Extracto
quimioterapias adyuvantes convencionales para la vejiga carcinomas de células transicionales (TCCs) pueden causar una fuerte toxicidad sistémica e irritación local. resveratrol no es tóxico inhibe el crecimiento celular TCC, pero su viabilidad en el manejo clínico de los países que aportan contingentes sigue siendo oscuro. Este estudio tuvo como objetivo evaluar la eficacia de seguridad y anti-TCC del resveratrol, el uso de los modelos experimentales más cerca de la condición de tratamiento clínico. células TCC EJ humanos fueron expuestos a 100 mM, 150 mM y 200 mM respectivamente resveratrol durante 1 hora y 2 horas para imitar la instilación intravesical de drogas y las respuestas de las células se analizaron por múltiples enfoques experimentales. Un modelo de ratón desnudo ortotópico TCC fue establecida por la inyección de células EJ en la capa sub-urotelial y se utiliza para la instilación intravesical resveratrol a corto plazo. Se evaluó la seguridad de la instilación resveratrol y se compara con la de MCC. Los resultados revelaron que 2 h 150 mM o 200 mM tratamiento con resveratrol con plomo a la notable detención en la fase S y la apoptosis a las 72 h de duración punto, acompañado con la fosforilación atenuada, la translocación nuclear y la transcripción de STAT3, la baja regulación de STAT3 genes abajo (survivina, cyclinD1, c-Myc y VEGF) y translocaciones nucleares de Sirt1 y p53. La importancia de la STAT3 de señalización en el crecimiento celular se confirmó mediante tratamiento de células EJ con inhibidor de JAK2 tirfostina AG490. La eficacia y seguridad de la instilación resveratrol se probaron según los resultados de modelos de xenoinjerto ortotópico ratón desnudo, porque este tratamiento causó supresión del crecimiento, la apoptosis y la inactivación distintivo STAT3 de los tumores trasplantados sin afectar urotelio normal. Nuestros resultados sugieren por primera vez los valores prácticos de resveratrol como un agente seguro y eficaz en el tratamiento post-operatorio de los TCC
Visto:. Wu ML, Li H, Yu LJ, Chen XY, Kong QY , Song X, et al. (2014) Corto Plazo resveratrol exposición causa
in vitro
y
En Vivo
de inhibición del crecimiento y la apoptosis de las células del cáncer de vejiga. PLoS ONE 9 (2): e89806. doi: 10.1371 /journal.pone.0089806
Editor: Irina Lebedeva V., Universidad de Columbia, Estados Unidos de América
Recibido: 26 Agosto, 2013; Aceptado: 24 Enero 2014; Publicado: 25 Febrero 2014
Copyright: © 2014 Wu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo con el apoyo de las subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nos. 81272786, 30971038, 81071971 y 81072063) y el Fondo de Investigación para los supervisores de doctorado del Departamento de Educación Nacional de China (20122105110005). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de vejiga es el tumor maligno más frecuente del tracto urinario, de los cuales el 90% es el carcinoma de células transicionales (TCC). La resección transuretral seguida de quimioterapia intravesical es el tratamiento estándar de los pacientes TCC [1]. La recurrencia es el principal riesgo de los pacientes de TCC debido a la dificultad para eliminar radicalmente los tumores agresivos [2]. En consecuencia, quimioterapias intravesicales adyuvantes se convierten en los principales criterios para evitar TCC recaída. Bacillus Calmette-Guerin, interferón-α, cisplatino, mitomicina C (MMC) y sus combinaciones se utilizan convencionalmente en la práctica clínica, mientras que sus eficacias son variables [3], [4] y por lo general causar fuerte toxicidad sistémica y complicaciones locales tales como hemorrágica cistitis [2]. Por lo tanto, está en urgente necesidad de explorar enfoque tóxico y más eficaz menor para una mejor gestión de los TCC.
El resveratrol ha sido considerado como un compuesto polifenólico no tóxico que encuentra en las uvas, bayas, cacahuetes y vino tinto [5 ]. Un cuerpo de evidencia muestra que el resveratrol es capaz de inhibir el crecimiento de muchos tipos de cáncer, como leucemia, cáncer de mama y los tumores cerebrales primarios [6] - [8]. En el caso de los cánceres de vejiga, el resveratrol disminuye eficazmente la viabilidad celular e induce la apoptosis de las células de cáncer de vejiga humanas y murinas [9] - [12]. Sin embargo, el valor práctico de resveratrol en la terapia anti-TCC no ha sido abordado por el uso del modelo experimental más clínicamente relevante (s) y en la forma de administración del fármaco local. En el estudio actual, la línea celular humana TCC, EJ [13], fue tratado en el corto plazo por el resveratrol para imitar la instilación de fármacos clínicos [14]. Las respuestas celulares y moleculares de las células EJ al tratamiento fueron analizados por varios enfoques. Mientras tanto, un modelo de ratón desnudo ortotópico TCC fue establecida por la inyección de células EJ en la capa sub-urotelial y se trató por el resveratrol en la forma similar con la instilación intravesical de drogas [15]. Las respuestas celulares y moleculares a esos tratamientos se evaluaron a partir de entonces.
Materiales y Métodos
Cultivo celular y tratamientos
Las células humanas TCC EJ [13] fueron cultivadas en la Dulbecco modificado Eagle medio esencial (DMEM) que contiene 10% de suero fetal bovino (Gibco Life Science, Grand Island, NY, EE.UU.) bajo 37 ° C y 5% de CO
2 condiciones. Las células (5 × 10
4 /ml) se colocaron en placas de placas de cultivo (Nunc, Dinamarca) y se incubó durante 24 horas antes de los experimentos
Resveratrol (Res;. Sigma Chemical, Inc., St. Louis , MO) se disolvió en dimetilsulfóxido (DMSO; Sigma) y se diluyó con medio de cultivo a las concentraciones de trabajo justo antes de su uso. Las células bajo condiciones de cultivo normales, tratadas por 0,2% de DMSO y se expusieron a 100 mM Res durante 48 h se utilizaron como normal, de fondo y de eficacia controles, respectivamente. Como se muestra en el diagrama (Figura 1 A), las células se trataron por EJ 100 mM, 150 mM o 200 micras Res durante 1 h, 1,5 h o 2 h en intervalos de 24 horas. Después de 1 h y 2 h tratamientos, medios que contienen Res fueron sustituidos por medio normal a 3 lavados. Por lo tanto, las células EJ fueron expuestas a diferentes concentraciones de Res para 3 veces (una vez al día) durante el 72 h experimento (Figura 1A). El número de células y viabilidades se comprobaron en intervalos de 12 horas. Los cubreobjetos teniendo células se fijaron en acetona fría o paraformaldehído al 4% (pH 7,4) para exámenes morfológicos e inmunocitoquímicos. Los grupos experimentales se establecieron por triplicado y los experimentos se repitieron tres veces para establecer conclusión confidencial.
A. diagrama esquemático de corto plazo en el tratamiento con resveratrol vitro. B. ensayo MTT lleva a cabo a 72 h después de los tratamientos mostraron que la exposición a corto plazo resveratrol disminución de la viabilidad celular y suprimió el crecimiento de células EJ en forma de la dosis y dependiente del tiempo. *, En comparación con el grupo N,
P
& lt; 0,01; **, En comparación con los 100 M, 150 M y 200 M Res-tratadas grupos en 1,5 horas y 2,0 horas,
P Hotel & lt; 0,01; #, En comparación con 1 h 150 mM tratamiento Res,
P Hotel & gt; 0,05; $, En comparación con 1 h 200 mM tratamiento Res,
P Hotel & gt; 0,05; ##, En comparación con 1 h 100 mM tratamiento Res,
P Hotel & lt; 0,05.
∧, en comparación entre 1,0 h, 1,5 h 2,0 h o 100 grupos tratados con Res m,
P Hotel & lt; 0,01; & Amp ;, comparación entre 1,0 h, 1,5 h o 2,0 h 150 grupos tratados con Res m,
P
& lt; 0,01;
∧∧, en comparación entre 1,0 h, 1,5 h 2,0 h o 200 M-Res tratados grupos,
P Hotel & lt; 0,01. C. H & amp; E y tinción TUNEL ensayo (en el recuadro de la región ciclado) realizaron en 2 h células EJ-200 tratado de resveratrol M a las 72 h. D. de citometría de flujo se realizó para determinar la distribución del ciclo celular y la apoptosis en las células EJ después de los tratamientos de resveratrol a corto plazo. 150 M y 200 M tratamientos de resveratrol para 2 h podrían tanto detención del ciclo celular en la fase S y aumentar fracciones apoptóticas a las 72 h en forma dependiente de la dosis.
proliferación de células y ensayos de muerte
Los efectos del resveratrol en la proliferación celular se determinó por 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil-tetrazolio (MTT) ensayo descrito en otra parte [8]. Los resultados se muestran como porcentaje de la viabilidad celular (OD de las muestras experimentales /DO del control) o valores de DO. Terminal desoxinucleótido transferasa (TdT) mediada etiquetado nick-end dUTP-biotina (TUNEL) de ensayo se empleó para detectar células apoptóticas según las instrucciones del productor (Promega Corporation, EE.UU.). Hematoxilina y eosina (H /E) tinción se realizó para observar los cambios morfológicos de las células EJ después del tratamiento.
