Extracto
factor de crecimiento epidérmico (EGF) y similar a la insulina factor I de crecimiento (IGF-I) son reguladores críticos de la diferenciación celular, la supervivencia, la proliferación y la migración en los cánceres. Este estudio encontró que ARNO (cytohesin-2), un activador del EGF y vías de IGF-I, fue más altamente expresado en el tejido de cáncer colorrectal que en el tejido adyacente colorrectal benigna. Cuando ARNO-siRNA o el inhibidor químico SecinH3 bloquearon ARNO, corriente abajo del EGF y vías de IGF-I disminuyó en líneas celulares de colon HT29 y HCT116. Este bloqueo también se debilitó la proliferación celular, la invasión y la migración in vitro. Por otra parte, el receptor de EGF (EGFR) que dependen de xenoinjertos de tumores colorrectales en ratón desnudo ejercen efectos antiproliferativos de supresión y de crecimiento mediante la inyección de secineH3. Estos datos sugirieron que la inhibición de cytohesins o ARNO como activadores citoplasmáticos de EGFR y de IGF-I en el cáncer colorrectal resultó en anti-proliferación, invasión reduce, disminución de la migración, y suprimió el crecimiento in vivo e in vitro. Por lo tanto, cytohesins o ARNO pueden ser un objetivo potencial para la terapia de algunos cáncer colorrectal
Visto:. Pan T, Sun J, Hu J, Hu Y, Zhou J, Chen Z, et al. (2014) Cytohesins /ARNO: La función en las células del cáncer colorrectal. PLoS ONE 9 (3): e90997. doi: 10.1371 /journal.pone.0090997
Editor: Jung weon Lee, Universidad Nacional de Seúl, República de Corea
Recibido: 27 Agosto, 2013; Aceptado: 6 Febrero 2014; Publicado: 11 de marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Pan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación contó con el apoyo de alta Tecnología de Investigación Nacional y el Programa de Desarrollo de China (Nº 2012AA02A506), Zhejiang Fundación de Ciencias Naturales Provincial de China (LD13H160015) y Zhejiang Provincial clave Científicas y Proyectos de Investigación Tecnológica de Cooperación Internacional (núm 2009C14010). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CRC) sigue siendo el tercer tipo de cáncer más comúnmente diagnosticado en los hombres y la segunda en las mujeres a pesar de las mejoras significativas en su pronóstico adscritos a los avances en diagnóstico y terapia modalidades. Más de 1,2 millones de nuevos casos de cáncer y 608 700 muertes cada año se registran [1]. Los tratamientos eficaces de cáncer colorrectal son la cirugía, la quimioterapia y la terapia dirigida. Los avances en la quimioterapia convencional han extendido la esperanza de vida, pero la eficacia de muchos pacientes sigue siendo baja, especialmente para aquellos con metástasis. La búsqueda de terapias más eficaces y menos tóxicos ha dado lugar a una nueva generación de agentes antitumorales. El más común es el agente biológico dirigido [2]. factor de crecimiento epidérmico (EGF) receptor (EGFR) y las vías de transducción de señales asociadas han emergido como dianas terapéuticas moleculares importantes para el cáncer colorrectal [3].
EGFR /ErbB1, junto con Her2 /ErbB2, Her3 /ErbB3, y ErbB4, es un miembro de la familia ErbB. EGFR /ErbB1 regula la respuesta inmune innata del cuerpo [4], así como la diferenciación celular, la supervivencia, la proliferación, la invasión y la migración. EGFR contiene un dominio extracelular de unión a ligando, una única región que atraviesa la membrana, y un dominio citoplasmático de tirosina quinasa [5]; [6]. Los ligandos se unen al dominio extracelular provocando la dimerización del receptor, lo que induce un cambio conformacional de los componentes de fosforilación intracelular y permitir la señalización aguas abajo [7].
Hoy en día, muchos agentes biológicos dirigidos juegan un papel importante en la vía de señalización de EGFR. Anti-EGFR anticuerpos monoclonales e inhibidores de la tirosina quinasa de EGFR se han demostrado para inhibir de manera eficiente la proliferación de tipos de cáncer, especialmente de cáncer colorrectal y nasofaríngeos [8]; [9]. Cetuximab y panitumumab, anticuerpos contra EGFR, son ampliamente utilizados para tratar el cáncer colorrectal. Sin embargo, los pacientes eventualmente desarrollan resistencia a estos agentes [10]. Una hipótesis común de Cetuximab-resistencia es EGFR o mutación molecular aguas abajo dentro de las células tumorales, tales como adquirido mutación EGFR ectodominio S492R [10]. Además, el bloqueo de EGFR persistente mejora vías distintas de la vía EGFR, tales como el receptor HER2, HER3, factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) -I receptor (IGF-IR) vías de señalización [11] - [13].
