuyó dramáticamente por physciosporin. En particular, la actividad de la región 3 'no traducida de KITENIN se redujo en physciosporin. Por otra parte, las actividades de Cdc42 y Rac1 se redujeron en physciosporin. Estos resultados demostraron que el liquen metabolito secundario, physciosporin, inhibe la motilidad de las células del cáncer de pulmón a través de nuevos mecanismos de acción
Visto:. Yang Y, Parque SY, Nguyen TT, Yu YH, Nguyen TV, Sun EG, et al . (2015) Liquen secundaria metabolitos, Physciosporin, inhibe la motilidad celular del cáncer de pulmón. PLoS ONE 10 (9): e0137889. doi: 10.1371 /journal.pone.0137889
Editor: Zhiqian Zhang, la Universidad de Pekín Hospital del Cáncer & amp; Instituto, CHINA
Recibido: 14 Junio, 2015; Aceptado: August 24, 2015; Publicado: 15 Septiembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF-2013R1A1A2004677, MRC-2.011-0.030.132) y por el Programa Nacional de Corea del Centro de recursos de Investigación ( NRF-2014M3A9B8002115). Este estudio también recibió el apoyo de una beca de investigación financiada por el Centro de Investigación de Medicina Natural Sunchon. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Abreviaturas : DMSO, dimetilsulfóxido; EGF, factor de crecimiento epidérmico; HPLC, cromatografía líquida de alta resolución; KITENIN, KAI1 C-terminal tetraspanin interactuantes; RMN, resonancia magnética nuclear; PBD, p21 dominio de unión; TLC, cromatografía de capa fina
Introducción
El cáncer de pulmón es el cáncer más frecuente y la principal causa de muerte por cáncer en los seres humanos en todo el mundo [1, 2]. Había alrededor de 1,8 millones de nuevos casos de cáncer de pulmón diagnosticados en el año 2012, lo que representa el 12,9% del total de casos de cáncer [1, 2]. Debido a la falta de un tratamiento eficaz para la enfermedad avanzada, el pronóstico del cáncer de pulmón sigue siendo pobre, con menos del 15% de sobrevivir 5 años después del diagnóstico [3]. Cuando el cáncer de pulmón se diagnostica en la presentación de los síntomas, que lleva un muy mal pronóstico, con una supervivencia global a los 5 años del 16% en los EE.UU. y menos del 10% en el Reino Unido [4]. En el cáncer de pulmón, la metástasis es la causa principal de muerte, y desentrañar el mecanismo de la progresión tumoral y la metástasis tanto, es de gran importancia [5]. En las etapas iniciales de la invasión local, las vías de señalización que controlan la dinámica del citoesqueleto de las células tumorales, se activaron la facturación de célula-matriz y las uniones célula-célula [6]. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos agentes químicos que inhiben la migración de células de cáncer y la invasión por la orientación de la señal por encima de que se requiere en el tratamiento de cánceres avanzados.
Los líquenes producen diversos metabolitos secundarios que muestran una variedad de actividades biológicas que incluyen la actividad anti-cáncer [7]. Hasta la fecha, casi un millar de metabolitos secundarios de líquenes han sido descubiertos y algunos de estos metabolitos liquen únicas son eficaces contra varios
in vitro
modelos de cáncer [8]. Sin embargo, aunque los líquenes son una fuente para el cribado de compuestos activos contra el cáncer, sólo un pequeño número de compuestos han sido probados [9]. Por lo tanto, el presente estudio examinó la actividad inhibidora de 13 especies de líquenes chilenas contra la migración y la invasión capacidad de las células de cáncer de pulmón humano y investigarse más a fondo los mecanismos moleculares posibles subyacente su actividad anti-metastásico para identificar el potencial nuevos agentes anti-metástasis.