Citometría de Flujo
Las células recogidas de los grupos experimentales fueron fijadas en etanol para la tinción con tinte de ADN y se resuspendieron en 0,5 ml a 1 ml de solución de yoduro de propidio (PI) que contiene RNasa y se incubaron a 37 ° C durante 30 minutos. perfiles del ciclo celular y los fraccionamientos de células apoptóticas se obtuvieron con un FACSVantage citómetro de flujo (Becton Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.) y los datos se analizaron con el software ModFit (Verity Software House, EE.UU.).
ARN El aislamiento y la transcripción inversa
-
Reacción en cadena de polimerasa
El ARN celular total fue aislado utilizando Trizol solución (Life Technologies, Grand Island, NY). Por el método descrito en otra parte [8], se realizó en muestras de ARN, seguido de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) con los cebadores (Tabla 1) para STAT3, c-Myc, ciclina D1 y survivina [16] transcripción inversa (RT) - [19]. Los productos de PCR se resolvieron en gel de agarosa al 1% que contiene bromuro de etidio (0,5 mg /ml), se visualizaron y se fotografiaron usando el sistema UVP BioSpectrum Imaging (UVP, Inc, Upland, CA). Los productos de PCR ß-actina generadas a partir de la misma solución a TA fueron citados como los controles cuantitativos.
inmunocitoquímica e inmunofluorescencia tinción
La tinción inmunocitoquímica (CPI) se realizó sobre los cubreobjetos obtenidos de cada de los grupos experimentales mediante el método descrito en otra parte [20]. Los anticuerpos contra la STAT3 humana, p-STAT3, survivin, cyclinD1, c-Myc, VEGF, Sirt1 y p53 se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology, Inc, CA. La reacción de color fue desarrollado usando 3, tetrahidrocloruro 3'-diaminobencidina (DAB). De acuerdo con la intensidad de marcado, los resultados de la tinción fueron evaluados por dos investigadores independientes y se calificó como negativo (-) si no se observó immunolabeling en las células diana, débilmente positivo (+) si el etiquetado era débil, moderadamente positivo (++), y fuertemente positiva (& gt; ++) cuando el etiquetado era más fuerte o claramente más fuerte que (++). Para la tinción de inmunofluorescencia (IF), la célula que porta cubreobjetos se enjuagaron con solución de fosfato tamponada (PBS; pH 7,4) por 3 veces, se bloquearon con suero de cabra al 10% en PBS (pH 7,4) durante 20 minutos, se incubaron durante la noche con el anticuerpo primario contra proteína diana y, finalmente, co-incubaron con marcado con fluorescencia de cabra anti-conejo o de conejo anti-IgG de ratón (1:200; Santa Cruz Biotechnology, Inc) a 37 ° C durante 60 minutos en la oscuridad. Los núcleos se marcaron mediante DAPI (fluorescencia azul). Se observaron los cubreobjetos y se fotografiaron con un microscopio de fluorescencia (BX53F, Olympus, Japón).
preparación proteína y Western Blotting
proteínas celulares totales se preparan a partir de las células bajo diferentes condiciones de cultivo [20] . Las proteínas de la muestra (50 g /pocillo) se separaron en electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida 10% y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido). La membrana se bloqueó con 5% de leche desnatada en TBS-T (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 150 mM y 0,5% de Tween 20) a 4 ° C, se enjuagó 10 minutos durante tres veces con TBS-T, seguido por 3 h de incubación a temperatura ambiente con el primer anticuerpo y después 1 h de incubación con conjugado con HRP anti-ratón o anti-IgG de conejo (Zymed Lab, Inc). El anticuerpo unido se detectó usando el sistema de quimioluminiscencia (Roche GmbH, Mannheim, Alemania). Después de retirar la señal de etiquetado por incubación con tampón de extracción [8], la membrana se volvió a sondear con otros anticuerpos de uno en uno hasta que todos los parámetros se examinaron.