IGF-I e IGF-II juegan papeles centrales en el crecimiento celular, la diferenciación, supervivencia, transformación y metástasis. Los efectos biológicos de los IGF están mediadas por IGF-IR, una tirosina quinasa receptor con homología con el receptor de insulina. Los investigadores han descubierto recientemente que la desregulación del sistema IGF es un factor clave en la progresión de varios tipos de cáncer, con la activación de IGF-IR aumentar el potencial tumorigénico de mama, próstata, pulmón, colon, así como carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello [14 ]; [15].
Cytohesins como activadores de receptores ErbB han sido reportados por Bill et al. [dieciséis]. Demostraron que cytohesins mejorar la activación del EGFR interactuando directamente con los dominios citoplasmáticos de receptores dimerizados y facilitando los reordenamientos conformacionales de estos dominios. Cytohesins más de expresión aumenta la señalización del EGFR en cáncer de pulmón humano, mientras que la inhibición química o desmontables de cytohesins reduce la activación del EGFR. Del mismo modo, nuestros estudios anteriores han demostrado que el bloqueo cytohesins por SecinH3 o derribar ARNO por Arno-siRNA puede reducir la activación de EGFR en la líneas celulares de cáncer colorrectal HT29 [17]. EGF y IGFs son reguladores críticos de la diferenciación celular, la supervivencia, la proliferación y la migración en los cánceres. También están implicadas en la apoptosis, transformación, crecimiento invasivo, y la metástasis distante de las células tumorales [15]. Cytohesins se han sugerido como una nueva diana eficaz para reducir la invasión, metástasis y Cetuximab o células Panitumumab resistentes en pacientes con cáncer colorrectal. La posibilidad de que cytohesins pueden ser nuevos objetivos para los pacientes de cáncer antelación etapa resistentes a los fármacos o se han explorado. En consecuencia, hemos examinado cytohesins o ARNO como un nuevo agente anti-cáncer colorrectal en este estudio.
Materiales y Métodos
Los anticuerpos y reactivos
Los medios de cultivo celular 1640 y McCoy S 5A se adquirieron de Gibco (Gibco, EE.UU.). Los anticuerpos anti-humanos de conejo o ratón monoclonales utilizados fueron ARNO (Abcam, ab56510), pEGFR (Py1068, Epitomics, 1138-1), pERK1 /2 (T202 /Y204, Bioworld, BS5016), (Cell Signaling, 3197) EGFR, GAPDH (Bioworld, AP0063), IGF-IR (Abcam, ab39675), pIGF-IR (Abcam, ab39398), Pirs (Abcam, ab52167), pAKT (Abcam, ab106693), pIRS1 (Abcam, ab66153), POSI (Abcam, ab155170), y Ki-67 (Cell Signaling, 9027). Otros reactivos y equipos utilizados fueron los siguientes: SecinH3 (Merck-565725 /sc-203260), siRNA oligo (Genephama), MTT (Sigma, m5655), DMSO (Sigma, D5879), EGF humano (Peprotech, AF-100-15 ), IGF-1 humano (Peprotech, AF-100-11), FBS (Gibco, EE.UU.), y 0,25% de tripsina (Sigma), kit de inmunohistoquímica (Zhongshan, china).
líneas celulares y cultivo
las líneas celulares de cáncer colorrectal humano HT29 y HCT116, que fueron identificados sin ninguna mutación en KRAS y BRAF, se obtuvieron del Laboratorio clave de Prevención del cáncer y la Intervención, Cancer Institute, Segundo hospital Afiliado de la Facultad de Medicina, Zhejiang Universidad, china. Los cultivos celulares utilizadas fueron las siguientes: línea HT29 de células por 1640 (con 10% de FBS + 1% de estreptomicina /penicilina) y la línea celular HCT116 por 5A McCoy 's (con 10% de FBS + 1% de estreptomicina /penicilina). Todas las líneas celulares se cultivaron en una CO 37 ° C 5%
2 incubadora y se pasaron con 0,25% de tripsina (Sigma) en solución salina 0,2 M tamponada con fosfato (PBS).
muestras de tumores
Antes de la investigación de muestras de tumores humanos, debe haber obtenido el consentimiento informado de los pacientes. Habíamos presentado una declaración de nuestro comité de ética del hospital y recibió la aprobación de la investigación. Todas las muestras tumorales derivan del Biobanco en el Laboratorio Clave de Prevención del Cáncer y la Intervención, Instituto de Cáncer de la Universidad de Zhejiang, China. Todos los tumores fueron clínica y patológicamente define la condición de la lesión neoplásica primaria y sólo y se clasifican según la Organización Mundial de la Salud (OMS) de los tumores del sistema digestivo (2010).