Materiales y Métodos
Preparación de extractos de líquenes
los talos de los líquenes fueron recogidas de Chile en enero de 2009 y 2012 durante las excursiones en el Parque Nacional de Torres del Paine, Patagonia, organizado por el Dr. Pereira de la Universidad de Talca, Talca, Chile. El permiso para recoger muestras de líquenes de la ubicación fue emitida por la Administración de la Corporación Nacional Forestal (CONAF) de Punta Arenas y la Administración del Parque Nacional Torres del Paine, Región de Magallanes y la Antártica Chilena, que forma parte del Sistema Nacional de Protected Áreas silvestres del Estado de Chile. Los estudios de campo no implican ninguna especie en peligro de extinción o protegidas. Los duplicados fueron depositados en el Liquen de Corea y Afines bio-Centro (KOLABIC) en el Liquen Instituto Coreano de Investigación (KoLRI), Universidad Nacional Sunchon, Corea.
cromatografía en capa fina (TLC) de la materia liquen
talos del liquen se empaparon en 1 ml de acetona durante 5 minutos en tubos de 1,5 ml EP, y la solución concentrada fue descubierto en gel de sílice 60 F254 de placas pre-recubiertas (Merck Millipore, Darmstadt, Alemania) usando un microcap varias veces. Disolvente A [Tolueno: La dioxina: ácido acético 180: 45: 5 (v /v /v)], se describe en el mejorado método estandarizado de Culberson [10], se utilizó en este estudio. La placa de TLC manchado de las muestras se cargó en una cámara de paso gemela pre-saturada con el sistema de disolvente A y fue retirado de la cámara cuando el frente disolvente alcanza 14 cm desde la línea base de partida. Los resultados se visualizaron mediante el examen y el marcado en la luz del día (por pigmentos) y bajo UV a 254 y 350 nm. Después de esto, las placas se rociaron con ácido sulfúrico acuoso al 10% y se calentó a 110 ° C para asegurar la visualización completa. Después de la carbonización, los colores específicos de sustancias, tanto en la luz del día y bajo UV (350 nm), se observaron.
Dos especies de líquenes
cladonioides Lethariella (Nyl
.
) Krog
(Atranorin) y
Usnea longissimi gratis (ácido úsnico) se utilizaron como control estándar. Basado en el método normalizado [10, 11], relativa R
f valor se determinó para ayudar a identificar cada punto [12].
Separación e identificación de physciosporin
Pseudocyphellaria coriacea
(CL090002) extracto se separó por TLC como se describe anteriormente. El punto identificado como physciosporin se rascó fuera y se eluyó con acetona. El sobrenadante se seca y se pesa después de la centrifugación. cromatografía (HPLC) ensayo de líquidos de alta resolución se realizó para confirmar único pico dentro de la muestra purificada, y, a continuación, la estructura de physciosporin se confirmó por resonancia magnética nuclear (NMR) análisis (Figs A y B en S1 File).
cultivo de células
Las células de cáncer de pulmón humano A549 incluyendo, H1650 y H1975 se utilizaron en este estudio. Las células fueron cultivadas en RPMI 1640 medio de cultivo suplementado con suero bovino fetal al 10%, 1% de solución de penicilina-estreptomicina bajo un humidificado 5% CO
2 atmósfera a 37 ° C en una incubadora.
ensayo de curación de la herida
Las células A549 se sembraron a una densidad de 2,5 x 10 ~ 3
5 células /pocillo en placas de 6 pocillos de cultivo de tejidos (Corning, Nueva York, EE.UU.) y se cultivaron durante la noche hasta la confluencia. Las células en monocapa se rayan con una punta de pipeta estéril para crear una herida. Después, las células se lavaron dos veces con RPMI libre de suero 1640 para eliminar las células flotantes y se incubaron en medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con 2% de FBS con 5 mg /ml de extracto de acetona de
P
.
coriacea
o physciosporin. Las fotografías de las células fueron tomadas a 0, 24, 48, y 72 h después de la herida para medir la anchura de la herida. Para cada muestra, se tomó una media de cinco ensayos de la herida para determinar la tasa media de la migración. Los experimentos se repitieron al menos tres veces.
ensayo de invasión
Invasión ensayos se realizaron en cámaras de Boyden (Corning, Nueva York, EE.UU.). Los filtros de policarbonato (8 micras de tamaño de poro, Corning) pre-recubiertas con 1% de gelatina se utilizaron para ensayos de invasión. Las células (2 × 10
6) en 120 l de medio (RPMI 1640 que contiene 0,2% de BSA disuelto en PBS) con o sin /mL extractos de líquenes en bruto 5 mg o physciosporin se sembraron en la cámara superior. A continuación, se añadió 400 l de medio con 10 g /ml de fibronectina a la cámara inferior para servir como un agente quimiotáctico. Después de 24 h de incubación, las células en la cámara superior se fijaron con kit de Diff Quik (Sysmex). A continuación, las células unidas en la cámara superior se retiraron mecánicamente por hisopo de algodón. Las células que se adhieren a la cara inferior del filtro se tiñeron y se contaron bajo el microscopio en posición vertical (5 campos /cámara). Cada ensayo de invasión se repitió en tres experimentos independientes.
Western Blot
Las células tratadas con 5 mg /ml de extracto de acetona de
P
.
coriacea
o physciosporin durante 24 h se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo y se lisaron en tampón de lisis [13]. Los anticuerpos utilizados se adquirieron de Cell Signaling Technology (N-cadherina, α-tubulina) y BD Biosciences (E-cadherina). Los anticuerpos se detectaron con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (Thermo) utilizando Immobilon Western quimioluminiscente HRP Sustrato Kit (Millipore) y las imágenes de luminiscencia (Image Quant LAS 4000 mini). Las bandas se miden por Multi-Gauge 3.0 y su densidad relativa calculan en base a la densidad de las bandas de alfa-tubulina en cada muestra. Los valores se expresan como unidades arbitrarias de densitometría correspondientes a intensidad de la señal.
RT-PCR cuantitativa
La RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR) se realizó como se describe anteriormente [14]. Brevemente, el ARN total fue aislado de las células de cáncer de pulmón humano mediante el uso de RNAiso Plus (Takara, Otsu, Shiga Shiga 520-2.193, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN total de cada grupo de células tratadas fue convertido a cDNA utilizando un kit de transcriptasa inversa M-MLV (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) y SYBR verde (Enzynomics, Seúl, Corea). Los cebadores utilizados para la PCR en tiempo real fueron Caracol (hacia adelante) 5'-tcccgggcaatttaacaatg-3 'y (inverso) 5'-tgggagacacatcggtcga-3'; Twist (hacia adelante) 5'-cgggagtccgcagtctta-3 'y (inverso) 5'-tgaatcttgctcagcttgtc-3'; N-cadherina (hacia adelante) 5'-ctcctatgagtggaacaggaacg-3 'y (inverso) 5'-ttggatcaatgtcataatcaagtgctgta-3'; KAI1 (hacia adelante) 5'-gctcatgggcttgggct-3 'y (inverso) 5'-gagctcagtcacgatgccgc-3'; KITENIN (hacia adelante) 5'-cggaataaagacggcagagg-3 'y (inverso) 5'-tgctccgaggtgcctgtgat-3'; GAPDH (hacia adelante) 5'-atcaccatcttccaggagcga-3 'y (inverso) 5'-agttgtcatggatgaccttggc-3'. reacciones y análisis QRT-PCR se realizaron con CFX (Bio-Rad, Hercules, EE.UU.).
Reportero ensayo
Para el ensayo reportero de la AP-1, las células HEK293T fueron transfectadas con el plásmido de expresión y KITENIN AP1 plásmido reportero. Después de 12 h de transfección, las células se trataron con 5 mg /ml de los extractos de acetona de
P
.
coriacea
o physciosporin durante 48 horas con o sin EGF y después se analizó utilizando un sistema de ensayo de indicador Dual-Luciferase® (Promega, Madison, WI, EE.UU.). El plásmido indicador de luciferasa de Renilla (pRL-TK) se utilizó como un control interno para la eficiencia de transfección. La actividad de reportero TOPFLASH, NF-kB y STAT reportero también fueron probados en nuestro estudio
.
Para el ensayo KITENIN reportero, el promotor de KITENIN humano (-2344 a + 536) se amplificó por PCR a partir de ADN genómico de HEK293T células usando cebadores diseñados a partir de la secuencia genómica del locus KITENIN (1p13.1). Los productos de PCR fueron digeridos con
Kpn
I /
Bgl
II y se clonó en el plásmido pGL3basic (Promega, Madison, WI, EE.UU.) aguas arriba del gen informador de luciferasa. La construcción se confirmó por secuenciación. Se realizó la región 3 'untranlated KITENIN ensayo (3'-UTR) como se describe anteriormente [15]. Los experimentos se realizaron por triplicado, y fueron incluidos al menos tres resultados de experimentos independientes en un análisis. Plegables cambios se calcularon utilizando valores normalizados a la actividad de la luciferasa de Renilla.
Affinity-precipitación de GTPasas celulares
Las actividades Rac1 y Cdc42 celulares se determinaron utilizando GST-RBD /PBD como se describe anteriormente [16] . Brevemente, las células se lisaron en tampón de lisis. Los lisados se incubaron con perlas de GST-RBD /PBD a TA durante 1 h. A continuación, las perlas se lavaron cuatro veces con tampón de lavado. El límite proteínas Rac1 y Cdc42 se detectaron por inmunotransferencia utilizando un anticuerpo monoclonal contra Rac1 (Millipore 05-389) y Cdc42 (SANTA CRUZ SC-87). La actividad relativa de cada GTPasa se determinó mediante la cuantificación de cada banda de GTPasa unida a GTP y la cantidad total de GTPasa usando Multi-Gauge 3.0, y los valores de las bandas unido a GTP se normalizaron a la de la cantidad total. Todos los resultados se determinaron utilizando tres diferentes exposiciones de al menos tres experimentos independientes.
Resultados
Los extractos de acetona de líquenes recogidos en Chile inhiben la motilidad celular A549
La invasión y la migración de un juego papel crucial en la metástasis de las células cancerosas. Para encontrar una sustancia inhibidora de metabolitos secundarios de líquenes, enrollados ensayos de curación se realizaron en células de cáncer de pulmón humano A549 como una selección inicial de extractos de acetona de 13 líquenes chilenas (Tabla 1) [17-20]. Como se muestra en la figura 1A,
Rhizoplaca melanophthalma
,
Hypotrachyna sinuosa
,
Pseudocyphellaria coriacea
,
Pseudocyphellaria glabra
y
Nephroma sp
. inhibe la migración de células A549 a una concentración de 5 mg /ml. Se utilizó esta concentración como no citotoxicidad se observó en esta concentración (datos no mostrados). Las distancias entre los bordes de las heridas para las células tratadas con los cinco extractos de líquenes eran más anchos que los de las células tratadas con DMSO (Fig 1B).
(A) Análisis cuantitativo de los ensayos de migración de células A549 tratados con 5 mg /ml de extractos de acetona de
Pseudocyphellaria glabra
,
Pseudocyphellaria coriacea
,
Nephroma
sp.,
Physcia
sp.,
Flavoparmelia caperata
,
Hypotrachyna sinuosa
,
Rhizoplaca melanophthalma
,
Rhizoplaca melanophthalma
,
Pseudocyphellaria argyracea
,
Pseudocyphellaria verrucosa
,
Xanthoparmelia
sp.,
Protousnea sp
. y
Xanthoparmelia
sp .. (B) Imágenes representativas de los ensayos de migración de células A549 tratadas con los extractos de
R
.
melanophthalma
,
H
.
sinuosa
,
P
.
coriacea
,
P
.
glabra
y
Nephroma
sp. (C-D) ensayos de invasión de las células A549 tratadas con 5 mg /ml de los extractos de acetona de
R
.
melanophthalma
,
H
.
sinuosa
,
P
.
coriacea
,
P
.
glabra y Nephroma sp
. (C) y el análisis cuantitativo del número de células invadidas en cada tratamiento (D). Los datos cuantitativos se obtuvieron a partir de tres experimentos independientes, n = 3. Los datos representan la media ± S.E.M. (Error estandar de la media). *** P & lt;. 0,001 en comparación con las células A549 tratadas con DMSO
Para comprobar además si los extractos de líquenes anteriores tenían actividad inhibidora contra la invasión de las células A549, se llevaron a cabo ensayos de invasión usando dos recubierta con gelatina así cámaras. Como se muestra en la figura 1C, las células tratadas con los extractos de acetona de los cinco líquenes mostraron un menor número de células invadidas en comparación con el control tratado con DMSO. El análisis cuantitativo de los datos reveló que las diferencias fueron significativas (Fig 1D). Estos resultados indican que los extractos de acetona de
R
.
melanophthalma
,
H
.
sinuosa
,
P
.
coriacea
,
P
.
glabra
y
Nephroma sp
. presentan actividad inhibidora frente a la motilidad celular A549.
Physciosporin fue identificado como un metabolito secundario liquen activo de
P
.
coriacea
en la inhibición de la motilidad de células de cáncer de pulmón
Para investigar el compuesto principal de estos cinco líquenes candidatos, cinco extractos liquen acetona se analizaron individualmente por TLC (Fig 2A). Sobre la base de la relación R
f valores [12],
R
.
melanophthalma
,
H
.
sinuosa
,
y Nephroma sp
. compartir el mismo componente principal, ácido úsnico (mancha A, figura 2A), mientras que
P
.
glabra
y
P
.
coriacea tiene
principales compuestos distintos (punto c, figura 2A). Dado que el ácido úsnico es el metabolito liquen más ampliamente estudiado para la actividad anti-cáncer, elegimos "punto c 'en estudio. 'Punto c' se observó claramente dentro de
P
.
glabra
y
P
.
coriacea Estar entre la otra
Pseudocyphellaria
género que posee tenuiorin (punto d) y otros metabolitos desconocidos como el compuesto principal (panel de la izquierda, la figura 2B). Como "punto c 'en
P
.
glabra
y
P
.
coriacea
compartían un
valor f idéntica TLC R con physciosporin en
P
.
granulata
y era de color gris claro u oscuro en la luz del día y se convirtió en negro y denso bajo UV (izquierda y derecha del panel, la figura 2B), se identificaron "punto c 'como physciosporin [21-23].
P
.
faveolata
y
P
.
valdiviana
también poseen physciosporin como su componente principal (panel de la derecha, la figura 2B). El physciosporin utilizado en este estudio se aisló de
P
.
coriacea
como las cantidades de otros líquenes physciosporin que contiene fueron limitados. La pureza y la estructura de physciosporin fue confirmado por HPLC y análisis de RMN (Fig 2C; S1 File)
(AB) Cromatografía de Capa Fina (TLC) usando análisis (tolueno:. Dioxina: ácido acético = 180: 45: 5 , v) del sistema v /v /disolvente para extractos de líquenes que tienen actividad inhibidora de la motilidad celular A549 (a), los líquenes en
Pseudocyphellaria
género (B). "A" indica la ubicación de la mancha de ácido úsnico; 'B', por atranorin; 'C', por physciosporin; "D", para tenuiorin. especies de líquenes
L
.
cladonioides
y
T
.
longissimi
se utilizaron como control estándar para atranorin y ácido úsnico, respectivamente. (C) Estructura química de physciosporin. (D-E) Ensayo de migración de células A549 tratados con 5 mg /ml de extracto de acetona de
P
.
coriacea
o 5 mg /ml physciosporin (D), y el análisis cuantitativo de la longitud de la herida (E). (F-G) ensayos de invasión de las células A549 tratadas con 5 mg /ml de extracto de acetona de
P
.
coriacea
o physciosporin (F), y el análisis cuantitativo del número de células invadidas en cada tratamiento (G). Los datos cuantitativos se obtuvieron a partir de tres experimentos independientes, n = 3. Los datos representan la media ± S.E.M. (Error estandar de la media). *** P & lt;. 0,001 en comparación con las células A549 tratadas con DMSO
Con el fin de comprobar si physciosporin es el compuesto activo inhibiendo la motilidad de las células A549, physciosporin se puso a prueba en los ensayos de curación de heridas y ensayos de invasión. En comparación con el extracto de acetona de
P
.
coriacea
, physciosporin mostraron actividad inhibitoria similar contra la migración y la invasión de las células A549 (Figura 2D-2G). En particular, physciosporin inhibió la invasión de células A549 de una manera dependiente de la dosis (Fig 2F y 2G). Curiosamente, la inhibición del compuesto purificado fue mayor que la de los extractos crudos en el ensayo de invasión, pero ligeramente inferior en el ensayo de migración (Fig 2E y 2G). La actividad inhibidora del extracto de acetona de
P
.
coriaea Opiniones y physciosporin en También se observó motilidad de las células del cáncer de pulmón en H1650, H1975 células (Fig 3). La viabilidad celular no se alteró a la concentración dada de physciosporin (datos no mostrados). Por encima de todo, estos resultados demuestran que physciosporin es un liquen metabolito secundario activo de
P
.
coriacea Hoteles en la inhibición de la motilidad de las células del cáncer de pulmón.
(AB) ensayos de invasión de células de cáncer de pulmón H1650 y H1975 tratados con 5 mg /ml de extracto de acetona de
P
.
coriacea
o 5 mg /ml physciosporin (A), y el análisis cuantitativo del número de células invadida en cada tratamiento (B). Los datos cuantitativos se obtuvieron a partir de tres experimentos independientes, n = 3. Los datos representan la media ± S.E.M. (Error estandar de la media). *** P & lt;. 0,001 en comparación con las células A549 tratadas con DMSO
extracto de acetona de
P
.
coriacea Opiniones y physciosporin disminuyó el nivel de epitelio-mesenquimal marcador de transiciones
Para investigar el mecanismo de acción de la actividad inhibidora de la motilidad celular physciosporin contra el cáncer de pulmón, los efectos del extracto de acetona de
P
.
coriacea Opiniones y physciosporin se examinaron en varias vías de señalización. En primer lugar, los cambios en los niveles de epitelio-mesenquimal marcador (EMT) se midieron en las células tratadas (Fig 4). En nuestro estudio, la disminución de la expresión de la N-cadherina se destacaron en las células A549 tratadas con extracto de acetona de
P
.
coriacea
o physciosporin tanto a la proteína y los niveles de mRNA (Figura 4B y 4C), mientras que las de E-cadherina seguía siendo marginal (Fig 4A y datos no mostrados por E-cadherina ARNm). Además, las expresiones de Caracol y de la torcedura se forma dosis-dependiente disminuyó en un extracto de acetona de
P
.
coriacea
o physciosporin tratamiento (Figura 4C). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que el extracto de acetona de
P
.
coriacea Opiniones y physciosporin tener actividad inhibitoria contra el cáncer de pulmón de la motilidad celular, en parte, a través de la inhibición de la EMT.
(AB) Western blot de la E-cadherina (A) y N-cadherina (B) en las células A549 tratadas con 5 mg /ml de los extractos de acetona de
P
.
coriacea
o physciosporin. (C) El análisis cuantitativo de los niveles de mRNA de N-cadherina, Snail y giro en las células A549 tratadas con 5 mg /ml de los extractos de acetona de
P
.
coriacea
o physciosporin. Los datos cuantitativos se obtuvieron a partir de al menos dos experimentos independientes. Los datos representan la media ± S.E.M. (Error estandar de la media). * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt;. 0,001 en comparación con las células A549 tratadas con DMSO
extracto de acetona de
P
.
coriacea Opiniones y physciosporin suprimido mediada por KITENIN actividad de AP-1 y afectado a la expresión de KAI1 y KITENIN
A continuación, los cambios en la actividad transcripcional de β-catenina /LEF-1 (TOPFLASH), AP -1 (AP-1-luc), NF-kB (NF-kB-luc) y STAT (STAT-luc) se midieron en las células tratadas. En una prueba preliminar, única actividad AP-1 se redujo en un extracto de acetona de
P
.
coriacea
o physciosporin tratamiento de una manera dependiente de la dosis en ausencia de co-activador (datos no mostrados). En nuestro estudio anterior, hemos demostrado que KITENIN (KAI1 C-terminal tetraspanin interactuar) promueve el potencial tumorigénico de los cánceres, y el factor de crecimiento epidérmico (EGF) estimula mediada por KITENIN AP-1 de activación [24]. A fin de probar los efectos del extracto de acetona de
P
.
coriacea
o physciosporin en mediada por KITENIN actividad de AP-1, AP-1 reportero ensayos se realizaron en células co-transfectadas con KITENIN. mediada por KITENIN Como se muestra en la figura 5A, la actividad AP-1 se redujo en un extracto de acetona de
P
.
coriacea
o tratamiento physciosporin de una manera dependiente de la dosis, con y sin estimulación EGF. Con el fin de investigar cómo el extracto de acetona de
P
.
coriacea Opiniones y physciosporin suprimido AP1 actividad mediada por KITENIN, hemos probado los niveles KITENIN en las células tratadas. los niveles de mRNA KITENIN se redujeron por el tratamiento (Figura 5B). El gen supresor de metástasis, KAI1, a menudo es el regulado en las células tumorales metastásicas [25, 26]. Como KITENIN tiene una relación inversa con KAI1 u otros genes supresores de metástasis [27], hemos probado el nivel de mRNA de KAI1 en las células tratadas y se encontró una relación inversa similar entre KITENIN y KAI1 (Figura 5C). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que el extracto de acetona de
P
.
coriacea Opiniones y physciosporin inhibición de la motilidad celular A549, en parte, a través de la supresión de la actividad mediada por KITENIN AP-1 mediante la regulación de KITENIN y KAI1 expresiones. Para comprobar el nivel de ARNm de KITENIN puede ser cambiada por el tratamiento, se realizaron ensayos de luciferasa de promotor KITENIN y 3'-UTR. Como resultado, la actividad de KITENIN 3'-UTR se redujo drásticamente con el tratamiento (Fig 5E), mientras que la de promotor KITENIN permaneció constante (Fig 5D).
(A) AP-1 de ensayo de luciferasa de HEK293T células transfectadas con KITENIN y tratados con 5 mg /ml de extracto de acetona de
P
.
coriacea
o physciosporin en ausencia o en presencia de factor de estimulación de crecimiento epidérmico. (B-C) El análisis cuantitativo del nivel de mRNA de KITENIN (B) y KAI1 (C) en las células A549 tratadas con 5 mg /ml de extracto de acetona de
P
.
coriacea
o physciosporin. (D-E), el promotor KITENIN (D) y 3'-UTR (E) ensayos de luciferasa de las células HEK293T tratados con 5 mg /ml de extracto de acetona de
P
.
coriacea
o physciosporin. Los datos cuantitativos se obtuvieron de al menos tres experimentos independientes. Los datos representan la media ± S.E.M. (Error estandar de la media). * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt;. 0,001 en comparación con las células tratadas con DMSO
extracto de acetona de
P
.
coriacea Opiniones y physciosporin reducción de la actividad RhoGTPase
A continuación, se midieron los cambios en las actividades de RhoGTPases en las células tratadas (Figura 6). Para investigar los efectos del extracto de acetona de
P
.
coriacea Opiniones y physciosporin sobre las actividades de Cdc42 y Rac1, pull-down ensayos se realizaron utilizando GST GST-PBD (dominio de unión a p21). Los resultados mostraron que las actividades de Cdc42 y Rac1 se redujeron en 20% y 33%, respectivamente, en presencia de physciosporin (Fig 6A y 6B). RhoA actividad también se redujo en un extracto de acetona de
P
.
coriacea Opiniones y physciosporin (datos no mostrados). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que el extracto de acetona de
P
.
coriacea Opiniones y physciosporin inhibición de la motilidad celular A549, en parte, a través de la reducción de la actividad RhoGTPase. Los resultados demuestran que el metabolito secundario liquen, physciosporin, inhibe la motilidad de células de cáncer con mecanismos de acción específicos.
(AB) Los niveles de GTP Cdc42 (A) y Rac1 (B) se midieron en células A549 tratados con 5 mg /ml de extracto de acetona de
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o physciosporin. GTP-Cdc42 y -Rac1 se midieron utilizando GST-PBD. Las cantidades totales de Cdc42 y Rac1, se mostró a medir la actividad relativa. Los datos cuantitativos se obtuvieron a partir de tres experimentos independientes, n = 3. Los datos representan la media ± S.E.M. (Error estandar de la media). *** P & lt;. 0,001 en comparación con las células A549 tratadas con DMSO
Discusión
Una gran cantidad de sustancias químicas únicas han sido aislados de líquenes utilizados para fines farmacéuticos. En este estudio, un compuesto químico eficaz physciosporin se ha aislado de Chile liquen
Pseudocyphellaria coriacea
por su actividad inhibitoria frente a la motilidad de células de cáncer de pulmón. Physciosporin, un depsidone clorado, se aisló por primera vez en 1977 a partir de la liquen
Pseudocyphellaria physciospora
e identificado como metilo 2-cloro-4-formil-3,8-dihidroxi-l, 6,9-trimetil-11- oxo-11
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dibenzo [b, e] [l, 4] dioxepin-7-carboxilato de (metil-5 chlorovirensate) [22], pero su actividad biológica no se han reportado hasta la fecha. En este estudio, encontramos lo siguiente: 1) el extracto de acetona de
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y su subcomponente, physciosporin, inhiben la motilidad de las células de cáncer de pulmón; 2) el extracto de
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coriacea Opiniones y physciosporin suprimir EMT; 3) el extracto de
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coriacea Opiniones y physciosporin disminuir mediada por KITENIN actividad de AP-1 y afectar a la expresión de KAI1 y KITENIN; y 4) el extracto de
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coriacea Opiniones y physciosporin reducir la actividad RhoGTPase.
EMT, una conversión fenotípica esencial durante el desarrollo embrionario, la remodelación tisular y la cicatrización de heridas, juega un papel indispensable en la invasión tumoral y la metástasis [28-30]. Los aumentos en la expresión de N-cadherina y disminuciones en el nivel de E-cadherina (llamado "cambio de cadherina") son cruciales en la EMT y surgen durante la progresión del cáncer [31]. Especialmente, el nivel de N-cadherina parece representar el fenotipo mesenquimal de las células y un grupo de factores de transcripción incluyendo Snail, Slug, ZEB y torsión tiene un papel crucial en el control de EMT [32]. Snail, un factor de transcripción zinc-finger primero identificado en Drosophila, es un regulador clave de EMT [33]. Torsión también tiene un papel importante en la metástasis del cáncer. Por ejemplo, la inhibición de la expresión de ARN-Twist de interferencia corto afecta el vigor metastásico [34], y la regulación de Twist-1 puede contribuir a la resistencia a paclitaxel y antimicrotubule fármacos en pacientes con cáncer [35]. Nuestros resultados mostraron que los niveles de N-cadherina, caracol, y la torcedura se redujeron un extracto de acetona de
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y tratamiento physciosporin mientras que las de E-cadherina seguía siendo marginal (figura 4). Cabe destacar que, en algunos casos, los cambios en el nivel E-cadherina no son esenciales para la EMT [36] o actividad metastásica del tumor [37].
KITENIN es un gen que mejoran la metástasis. Recientemente, hemos identificado que el eje KITENIN /ErbB4-Dvl2-c-Jun es una señal aguas abajo del EGFR-independiente no convencional de EGF y media la invasión y la tumorigénesis de las células del cáncer [24]. En nuestros resultados, mediada por KITENIN actividad de AP-1 se redujo en el extracto de
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coriacea Opiniones y physciosporin. Especialmente, la expresión de KITENIN se redujo por el tratamiento y, para esto, la actividad 3'-UTR de KITENIN se redujo drásticamente (Fig 5). Unos microARNs KITENIN de metas de la supresión de la migración y la invasión de las células a través de la modulación de la expresión KITENIN fueron reportados y miR-27a, 30b-MIR, y miR-124 se encuentran entre los ejemplos [15]. Actualmente, no sabemos si physciosporin probable que actúa como microARN para suprimir la actividad 3'-UTR de KITENIN. Sin embargo, la señal aguas abajo KITENIN tan poco convencional /mediada ErbB4-de EGF desempeña una de las bases moleculares para conferir resistencia a los agentes anti-EGFR, el extracto de
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coriacea Opiniones y physciosporin puede tener un potencial actividad beneficiosa en la superación de la eficacia clínica limitada de la terapia anti-EGFR.
Rho GTPasas, miembros de la superfamilia Ras de GTPasas pequeñas como Rac1, Cdc42, y