La inhibición de la STAT3 activación con AG490
inhibidores de la JAK2 específica AG490 (Sigma) [21] se disolvió en DMSO y se diluye a las concentraciones finales de 50 mM y 80 mM con medio de cultivo. Cuatro grupos experimentales se establecieron de la siguiente manera: Grupo 1, cultivo normal; Grupo 2, el tratamiento con 1,2 ‰ DMSO como control de fondo; Los grupos 3 y 4, el tratamiento con 50 mM o 80 mM AG490. Los efectos de AG490 sobre la proliferación celular se determinó por MTT, citometría de flujo y tinción morfológica y ICC basado en cubreobjetos de STAT3, p-STAT3, cyclinD1, survivin, c-Myc y VEGF. Las muestras de ARN y proteínas se prepararon de todos los grupos para la RT-PCR y análisis de Western blot.
Declaración de Ética
Antes de los experimentos con animales, los protocolos de investigación fueron revisados y aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Comité de la Universidad médica de Dalian. Todos los trabajos que los animales de experimentación se llevó a cabo en pleno cumplimiento de los NIH (Institutos Nacionales de Salud) Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Todos los experimentos se realizaron con anestesia de hidrato de cloral y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
ortotópico TCC del modelo y de tratamiento intravesical
hembra Balb /c-ratones nude (4 semanas, 14-16 g de peso corporal) fueron criados en condiciones libres de patógenos específicos (SPF). Para establecer ortotópico modelo de cáncer de vejiga [22], los ratones fueron anestesiados intraperitonealmente con 3,5% de hidrato de cloral (0,1 ml /10 g de peso ratones cuerpo) [23]. El estado de la anestesia se evaluó por la pérdida de reflejo de enderezamiento (LORR), y el tiempo para inducir LORR era por lo general entre 5-10 minutos. En el aislador libre de gérmenes, las vejigas urinarias ratones fueron expuestos a través de una incisión en la línea media baja; 20 l suspensión de células EJ (1 × 10
6 células) se inyectó en su capa sub-epitelial y la aparición de "burbujas" semitransparentes indica la inoculación éxito. Tres días más tarde, los ratones se dividieron al azar en dos grupos (10 ratones /grupo) y se trataron por 50 l 200 resveratrol M o 50 l 0,9% de NaCl en intervalos de dos días. Después de la evacuación de la orina, un catéter recubierto de teflón, de calibre 24 se introduce en el lumen de la vejiga. Para evitar pérdidas de líquido, el catéter conectado con la jeringa se mantiene en su lugar durante 40 minutos. Todos los ratones se anestesiaron con seguridad y por lo general se recuperaron de la anestesia después de 2 horas. Al final del experimento 28 días, se recogieron las vejigas enteros, se pesaron y después se sometieron a exámenes histológicos y de inmunohistoquímica (IHC). La apoptosis se detectó mediante el ensayo de TUNEL y sus índices se obtuvieron mediante el recuento de células TUNEL-positivas frente a más de 1000 células observado en secciones tumorales [24].
Evaluación de la irritación local y la toxicidad sistémica
5 semanas de edad ratones hembra ICR (5 ratones /grupo) se trataron por vía intravesical con 50 l de 200 mM resveratrol. El tratamiento se realizó durante 6 veces en intervalos de 2 días. Los ratones tratados con 50 l de MMC 2 mg /ml (Sigma-Aldrich, disuelto en 0,9% NaCl) [25] de la misma manera la administración fueron citados como control. Para el final de los tratamientos, los pesos corporales fueron contados y la respuesta (s) de tejidos de la vejiga a los tratamientos fueron examinados en cuanto a la integridad de la mucosa, la congestión y hemorragia capilar.
Análisis estadístico
Las diferencias en las variables continuas fueron evaluadas por Estudiante
t
prueba o ANOVA de una vía. La significación estadística se definió como
P
. & lt; 0,05
Resultados
el tratamiento con resveratrol
A corto plazo TCC suprimido el crecimiento de células
ensayo MTT reveló que las células EJ el crecimiento fue suprimido por tratamientos de resveratrol a corto plazo de la dosis y de las modas relacionadas con el tiempo (Figura 1B). H /E y tinción TUNEL ensayo mostraron la muerte apoptótica frecuente en 2 h 150 M y 200 M-Res grupos tratados (Figura 1C). La citometría de flujo mostró que los tratamientos 2 h 150 micras y 200 micras Res causó la detención de la fase S y la apoptosis en poblaciones celulares EJ. Como se muestra en la Figura 1D, las fracciones G1 y S de células EJ fueron 62,6% y 33% en las células normalmente cultivadas, que cambió a 23,9% y 76,1% en 2 h 150 M Res tratados y 17,7% y 82,3% en 2 h 200 M Res tratada poblaciones, respectivamente. Los porcentajes de apoptosis en que normalmente se cultivan, 2 h 150 M y 200 M Res- grupos Res-tratadas fueron 0,394%, 4,98% y el 11,4% a las 72 h punto de tiempo (Figura 1D). El crecimiento de las células EJ fue inhibida eficazmente por el tratamiento constante de 100 M resveratrol.
Resveratrol inhibido STAT3 transcripción y activación
Debido a los papeles críticos de señalización STAT3 se activa en las células de CTP de la vejiga [26 ], el efecto del resveratrol sobre la señalización STAT3 en células EJ se analizó por RT-PCR usando las muestras de ARN extraído de las células EJ sin y con tratamiento Res. Como se muestra en la Figura 2A, STAT3 se expresó en células EJ normalmente cultivadas y las reguladas después de 2 h 200 mM tratamiento Res durante 72 horas. tinción CPI realizado en los mismos grupos experimentales reveló una fuerte tinción STAT3 (& gt; ++) ni en el espacio citosólico o núcleos de las células EJ normalmente cultivadas, que aparentemente debilitado (+) después de 72 horas de 2 h 200 mM tratamiento Res (Figura 2B; Tabla 2). También se encontró que el p-STAT3 fue localizada principalmente en los núcleos de células EJ y disminuyó después de 2 h de tratamiento 200 M Res durante 72 horas (Figura 2B; Tabla 2). De acuerdo con los resultados de RT-PCR e ICC, la transferencia Western mostró que 2 h 200 mM tratamiento Res causada STAT3 distinta y la reducción de p-STAT3 (Figura 2C). Para aclarar aún más los efectos de las 2 h de tratamiento Res sobre la señalización de STAT3, los niveles de STAT3 genes abajo (c-Myc, survivina, cyclinD1 y VEGF) en que normalmente se cultivan y 2 h 200 micras Res trataron células EJ fueron examinados por los métodos descritos anteriormente . Como se muestra en la Figura 2, la expresión de c-Myc, survivina, cyclinD1 y VEGF fue suprimida en 2 h 200 mM células EJ Res tratado (Tabla 2). Hallazgos similares se pudieron detectar en las células tratadas EJ constantemente por 100 M resveratrol durante 48 h.
Efectos inhibidores de AG490 sobre células EJ
Para determinar la importancia de resveratrol la inhibición de STAT3: provocada, AG490, un inhibidor selectivo de la fosforilación de STAT3, fue utilizado para tratar las células [21] EJ. La tinción inmunocitoquímica demostró que la fosforilación de STAT3 se inhibió en las células tratadas con AG490 en términos de reducción de STAT3 y etiquetado nuclear p-STAT3 (Figura 3, Tabla 2). La proliferación de las células EJ fue suprimida por AG490 de la dosis y del tiempo relacionado con la moda-(Figura 4A). La citometría de flujo análisis demostró que 48 horas 50 M y 80 M AG490 tratamientos causaron detención de la fase S sin inducir la apoptosis distinta. El G1 y fracciones S fueron 62,6% y 33% en normalmente cultivadas, 50,4% y 49,6% en 50 mM AG490 tratada y 17,9% y 75,7% en 80 mM AG490 células EJ tratados (Figura 4B). Estos resultados están en consistencia con los de tratamientos de resveratrol a corto plazo. Los porcentajes de apoptosis en los grupos tratados con AG490 normalmente cultivadas, 50 mM AG490- y 80 micras, con 48 h punto de tiempo fueron 0,394%, 0,194% y 1,77%, respectivamente (Figura 4B). En comparación con las células cultivadas EJ normalmente, c-Myc, cyclinD1, survivina y expresiones de VEGF se redujeron regulado en las células tratadas-AG490 (Figura 3, Figura 4 C y D; Tabla 2).