La inmunotinción
Para inmunotinción, se utilizaron anticuerpos monoclonales de conejo generados contra ARNO (Abcam, ab56510), anticuerpos de ratón contra pEGFR (Py1068, Epitomics, 1138-1), anticuerpos policlonales de conejo contra pIGF-IR (Abcam, ab39398) y anticuerpos monoclonales de conejo frente a Ki-67 (Cell Signaling, 9027) como anticuerpos primarios. Antes de la aplicación, se diluyeron todos los anticuerpos (anticuerpos primarios diluidos 1:100, todos los otros anticuerpos secundarios diluidos 1:200) en PBS (NaCl 150 mM, Na 10
2HPO
4, 10 mM NaH
2 PO
4, pH 7,4). La inmunohistoquímica se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. intensidades de tinción fueron evaluados individualmente por tres observadores independientes utilizando un sistema de puntuación de cuatro niveles como se describe [18].
se sembraron
MTT
células
HT29 o HCT116 en placas de 96 pocillos a una densidad de 3000 células /pocillo. Se cultivaron las células con 1% de FBS y reactivos (50 ng /ml de EGF o 25 ng /ml de IGF-1, SecinH3 con diferentes concentraciones (0 mM, 10 mM, 20 mM, 40 mM)) para 24, 48, y 72 h a 37 ° C y 5% de CO
2. A continuación, 5 mg /ml MTT se añadió a cada pocillo y se incubó durante 4 h. A continuación, se añadieron 200 l de DMSO al sustrato MTT resuelta, y se midió la absorbancia a 570 nm usando un lector de placas de micro Spectra MAX (Bio-Rad, EE.UU.)
Análisis de transferencia Western
Las células se recogido y se extrajo con un tampón de lisis de células eucariotas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las proteínas fueron separadas por 12% SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa con un dispositivo de transferencia húmeda (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). membranas borrados se bloquearon con 10% de leche desnatada en PBS Tween-20 durante 1 h. Después de lavar las membranas tres veces con solución salina tamponada con Tris Tween-20 (TBST), se incubaron con anticuerpo primario diluido 1:1000 a temperatura ambiente durante 1 h y después se incubaron en HRP-anticuerpo secundario marcado diluyó 1:10 000 en la sala de temperatura durante 1 h. Después de enjuagar las membranas, la visualización se llevó a cabo con un sistema de análisis de transferencia de Western aumento de quimioluminiscencia (Amersham Biosciences, Little Chalfont, Reino Unido), y las células se expusieron a película de rayos X (Kodak). proteína GAPDH se utilizó como un control interno. Los pernos se detectan y análisis por el software de Alfa EP Imager (Versión: 3.2.2.0).
ensayos de migración celular
ensayos de migración celular se realizaron con 24 pocillos Tran hinche placas (8 micras de poro tamaño; Costar). Aproximadamente 1 × 10
4 células (HT29 o HCT116) fueron cargados en las cámaras superiores. Las cámaras inferiores se rellenaron con medio (1640 más 1% de FBS) en ausencia (DMSO 0,2%) o presencia de SecinH3 (10, 20, o 40 mM). Las placas de olas Tran fueron incubadas en un 37 ° C, 5% incubadora de CO2 durante 48 h. Después de limpiar las células de la cara superior de la membrana de policarbonato y la tinción con hematoxilina-eosina, la membrana de policarbonato se cortó y se coloca en un portaobjetos de microscopio, la cubierta se coló, y se examina bajo el microscopio. El total migró a continuación, se contaron el número de células y el porcentaje.
modelos de xenoinjertos tumorales
Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las leyes de la Universidad de Zhejiang para la Protección de los Animales y aprobados por el comité de protección de los animales de la Universidad de Zhejiang . Los tumores se generaron por medio de inyecciones subcutáneas de 5 × 10
6 HT29 células en ratones nu /nu atímicos macho de acuerdo con Ullrich et al. [19]. Después de establecer tumores (alrededor de 6 mm de diámetro), de catorce ratones fueron asignados al azar en dos grupos. Los ratones en el grupo de SecinH3 fueron tratados con inyecciones intraperitoneales diarias de SecinH3 (100 l, 2,5 mM; en solución 75% de glucosa (5%) /25% de DMSO). Los ratones en el grupo de control se trataron con el mismo volumen de solución de glucosa al 75% y 25% de DMSO hasta el día 14o. Durante el tratamiento, se midió el diámetro del tumor más grande cada 2 días por ultrasonido y luego sacrificado los ratones para recoger los tumores. A continuación realizó la tinción inmunohistoquímica para Ki-67 para detectar la inhibición de la proliferación de SecinH3 en los modelos de tumor de xenoinjerto. a continuación, se contaron el Ki-67 el número de células positivas total y el porcentaje.
Estadísticas
Los resultados se dan como media ± error estándar de la media (SEM). El SPSS16.0 software estadístico se utilizó para el análisis estadístico. comparaciones pareadas se realizaron por el estudiante de
t-test
. Se realizó un análisis de correlación de Pearson, con
p Hotel & lt; 0,05 (marcado con "*") y
p
. & lt; 0,01 (marcado "**") consideró significativamente diferente o significativamente correlacionado
Resultados
ARNO más de expresión se correlacionó con los niveles de EGFR y el IGF-IR en tejido de cáncer colorrectal humano
EGFR y la señalización de IGF-IR juegan un papel crítico en muchos tipos de cáncer [16 ] y nuestro grupo encontró que Arno y otros cytohesins potenciar la activación de EGFR en las células de cáncer colorrectal [17]. Por lo tanto, nos preguntamos si había terminado ARNO expresa en tejidos de cáncer de los pacientes y la sobre-expresión se correlacionó con EGFR y la señalización de IGF-IR. Por lo tanto, se utilizó la inmunohistoquímica para investigar los adenocarcinomas colorrectales humanos primarios con un anticuerpo de detección ARNO, pEGFR (pY1068), y pIGF-IR (pY1185). Los resultados mostraron que el tejido colorrectal o tejido normal adyacente colorrectal benigna sólo tenían antecedentes (30/36) o tinción débil (6/36). Por otra parte, todos los carcinomas mostraron una tinción positiva ARNO, el 93,1% de los cuales eran moderados o fuertes. Encontramos una diferencia altamente significativa (
r = 0,712
,
p = 0,012 para
pEGFR;
r = 0,684
,
p = 0,031 para
pIGF- IR,
n
= 36) correlación entre el nivel de expresión del Arno y pEGFR o pIGF-IR (Figura 1). Nuestros estudios previos sobre el papel de ARNO en tejidos de cáncer colorrectal han revelado una alta correlación con pEGFR y pIGF-IR, lo que sugiere que ARNO posiblemente aumenta la activación y la señalización de EGFR y el IGF-IR.
cánceres colorrectales los Pacientes o tejido adyacente secciones consecutivas benignos se tiñeron para Arno (a), pEGFR (b), y pIGF-IR (c). Imágenes representativas de tejido normal de colon (columna izquierda) y (columna derecha) expresión ARNO moderada se muestran (aumento original x 100). El diagrama de la (a) muestra la fracción y las frecuencias de los tumores con el fondo (-), débil (+), moderada (++), o fuerte (+++) tinción para Arno. Los diagramas en (b) y (c) muestran la correlación de los niveles de fosforilación de las proteínas respectivas con la puntuación Arno (
p = 0,012 para
pEGFR,
p = 0,031 para
pIGF-IR ,
n
= 36). Revela que ARNO más de expresión se correlacionó con una mejora de EGFR y el IGF-IR.
La inhibición química de cytohesins y desmontables de ARNO reduce la señalización celular
Para detectar la función de cytohesins o ARNO en la vía de EGF de células de cáncer colorrectal, SecinH3 y ARNO-siRNA (seleccionado por los experimentos primarios) inhibir cytohesins /ARNO en células HT29 [17]. En el ensayo, HT29 células fueron cultivadas en platos con fondo de vidrio 35 mm marcados como grupo A, B, o C. Todas las células se cultivaron con medio de 1% de cultivo FBS. Se añadieron SecinH3 (20 M o una mezcla de 100 pmol de ARNO-siRNA en 5 l de Lipofectamine 2000) a los platos del grupo B cuando las células se habían extendido para cubrir el 70% de los platos durante 10 h. Al mismo tiempo, se añadió DMSO al 0,2% (o 5 l de Lipofectamine 2000) a los platos de los grupos A y C como control, y después se añadieron 50 ng /ml de EGF a los platos de los grupos A y B durante 5 min. Se utilizó el análisis de transferencia de Western para poner a prueba la expresión de moléculas de la vía asociada a EGF, incluyendo ARNO, EGFR, pEGFR, pIRS1, POSI, y pERK1 /2. Los resultados indicaron que cuando SecinH3 bloqueado cytohesins o inhibidas por ARNO ARNO-siRNA, la expresión ARNO se redujo en las células HT29. Además, las moléculas fosforiladas de la vía EGF incluyendo pEGFR, POSI, y pERK1 /2 se downregulated en las células HT29 (Fig. 2).
(a y b) SecinH3 y ARNO-siRNA reduce la señalización del receptor EGFR. se muestra el análisis de transferencia Western de las células HT29 tratadas con SecinH3 (a) o ARNO-siRNA (b) y estimulados con EGF. La fosforilación de las proteínas indicadas se determinó mediante inmunodetección utilizando anticuerpos phosphospecific. Gliceraldehído fosfato deshidrogenasa (GAPDH) sirvieron como control de carga. