Extracto
A pesar de las recientes mejoras en los resultados del paciente utilizando nuevos receptor de andrógenos (AR) inhibidores de la vía, la resistencia al tratamiento de castración: PLOS ONE cáncer de próstata resistente (CRPC) sigue siendo un problema clínico. vías de resistencia alternativos co-orientación son de gran interés para el tratamiento de CRPC y retrasar la aparición de resistencia. Tanto la AKT y vías de señalización se activan MEK como el cáncer de próstata se desarrolla resistencia a las terapias AR-dirigida. Este estudio preclínico explora la co-orientación de estas vías en modelos de cáncer de próstata AR-positivo. Uso de distintas
in vitro
modelos de estados de enfermedad, incluyendo el cáncer de próstata dependiente (LNCaP), CRPC (V16D y 22Rv1) y ENZ-resistentes cáncer de próstata andrógeno (MR49C y MR49F), que evalúan la pertinencia de la orientación tanto AKT y vías MEK. Nuestros datos revelan que la inhibición de AKT induce la apoptosis e inhibe el crecimiento celular en líneas celulares de PTEN nulo, independientemente de su sensibilidad a la terapia hormonal; sin embargo, la inhibición de AKT no tuvo efecto en la línea celular positiva 22Rv1 PTEN. Curiosamente, hemos encontrado que la inhibición de MEK tuvo mayor efecto sobre las células en comparación con 22Rv1 LNCaP, V16D o células MR49C ENZ-resistente y células MR49F.
in vitro
, combinación AKT y el bloqueo MEK tenían evidencia de sinergia observado en algunas líneas celulares y ensayos, pero esto no fue consistente a través de todos los resultados.
In vivo
, la combinación de la inhibición de AKT y MEK como resultado la inhibición del crecimiento tumoral más coherente de xenoinjertos MR49F y la supervivencia específica de la enfermedad más en comparación con la monoterapia AKT inhibidor. Al igual que en nuestro
in vitro
estudio, 22Rv1 xenoinjertos fueron más resistentes a la inhibición de AKT, mientras que eran más sensibles a la inhibición de MEK. Nuestros resultados sugieren que la orientación AKT y MEK en combinación puede ser una estrategia valiosa en el cáncer de próstata cuando ambas vías se activan y apoyan aún más la importancia de caracterizar la vía oncogénica dominante en el tumor de cada paciente con el fin de seleccionar la terapia óptima.
Visto: Toren P, Kim S, Johnson M, Zoubeidi a (2016) AKT combinada y MEK Camino bloqueo en modelos preclínicos de cáncer de próstata resistente a la Enzalutamida. PLoS ONE 11 (4): e0152861. doi: 10.1371 /journal.pone.0152861
Editor: Zoran Culig, Universidad Médica de Innsbruck, Austria |
Recibido: 7 Octubre 2015; Aceptado: 20 Marzo de 2016; Publicado: 5 Abril 2016
Derechos de Autor © 2016 Toren et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. la financiación fue proporcionada por Discovery Grant, cáncer de próstata Canadá y AstraZeneca para A. Zoubeidi. PT fue apoyado por la Fundación Canadiense de Becas Urological Association. AstraZeneca participó en las discusiones sobre el diseño del estudio y revisión del manuscrito, pero la recolección de datos y el análisis y la decisión de publicar fue hecha por los autores. Las otras fuentes de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. AZ da a conocer que reciben financiación de la investigación de AstraZeneca y Gilead Sciences. PT da a conocer la recepción de fondos de investigación de Innocrin Pharma. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
Médico o la castración quirúrgica sigue siendo la primera línea de terapia sistémica para el cáncer de próstata metastásico (PCA) ya su descubrimiento hace más de 70 años [1]. Por desgracia, sigue siendo difícil curación después de la castración y los pacientes inevitablemente progresan para desarrollar cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC). potentes inhibidores de la vía del receptor de andrógenos (AR), tales como Enzalutamida (ENZ) y abiraterona ahora se utilizan comúnmente en el tratamiento de pacientes con CRPC. Si bien se mejora la supervivencia, sin embargo, la resistencia se desarrolla inevitablemente a estos agentes [2]. Se prevé que con el aumento del uso clínico de estos vía AR inhibidores más potentes que los enfoques dirigidos contra las vías de resistencia no-AR impulsados ganarán importancia creciente [3]. Por lo tanto, la comprensión y las vías de segmentación implicado en la resistencia tiene relevancia clínica importante.
La PI3K /AKT /mTOR y RAF /MEK /ERK vías de señalización desempeñan un papel importante en la supervivencia celular, la resistencia al tratamiento, y cooperan para facilitar la PCa progresión a CRPC [4-8]. Tanto AKT [9, 10] y ERK [11, 12] vías de señalización están regulados con CRPC y se asocian con un peor pronóstico [13, 14]. Existe una amplia diafonía entre estas dos vías, así como con otras vías oncogénicas [15, 16]. Hemos mostrado anteriormente que tanto AKT y ERK se activan después del tratamiento con ENZ en células de CaP [17]. Orientación de AKT por sí sola no es suficiente para inducir letalidad condicional por la señalización AKT conduce a la activación de la AR y, por tanto, la orientación sola retroalimentación no es una buena estrategia para combatir la resistencia ENZ [18]. Curiosamente, la inhibición dual de PI3K /AKT y las vías MEK /ERK se ha mostrado prometedor en modelos preclínicos de otros tipos de cáncer [19-22]. Los resultados de la combinación de un inhibidor de mTOR con un inhibidor de MEK en la transgénico
NKx3
.
1-PTEN
modelo de cáncer de próstata murino apoya aún más la razón de un enfoque combinado en el cáncer de próstata [14] la terapia.
por lo tanto, nos propusimos investigar combinación AKT más terapia de inhibidor de MEK en modelos de cáncer de próstata humanos, en particular los modelos de cáncer de próstata ENZ-resistentes. Se seleccionaron un panel de líneas celulares, incluyendo líneas celulares LNCaP derivados de ENZ-resistentes, así como la línea celular 22Rv1. La línea celular de cáncer de próstata 22Rv1 posee activación de la vía MEK /ERK [23], mientras que el MR49C ENZ-resistente y MR49F se reconocen para ser más dependiente de la ruta AKT [24]. Se demuestra que la combinación de bloqueo de la AKT y MEK sí mejora las respuestas en comparación con la monoterapia en algunas de ourin
in vitro Opiniones y
in vivo
experimentos de cáncer de próstata. En particular, los resultados varían considerablemente entre los sistemas de modelos con la ausencia de un beneficio adicional en algunos casos, destacando la necesidad de identificar adecuadamente qué pacientes se beneficiarán más de un enfoque de combinación.
Materiales y Métodos
líneas celulares de cáncer de próstata
El cáncer de próstata humano LNCaP y 22Rv1 líneas celulares utilizadas en este estudio fueron amablemente proporcionados por el Dr. Leland WK Chung [25] (1992, MDACC, Houston TX). V16D (castrar resistente), las células MR49F y MR49C (Enzalutamida resistentes) se obtuvieron a través del paso de xenoinjertos en serie de células LNCaP como se describe anteriormente [26] (Figura S1). Brevemente, se inyectaron células LNCaP a ratones y cuando el PSA sérico llegó a 50 ng /ml ratones fueron castrados. Cuando el PSA sérico de nuevo llegó a 50 ng /ml 5-6 semanas más tarde, los tumores fueron llamados resistentes a la castración. células V16D se derivaron de un resistente a la castración xenoinjerto LNCaP. Los tumores fueron extirpados y líneas celulares se generaron en medios libres de andrógenos. Para MR49C y líneas celulares MR49F, cuando xenoinjertos de LNCaP alcanzado el estado resistente a la castración, fueron tratados con 10 mg /Kg de ENZ con una disminución PSA posterior a valores séricos bajos. Cuando el PSA sérico regresó a niveles de castración resistentes o superior, los tumores fueron llamados ENZ-resistente. Estos tumores se pasaron luego se generaron 3 veces en los ratones castrados tratados con ENZ y líneas celulares. Las células se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) a 37 ° C en atmósfera de 5% CO2, con 10μM ENZ añadido a todos los medios de comunicación para MR49C y las células MR49F.
Reactivos
El AZD5363 inhibidor de AKT fue proporcionado por AstraZeneca (Macclesfield, Reino Unido). ENZ fue adquirido de Shanghai Haoyuan Chemexpress (Shanghai, China), PD0235901 de Selleck Chem (Houston, TX) y LY294002 y UO126 de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). LY294002 es un inhibidor de PI3K reversible; AZD5363 es un inhibidor competitivo pan-AKT [27]. PD0325901 es un inhibidor competitivo MEK1 /2, mientras que UO126 inhibe la MEK1 /2 en una, de manera selectiva no competitivo [28]. Las soluciones madre de AZD5363, PD0235091, UO126 y LY294002 se prepararon en dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma-Aldrich); ENZ se preparó de H
2O.
Ensayos de proliferación celular
La viabilidad celular se evaluó en placas de cultivo de 96 pocillos utilizando el reactivo WST-1 y /o ensayo de cristal violeta, tal como se describe anteriormente [26].
análisis del ciclo celular
análisis del ciclo celular con la tinción de yoduro de propidio se realizó tal como se describe anteriormente [29]. contenido relativo de ADN fue analizado por el flujo FACS Canto II citómetro usando el software cyflogic v1.2.1 (www.cyflogic.com) para su análisis.
caspasa-3 actividad ensayo
La caspasa-3 actividad fue evaluado utilizando el kit de ensayo de caspasa 3, con el sustrato fluorométrico acetil-Asp Glu-Val-Asp 7-amido-4-metil-cumarina (Ac-DEVD-AMC) (Enzo Scientific). Treinta microgramos de lisado de células enteras se incubó con caspasa-3 sustrato AC-DEVD-AMC a 37,5 ° C durante 2,5 horas y la actividad de la caspasa-3 se cuantificó con un fluorómetro con excitación a 365 nm establecer y 460 nm de emisión. Doblar las diferencias de cambio del control se calcula siguiendo la resta de las lecturas de los pozos en blanco sin lisado.
Western blot
Las proteínas totales se extrajeron en tampón RIPA como se describe anteriormente [29]. 30-50 g de proteína lisado se separó por SDS-PAGE y Western blot se realizó utilizando anticuerpos PSA primaria, AR (Santa Cruz Biotechnology), vinculina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), PARP, p-AKT Ser473 , AKT, p-ERK, ERK total, el S6 total y p-S6 (Tecnología de Señalización celular, Danvers, MA). La detección de anticuerpos secundarios se realizó mediante el sistema de formación de imágenes de infrarrojos Odyssey (Li-COR Biosciences) o ECL (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EE.UU.).
cuantitativo de transcripción inversa (RT) -PCR
extracción de RNA y RT-PCR se realizaron como se describe anteriormente [30]. monitoreo en tiempo real de la amplificación por PCR de ADNc se realizó utilizando los siguientes pares de cebadores y sondas:
AR gratis (Hs00171172_m1),
PSA gratis (Hs00426859_g1), y
GAPDH gratis (Hs03929097_g1 ) (Applied Biosystems, Foster City, CA) en el sistema de detección ABI PRISM 7900 HT de secuencia (Applied Biosystems), utilizando la expresión génica TaqMan Master Mix (Applied Biosystems). expresión del gen diana se normalizó a
GAPDH
niveles en muestras respectivas como un control interno.
Animales
tratamiento
Seis semanas de edad ratones desnudos atímicos macho castrado (Harlan Sprague Dawley, Inc.) se inyectaron por vía subcutánea con 2x10
6 MR49F células (en suspensión en 0,1 ml de Matrigel; BD Biosciences) en ambos flancos. Nueve ratones por brazo fueron aleatorizados para vehículo (metilcelulosa al 0,1%), AZD5363 100 mg /kg BID, PD0325901 5 mg /kg DO o la combinación. 10 mg ENZ /kg se administró antes de la inoculación y continuó hasta los tumores alcanzaron 200 mm
3. medidas de los tumores se midieron dos veces por semana y el volumen tumoral calcularon utilizando la fórmula L x W x D x 0,5236. Los fármacos se administraron como una sonda oral en 5 días, 2 de descuento. Los niveles de PSA se midieron semanalmente mediante inmunoensayo enzimático automatizado (Cobas, Montreal, Quebec, Canadá). Los ratones fueron sacrificados si la carga tumoral total fue & gt; 2.000 mm
3 o tenía & gt; 20% de pérdida de peso corporal. Para los 22Rv1 xenoinjertos, 2x10
6 células se inocularon en el costado izquierdo de ratones desnudos de castración. Ocho ratones por brazo fueron aleatorizados para vehículo, AZD5363 100 mg /kg BID, selumitinib (AZD6244; ARRY-142886) 25 mg /kg BID, y la combinación. Los xenoinjertos 22Rv1 se sacrificaron cuando el volumen del tumor era & gt; 1.500 mm
3. Todos los ratones fueron monitorizados regularmente para comprobar su estado clínico bajo la supervisión de un veterinario en la Universidad de Columbia Británica. En el sacrificio, todos los ratones fueron profundamente anestesiados con isoflurano antes de ser sacrificados con CO2. Los tumores recogidos en el sacrificio se dividieron en partes y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido o se fijaron en formalina. Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo al Consejo Canadiense de los Animales directrices y con la aprobación del Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Columbia Británica (protocolo#A12-0210).
La inmunohistoquímica
Un tejido microarrays de todos los tumores de xenoinjertos MR49F se construyó utilizando una microarrayer manual de tejidos (Beecher Instruments, Inc., Sun Prairie, WI). La tinción inmunohistoquímica se realizó como se informó anteriormente [31]. Todas las comparaciones de intensidad de la tinción se realizaron a 20 aumentos en muestras por triplicado por un patólogo cegado a la asignación del tratamiento.
El análisis estadístico
Todos los resultados se expresan como la media ± SEM, con un modelo lineal utilizado para detectar diferencias significativas entre tratamientos múltiples. Cuando ANOVA mostró diferencias significativas (p & lt; 0,05), se utilizó la prueba post-hoc HSD de Tukey para comparar las medias. la velocidad de crecimiento del tumor se calculó mediante regresión lineal. el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier de supervivencia al cáncer en comparación específica (CSS) y la supervivencia global, con el log-rank test se utiliza para comparar los grupos. CSS se definió como el tiempo desde el inicio del tratamiento hasta que el volumen total del tumor superó 2.000 mm
3 y la supervivencia global como el tiempo desde el inicio del tratamiento hasta el sacrificio. El índice de combinación (IC) se calculó usando el software Calcusyn (Biosoft, Cambridge, UK). Un CI & lt; 1 indica sinergia, un CI & gt; 1 indica interacciones antagónicas
Resultados
Efecto de la orientación de MEK y Akt vías de señalización AR
vía
Para investigar el. relevancia de AKT y las vías MEK en el CP, que dirige las vías respectivas utilizando AZD5363 (inhibidor de AKT) y PD0325901 (inhibidor de MEK). Se evaluaron sus efectos solo y en combinación en modelos de diferentes etapas de cáncer de próstata, incluyendo células sensibles a andrógenos (LNCaP), Castro células resistentes (V16D, 22Rv1) y ENZ-resistentes (MR49C y MR49F) (Fig 1). AKT bloqueo con AZD5363 se evaluó por su efecto sobre AKT efector aguas abajo p6SK y no sobre la fosforilación de AKT sí mismo debido a la naturaleza de AZD5363. Básicamente, AZD5363 induce un aumento de la fosforilación de AKT que es inactivo, se produce un fenómeno con muchas ATP competitivos inhibidores catalíticos de AKT, y se debe a la proteína que se llevó a cabo en una forma hiperfosforilada pero catalíticamente inactiva como consecuencia de la unión compuesto como se ha establecido anteriormente . AZD5363 se encontró para inducir una disminución en la fosforilación S6K en todas las líneas celulares; este efecto fue más pronunciado en el PTEN células nulas MR49C, MR49F, LNCaP y células V16D comparación con 22Rv1 células PTEN positivos (Fig 1). Se observaron efectos similares usando otro inhibidor de MEK (UO126) y el inhibidor de AKT (LY294006) o en combinación con Ay (Fig 1, S2 Fig). En 22Rv1 células, PD325901 abroga completamente la fosforilación de ERK, mientras que AZD5363 no tuvo efecto sobre la fosforilación de AKT aguas abajo efector S6K que fue sólo con la combinación de AZD5363 y PD0325901 (Fig 1). Sin embargo, no se observó disminución adicional en los niveles de pERK con la combinación en comparación con la monoterapia con inhibidor de MEK. Por otra parte, se observó que la inhibición de AKT aumentó tanto AR y PSA en la proteína y los niveles de ARN en LNCaP y sus derivados (figura 1). Aunque AZD5363 aumentó AR y los niveles de PSA en todas las líneas celulares, el efecto de PD0325901 en los niveles de AR y PSA solos o en combinación con AZD5363 varió entre líneas celulares (Fig 1). En contraste con las líneas celulares basado en LNCaP, PSA aumentó aún más por la combinación de AZD5363 y PD0325901 en 22Rv1 células. En particular, estos resultados reflejan datos similares con la combinación previamente probado con éxito de AZD5363 y ENZ, donde los cambios en la expresión de AR también diferían entre 22Rv1 y las líneas celulares basado en LNCaP (Fig S2) [32]. Tomados en conjunto, llegamos a la conclusión de que AKT y MEK cooperan para regular la vía AR.
(A) Efecto de AKT y MEK la inhibición de las vías de señalización corriente abajo. dependiente de la línea celular LNCaP CaP andrógeno, CRPC (V16D y 22RV) y ENZ líneas celulares resistentes MR49C, líneas celulares MR49F fueron tratados con AZD5363 1μM, PD0325901 20 M solo o en combinación durante 48 horas. Las proteínas totales se extrajeron y transferencias de Western se realizaron con AR, PSA y PI3K /AKT proteínas de señalización como se indica vía. se muestran transferencias representativos de experimentos duplicados. (B-C) Efecto de la inhibición de AKT y MEK sobre la vía AR. MR49C, líneas celulares MR49F y 22RV se trataron con AZD5363 1μM, PD0325901 20 mM solo o en combinación durante 48 horas. Se extrajo ARN de diferentes líneas celulares y cuantitativa en tiempo real se realizaron con sondas Taqman para AR (B) y AR PSA gen diana (C). se muestran los resultados representativos de los duplicados biológicos con triplicados técnicas.
Efecto de la combinación de MEK y bloqueo AKT en la apoptosis celular y la proliferación
Para determinar la actividad biológica de la orientación de señalización AKT y MEK vías de apoptosis de las células, se trataron nuestro panel de líneas celulares con AZD5363, PD0325901 o la combinación. Nuestros datos muestran que la combinación de AKT focalización y MEK induce apoptosis, como se muestra por la población del ciclo celular aumentado sub G0 /G1. Este efecto fue mayor que AZD5363 monoterapia en células CRPC V16D (17% vs 10%, P = 0,009) y MR49C ENZ-resistente (29% vs 12%, p = 0,005) y MR49F (12% vs 3%, p = 0,006 ) Células. Ninguno de los tratamientos mostró ningún cambio significativo en la fracción sub G1 /G0 en 22Rv1 células (Fig 2). Por el contrario, en las células LNCaP sensibles a los andrógenos, la terapia de tratamiento de combinación no mostró aún más la inducción de sub G1 /G0 en comparación con la monoterapia con AZD5363 (17% vs 16%, p = 0,76). La fase S y G2 /M fracciones parecían disminuir a una cantidad similar en MR49C, células MR49F y V16D con AZD5363 o de la combinación, con diferencias significativas tanto para los tratamientos de control (P & lt; 0,001). Por otra parte, AZD5363 y combinación PD325901 tratamiento indujo PARP escindida en las líneas celulares LNCaP basada en comparación con las células positivas PTEN 22Rv1 células (Fig 2). Aunque no es estadísticamente diferente, se observaron tendencias similares con la caspasa 3 ensayos de actividad (Figura 2).
(AE) de propidio flujo de yoduro de citometría de análisis del ciclo celular de las líneas celulares indicadas muestra fracción aumento del ciclo celular apoptótica (subG1 /G0) (paneles de la izquierda). Medios de experimentos por triplicado se representan +/- SEM. Los resultados representativos de todas las poblaciones del ciclo celular se muestran en paneles de la derecha. (F) las células indicadas se trataron con AZD5363 1μM, PD0325901 20μM, o la combinación durante 48 horas. Las proteínas se extrajeron y Western blot se realizó usando el anticuerpo PARP, vinculina se utilizó como control de carga. se muestran transferencias representativos de dos o más experimentos. (G) Actividad de la caspasa-3 en MR49C, las líneas celulares MR49F, 22Rv1, LNCaP y V16D trató con AZD5363 y /o PD0325901 durante 24 horas. La media veces el cambio +/- SEM de los valores agrupados a partir de al menos dos duplicados biológicos se muestran.
A continuación se investigó si el efecto observado en la apoptosis celular puede ser traducido a la viabilidad celular. Nuestros datos muestran que la orientación AKT usando AZD5363 afecta a la viabilidad celular en todas las líneas celulares ensayadas (Fig 3), mientras que la orientación MEK usando PD0325901 (Fig 3) o UO126 (S3 Fig) tenían una mayor actividad en 22Rv1 células en comparación con las otras líneas celulares además de confirmar nuestros datos sobre la población del ciclo celular y la escisión de PARP. Aunque se observaron tendencias para la disminución de la viabilidad y la sinergia con la combinación en comparación con la monoterapia en las células LNCaP y células V16D, en MR49C y células MR49F la combinación no apareció sinérgica (Figura 3). Esto se confirmó adicionalmente mediante la combinación de MEK U0126 inhibidor con el inhibidor de AKT LY294006 en MR49C, las células MR49F (S3 FIG). Se observó sinergia en 22Rv1 células con un índice de combinación. & lt; 1 (figura 3, que S3 Fig)
líneas celulares (AE) MR49C, MR49F, 22Rv1, LNCaP y V16D se trataron con AZD5363 y /o PD0325901 como indicó durante 48 horas y la viabilidad celular se evaluó mediante WST-1 de ensayo. Se muestran resultados combinados de los triplicados biológicos con técnicas triplicados. los índices de combinación se muestran inserción, con los valores. & lt; 1 indica sinergia
Orientación de AKT y las vías MEK en combinación inhibir el crecimiento tumoral y la supervivencia específica del cáncer de mejora
Dado que la actividad de la terapia combinada mostró diferencias relacionadas con la expresión de PTEN, se investigó
in vivo
cómo la orientación AKT y MEK influirán en el crecimiento tumoral en dos situaciones clínicas posibles (PTEN tumores positivos y negativos). Utilizamos las células MR49F ENZ-resistentes y CRPC 22Rv1 células para evaluar la
in vivo
eficacia de la combinación de la orientación y AKT vías MEK.
Los xenoinjertos MR49F fueron sensibles a AZD5363, haciendo la evaluación de beneficio adicional con MEK bloqueo desafiante. tratamiento de monoterapia con PD0325901 demostró la inhibición del crecimiento del tumor y demostró una tendencia no significativa a la menor de PSA en suero en comparación con vehículo (Fig 4). El tratamiento de combinación con AZD5363 y PD0325901 en los xenoinjertos MR49F no dio lugar a una mayor disminución en el volumen del tumor en comparación con AZD5363 monoterapia, pero la combinación no tienen una supervivencia significativamente mejorada cáncer específico (CSS) (P & lt; 0,001) en comparación con el vehículo y con el tratamiento PD0325901- brazos (figura 4). CSS media fue de 17 días para los ratones tratados con vehículo, 25 días para los ratones tratados con PD0325901, y no se alcanzó para ya sea solo o en combinación con AZD5363 PD0325901. No hay ratones en el grupo de combinación fueron sacrificados debido al tamaño del tumor después de 35 días de tratamiento. PSA en suero se redujo significativamente tanto en el AZD5363 y los brazos de tratamiento de combinación en comparación con el vehículo (Fig 4).
Después del establecimiento de tumores (200mm3) de la inyección subcutánea de células MR49F ENZ resistentes en ratones castrados bajo la presión de 10 mg /kg al día de ENZ, los ratones fueron tratados con 100 mg /kg, AZD5363 100 mg /kg BID, PD0325901 5 mg /kg QD o AZD5363 100 mg /kg BID + PD0325901 5 mg /kg QD. (A) Los datos representativos de MR49F significan se muestra el volumen del tumor durante 4 semanas. (B) Media MR49F la velocidad de crecimiento del tumor para cada grupo de tratamiento +/- SEM calculado utilizando la estimación de regresión lineal de la velocidad de crecimiento del tumor para cada ratón. (C) Media MR49F PSA semanal representa como factor de cambio desde la línea base para cada grupo de tratamiento +/- SEM. (D) parcela Cascada de las mediciones individuales de PSA después de 3 semanas de tratamiento para todos los xenoinjertos MR49F en el estudio. la supervivencia específica del cáncer (E-F) de Kaplan-Meier y las curvas de supervivencia global para los grupos de tratamiento de xenoinjertos MR49F. volumen de xenoinjertos (G) Media 22Rv1 tras el tratamiento con vehículo, AZD5363 100 mg /kg BID, selumetinib 25 mg /kg una vez al día o AZD5363 100 mg /kg BID + selumetinib 25 mg /kg una vez al día. La media se representa veces el cambio en el tamaño del tumor +/- SEM. plot (H) Cascada de los volúmenes tumorales de xenoinjertos 22Rv1 después de 6 semanas de tratamiento.
A continuación se evaluó la combinación de la inhibición de AKT y MEK usando 22Rv1 xenoinjertos en ratones castrados. AZD5363 se utilizó de nuevo como un inhibidor de AKT mientras Selumetinib fue elegido como un inhibidor de MEK, que pueden ser más clínicamente relevante, ya que se encuentra actualmente en evaluación clínica y recientemente fue aprobado para el tratamiento del melanoma. En contraste con el modelo MR49F, 22Rv1 tumores eran relativamente insensibles a AZD5363, pero demostró la inhibición del crecimiento del tumor tanto a Selumetinib y la combinación de AZD5363 Selumetinib más. Con todos 22Rv1 tumores de crecimiento relativamente robusto a pesar del tratamiento, no se encontraron diferencias significativas entre los grupos de tratamiento, aunque la inhibición mayor del crecimiento tumoral se observó con el tratamiento de combinación (Fig 4)
.
Análisis de los volúmenes de los tumores de ratones individuales en el modelo MR49F sugiere que el bloqueo combinado puede beneficiar a un subconjunto de los ratones (Fig 5). En el brazo de monoterapia con AZD5363, mientras que la mayoría de los tumores respondieron bien, en casos seleccionados, la inhibición del crecimiento tumoral fue mínima. Sin embargo, en el grupo de terapia de combinación, no se observaron valores atípicos (Fig 5). En particular, la tinción inmunohistoquímica de los tumores MR49F demostró tinción pERK en los ratones que demostró resistencia a AZD5363 (Fig 5). Sin tinción Perk significativa se observó en los ratones que respondieron al tratamiento (Figura 5), ni diferencias en la tinción ps6 o tinción Ki67 detectada entre el tratamiento combinado y el brazo de monoterapia con AZD5363 (figura 5).
(A) curvas de crecimiento del tumor individuales para todos los ratones en el estudio agrupados por tratamiento. (B) La inmunohistoquímica de Perk demuestra niveles detectables en 3 ratones con resistencia temprana al tratamiento AZD5363 (arriba); otros 3 ratones tratados con AZD5363 se muestran para comparación (parte inferior). (C) La tinción de muestras de microarrays demuestra que la tinción de pERK positiva sólo fue evidente en estos ratones. (D) La proporción de PS6 se reduce con AZD5363 y en mayor medida con la combinación de AZD5363 + PD0325901. tinción (E) Ki67 como un marcador de proliferación. Un microarray de tejido se construyó usando las muestras de tumor en cada grupo (7-9 por grupo). Las puntuaciones medias de intensidad de la tinción graduada por un patólogo cegado se muestran +/- SEM.
Discusión
A pesar del éxito de la castración y de inhibidores de la vía potente AR más recientes, como Enzalutamida, la resistencia al tratamiento se produce en todos los casos. AR señalización persistente es clínicamente evidente por un aumento del PSA. La persistencia de la AR-señalización puede ser impulsado por varios mecanismos de resistencia, incluyendo variantes de empalme AR, producción intra-tumoral de los andrógenos y la activación de las vías alternativas que apoyan AR de señalización, incluyendo el AKT y vías MEK [33]. La terapia de combinación en el CaP tiene un gran potencial para aumentar la supervivencia de los pacientes mediante el bloqueo de estas vías de resistencia.
A principios experiencia clínica en pacientes con CaP sugiere que la orientación AKT por sí sola no es una estrategia efectiva. Los ensayos clínicos de monoterapia con inhibidores de Akt en CRPC han demostrado un éxito limitado con este enfoque [34, 35]. Antes
in vitro trabajo
sugiere que la inhibición /AKT PI3K puede dar lugar a la sobre regulación de la /MEK vía Raf /ERK [36], y nuestros resultados en el modelo de xenoinjerto MR49F también sugiere que esto puede ocurrir en algunos casos . La diafonía bien reconocido entre estas vías proporciona una base para la combinación de estos dos inhibidores de [19-22, 37-39]. La experiencia clínica con doble focalización de MEK y Akt es limitada; primeros resultados en neoplasias malignas avanzadas sugiere que la doble orientación de las dos vías mejora la eficacia oncológica a costa de una mayor toxicidad [40].
Nuestro estudio pone de relieve las diferencias que pueden ocurrir entre los modelos de CaP positivos Ar y especialmente la relevancia de PTEN estado cuando la orientación de AKT y MEK vías. Curiosamente, la orientación de la vía AKT aumento de la transcripción de PSA en las células supervivientes y este efecto, se señaló anteriormente por otros [41], pueden ser importantes a considerar en el diseño de futuros ensayos clínicos con estos agentes dirigidos desde el PSA se usa comúnmente como un marcador de progresión. En los modelos ENZ-resistentes LNCaP derivados, la inhibición de MEK añadió un beneficio modesto en comparación con la inhibición de AKT; curiosamente apareció la sinergia mayor
in vivo
que
in vitro
. En 22Rv1 células, la inhibición de MEK solo tuvo un impacto significativo sobre la proliferación celular y la señalización, pero la combinación de MEK y la inhibición AKT demostró un beneficio adicional mínimo
in vitro
. Por lo tanto, mientras que las mejoras en la actividad contra el cáncer se observaron por algunas métricas con la combinación en cada modelo, cada modelo apareció relativa adicto a AKT y MEK, respectivamente, lo que limita el beneficio de la terapia de combinación.
Combinado de orientación de la MEK y vía de AKT se ha investigado en varios otros tipos de cáncer en modelos pre-clínicos, con resultados apoyan el uso de la combinación [19-22, 37-39]. En un cáncer de próstata pre-clínica
in vivo
estudio, PD0325901 se evaluó en combinación con la rapamicina inhibidor de mTOR [14]. Mientras que no se observó ninguna disminución significativa en Ki67 con la combinación, esto puede estar relacionado con la recogida de todos nuestros tumores al final del estudio y en ese momento los xenoinjertos de tumores eran resistentes al tratamiento. Recientemente, Park et al, mostró que la combinación de selumitinib y la inhibición del crecimiento tumoral pan-inhibidor de PI3K GSK2126458 mejorado en comparación con la monoterapia en el AR-negativos DU145 y PC3 xenoinjertos [42]. En general, sus resultados en los modelos AR-negativos son comparables a los resultados. En conjunto, nuestros datos sugieren que la eficacia de la orientación AKT y MEK es independiente del estado de enfermedad de cáncer de próstata y que la eficacia se correlaciona con la activación de estas vías en el tumor.
Nuestro estudio está limitado por varios aspectos de nuestros modelos de cáncer de próstata. células LNCaP parecen ser dependientes de la vía de AKT altamente. No obstante, como, líneas de células productoras de PSA positivas AR con una vía PI3K /AKT activado, que se parecen a un fenotipo CPRC común encontrado [43]. Además, nuestros modelos ENZ resistente demuestran varios fenotipos compatibles con enfermedad ENZ resistente clínica, tales como persistente localización AR nuclear, la mutación F876L AR, y la regulación positiva de enzimas steroiodogenic [26, 32, 44]. 22Rv1 células albergan las variantes de empalme de andrógenos, que predicen una peor respuesta a los inhibidores de la AR-vía [45]. La presencia de la mutación F876L Enzalutamida-agonística y la presencia de empalme AR dominante variantes limita nuestra capacidad para probar la eficacia de AKT combinado y la inhibición de MEK, junto con la inhibición de AR en modelos de cáncer de próstata avanzado. Además, aunque nuestros estudios in vitro no se realizaron en medios deficientes de andrógenos, no está claro si esto daría lugar a resultados significativamente diferentes, en particular en tumores CRPC pueden producir sus propios andrógenos a través de
de novo síntesis
vías [46] . Por consiguiente, nuestros resultados en las condiciones de castración
in vivo
no eran sustancialmente diferentes.
En conclusión, nuestros resultados en modelos celulares CRPC ENZ-resistentes sugieren que el tratamiento de combinación con AKT y la inhibición de MEK puede ser una combinación racional en un subconjunto de casos de cáncer de próstata resistentes que necesitan una mayor investigación. Nuestros resultados también sugieren la importancia de la orientación inhibidores de vías de tumores que son conocidos para ser activado; monoterapia en pacientes bien seleccionados puede ser tan eficaz como la terapia de combinación. En general, esto enfatiza la necesidad de una selección racional, biomarcador impulsada por los pacientes como terapias dirigidas son evaluados en ensayos clínicos.
Apoyo a la Información
S1 Fig. MR49C células son resistentes a ENZ.
5X10
4cells se sembraron en placas de 12 pocillos, a continuación, tratados con diferentes concentraciones de ENZ (0, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 uM). Después de 72 horas de exposición, el medio de cultivo cambió por medio fresco solo (Recuperar), o con ENZ (continuar). 48 horas más tarde, la viabilidad celular se analizó con el ensayo de cristal violeta
doi:. 10.1371 /journal.pone.0152861.s001 gratis (TIF)
S2 Fig. Efecto de la combinación AKT más inhibición con inhibidores de MEK alternativos en la señalización celular.
MR49C (A) y líneas celulares MR49F se trataron con LY294006 20μM, UO126 10 M, o la combinación durante 48 horas.