A . ensayo de proliferación celular MTT realizó en células cultivadas normalmente EJ y las células con AG490 (50 M y 80 M) y constantes 100 tratamientos M resveratrol. *,
P Hotel & lt; 0,01; **,
P Hotel & lt; 0,05. B. Flujo determinación de citometría de distribución del ciclo celular y la apoptosis en AG490 tratada población de células EJ. los niveles C y D. Evaluación de p-STAT3, cyclinD1, survivina, c-myc y VEGF en células EJ sin y con 50 mM o 80 mM AG490 tratamientos por RT-PCR y análisis de Western blot.
intravesical Tratamiento Resveratrol inhibido el crecimiento del tumor ortotópico
tinción H /e se llevó a cabo en los sitios inoculados y confirmó que la tasa de éxito de la implantación del tumor ortotópico fue del 100% (20/20). El esquema de tratamiento con resveratrol y dosificación horario intravesical se muestra en la Figura 5A. Las cargas tumorales se determinaron pesando todo el vejigas recogidas de todos los grupos [27], que reveló el mayor peso de la vejiga media en el grupo de control tratado con NaCl que en el grupo de resveratrol tratados (0,03362 g vs 0,01625 g,
P
& lt; 0,01; Figura 5B y C). TUNEL ensayo realizado en muestras de tumores ortotópico con y sin la instilación resveratrol corto plazo demostró notable muerte por apoptosis (apoptosis index = 23,2%) en los primeros casos (Figura 5D y E). La tinción inmunohistoquímica demostró que STAT3, p-STAT3 y sus genes aguas abajo c-Myc, cyclinD1, survivin y VEGF podría ser detectada en cualquiera citoplasma o el núcleo de los tejidos tumorales en el grupo control NaCl, pero se hizo aparentemente reducida en los tumores de resveratrol tratados (Figura 6 ;. Tabla 2)
A. Diagrama esquemático del diseño del estudio y programa de dosificación. Los tratamientos comenzaron 3 días después de la implantación (asteriscos). B. superior: el cateterismo uretral de ratones desnudos; Inferior: los tamaños de un par de vejigas urinarias portadores de tumores sin y con 2 h 200 resveratrol M instilación intravesical de 13 veces. C. Comparación de la carga tumoral entre grupo de instilación resveratrol y el control sin tratar en el día 28 después de la implantación del tumor. desnuda ratones normales (las mismas semanas de edad) vejigas libres de la implantación del tumor como control. *, En comparación con el grupo de N o grupo Res,
P
& lt; 0,01; #, En comparación con el grupo N,
P Hotel & gt; 0,05. D. H & amp; E y tinción TUNEL ensayo (las inserciones) para la evaluación histológica y la apoptosis de los tejidos de la vejiga urinaria con el tratamiento con resveratrol intravesical (2 h 200 resveratrol M durante 13 veces en intervalos de 2 días). Normal: la vejiga de un ratón desnudo; Control: la vejiga que tiene un tumor trasplantado ortotópico y sin tratamiento con resveratrol (0,9% NaCl tratamiento); Res: la vejiga que lleva tumor trasplantado ortotópico con 200 mM tratamiento resveratrol durante 2 h y 13 veces. E. Evaluación de los índices de apoptosis entre los grupos normales de control, y cosa
H & amp;. E y tinciones inmunohistoquímicas de STAT3, p-STAT3, cyclinD1, survivina, c-Myc y VEGF en las muestras de tejido de la vejiga tratado por 0,9% de NaCl (control) o 200 resveratrol mu M (Res) durante dos horas y 13 veces. Inserciones, las imágenes ampliadas de los tejidos tumorales.
tratamiento con resveratrol a corto plazo promovió la translocación nuclear de p53 y Sirt1
El resveratrol es conocido como un activador de la regulación de la información en silencio apareamiento tipo 2 homólogo (Sirt1) que modula la actividad de p53 por desacetilación [28], [29]. Por lo tanto, las influencias vivo in vitro e in del resveratrol sobre la actividad de SIRT1 de células EJ fueron investigados por los métodos de la CPI, IHC e IF. Como se muestra en la Figura 7, tanto Sirt1 y p53 fueron distribuidos en el espacio citosólico de células EJ y trasplantaron tumores sin tratamiento resveratrol, que aparentemente se transloca en el núcleo de las células EJ después in vitro 2 h de tratamiento 200 M Res a las 72 h de tiempo de punto y 2 h instilación intravesical resveratrol durante 13 horas, lo que sugiere el potencial vínculo funcional de estas dos proteínas.
a. Evaluación de la SIRT1 y distribución de p53 en las células EJ normalmente cultivadas y las células tratadas con resveratrol 2 M a las 72 h de duración punto por tinciones inmunocitoquímicas e inmunofluorescencia (las inserciones). B. Sirt1 y p53 orientados tinción inmunohistoquímica de los tejidos de la vejiga tratados con 0,9% de NaCl (control) o 200 resveratrol mu M (Res) durante dos horas y 13 veces. Inserciones, las imágenes ampliadas de los tejidos tumorales.
No se obvia irritación local de resveratrol tratados vejiga mucosa
instilación intravesical resveratrol se llevó a cabo en ambos ratones ICR libres de tumor hembra y la hembra tumor-teniendo ratones desnudos. Al final del experimento, el conjunto de vejigas se retiraron y se fijaron en 10% de formalina tamponada neutra para H /E basado en la tinción examen cistitis. Como se muestra en la Figura 8A, el epitelio de transición de las paredes de la vejiga urinaria estaban intactos, y no se observó ni la congestión capilar distinto ni infiltración de linfocitos inflamatoria en el espacio sub-mucosa de ratones ICR libres de cáncer de resveratrol-tratada. Una situación similar se encuentra también en el tumor de los tejidos circundantes de la vejiga de ratones desnudos portadores de tumores tratados por instilación intravesical resveratrol (datos no mostrados). Por el contrario, graves daños, congestión capilar epitelial y la hemorragia pueden ser observados en las vejigas urinarias MMC-tratado de ratones ICR (Figura 8A). La pérdida de peso corporal distinta fue encontrado en el grupo tratado con MMC (18,1 g en promedio) en comparación con el grupo tratado en-Res (27,2 g en promedio;
P Hotel & lt; 0,01; Figura 8B y 8C).
NaCl, ratones ICR tratados mediante instilación intravesical de NaCl al 0,9%; Res, 200 resveratrol mu M; MMC, 2 mg /ml de mitomicina C. Estos tratamientos se llevaron a cabo durante 6 veces en intervalos de 2 días. daño epitelial grave, congestión capilar y la hemorragia se pudieron observar en las vejigas tratadas con Res MMC tratadas pero no en NaCl y. Inserciones, imágenes de gran aumento de las regiones uroteliales indicada por la flecha. *
P
. & Lt; 0,01
Discusión
Carcinoma de células transicionales de vejiga urinaria /TCC es responsable de más de 130 000 muertes anuales en todo el mundo [30], debido en gran parte a la recidiva y metástasis [2]. La administración intravesical de agentes contra el cáncer ha sido adoptada para erradicar las células tumorales residuales [3], [4]. Sin embargo, estas terapias convencionales no pueden durar mucho tiempo debido a la toxicidad sistémica e irritación local [2]. Desde resveratrol no es tóxico [5] y ejerce efectos inhibidores sobre las células de CTP [9] - [12], sería un candidato alternativo para la gestión de TCC si su capacidad anti-TCC se puede demostrar aún más en las condiciones experimentales más estrechas para los estados clínicos. Para imitar la instilación intravesical de drogas, las células EJ TCC cultivadas fueron tratadas con 100 mM, 150 mM o 200 mM resveratrol transitoriamente en lugar de constante. Los resultados demostraron claramente que 150 micras y 200 micras tratamientos de resveratrol para 1,5-hora o 2 horas fueron suficientes para suprimir el crecimiento e inducir la apoptosis de las células EJ, lo que sugiere que el tratamiento con resveratrol a corto plazo podría lograr efectos similares anti-TCC como la de convencional fármacos [14]. Esta idea fue apoyada además por la regulación a la baja de la expresión de genes objetivo STAT3 y STAT3 y la reducción de p-STAT3 translocación nuclear en las células EJ de resveratrol-tratada, debido a la señalización STAT3 activada se asocia con el crecimiento celular TCC y la supervivencia [26]. Estos resultados prometedores in vitro nos animan a declarar si la instilación de corto plazo resveratrol también puede conducir a consecuencia terapéutica similar en un modelo de xenoinjerto ortotópico apropiado.
Aunque los efectos anticancerígenos de resveratrol se han evidenciado, este agente no tiene sin embargo, ha aplicado a la práctica clínica en gran parte debido a la baja biodisponibilidad intracelular de resveratrol sistémicamente administrado [31], [32]. A diferencia de tumores sólidos en la mayoría de los órganos, TCCs crecen hacia el exterior a la cavidad de la vejiga. Por otra parte, el fármaco infundido puede retenerse fácilmente en la vejiga y ejerce sus efectos directamente sobre el tejido /las células tumorales. Por lo tanto, un modelo de xenoinjerto ortotópico se estableció en ratón desnudo vejiga urinaria, que después se trató por el resveratrol en las mismas dosis que la del experimento in vitro y en la forma similar con la práctica clínica [14]. Se encontró que el crecimiento del tumor fue notablemente suprimida y las células tumorales se sometió extensa apoptosis. Dado que el experimento se realizó en los tumores dentro de la vejiga, los resultados obtenidos fueron más a la realidad de los pacientes y, por lo tanto, sería de los valores de la traducción.
Uno de los efectos secundarios graves de la quimioterapia intravesical con convencional medicamentos contra el cáncer es la cistitis hemorrágica [33]. Aunque la no toxicidad de resveratrol a células normales ha sido descrita en algunos órganos [32], aún se desconoce el efecto (s) de resveratrol en el tejido normal de la vejiga urinaria. Por lo tanto, una dosis efectiva anti-TCC de resveratrol (200 mM) se instiló en las vejigas de ratones libres de cáncer y se compara con la tratada por 2 mg /ml de mitomicina C. Mientras tanto, la respuesta (s) de los tumores trasplantados y su entorno mucosa de resveratrol se compararon. Se encontró que tanto la libre de cáncer y la mucosa que rodea tumorales mostraron epitelios de transición casi intacta sin congestión capilar distinto y la infiltración de linfocitos inflamatoria, mientras que una severa irritación y daño epitelial sucedieron a la mitomicina C tratados con mucosa. así Nuestros datos proporcionan pruebas in vivo de la propiedad cáncer de metas de resveratrol en la vejiga urinaria y sugieren además la idoneidad de resveratrol en el tratamiento clínico de TCCs humanos.
Resveratrol posee multifacética efectos moleculares incluyendo la inhibición de STAT3 señalización [20 ] y la activación de Sirt1 desacetilación [28]. la activación de STAT3 es frecuente en países que aportan contingentes y su inhibición puede conducir a la detención del crecimiento y la apoptosis [26]. Encontramos que la señalización de STAT3 también se activa en las células EJ TCC y corto plazo in vitro y en los tratamientos de resveratrol in vivo pueden inhibir la activación de STAT3 y regular a la baja la expresión de STAT3 y sus genes asociados con el cáncer de aguas abajo. Estos resultados, junto con los hallazgos similares de otros tipos de cáncer [20], [32], [34] sugieren que STAT3 es un blanco molecular importante de resveratrol. El crecimiento reprimido de células EJ AG490 tratados apoya aún más los papeles críticos de señalización STAT3 se activa en la promoción de la proliferación de células TCC. La falta de la muerte apoptótica en la población EJ AG490 tratados indica que el resveratrol puede alterar otros mecanismos de supervivencia de células más allá de la señalización STAT3. Hasta ahora, el papel de Sirt1 en la formación de TCC y la progresión sigue siendo poco clara. En este estudio, Sirt1 translocación nuclear se evidencia en las células EJ de resveratrol-tratada, en paralelo con p53 translocación nuclear. Se ha informado de que Sirt1 nucleocytoplasmic shuttling juega un papel crítico en la regulación de la actividad de SIRT1 [35]. Por otra parte, vía activada Sirt1-p53 puede inducir la detención del crecimiento de la senectud-como las células cancerosas [36]. Así, nuestros resultados proporcionan una señal para explorar mecanismo adicional anti-TCC del resveratrol y para dilucidar las implicaciones biológicas de co-nuclear translocación de las proteínas p53 y Sirt1
En conclusión, la seguridad y la eficacia de resveratrol en el tratamiento clínico. de la vejiga países que aportan contingentes se han validado mediante la exposición de aquí en breve las células humanas cultivadas EJ TCC y los tumores trasplantados ortotópico al resveratrol. Dos horas 200 mM tratamiento resveratrol es suficiente para suprimir in vitro y el crecimiento in vivo y para inducir la apoptosis de las células distinta EJ, presumiblemente a través de la inhibición de la activación de STAT3 y la inducción de p53 y Sirt1 translocación nuclear. Por otra parte, el resveratrol no ejerce efectos nocivos sobre las células uroteliales normales ni hace que la vejiga cistitis hemorrágica y la pérdida de peso corporal.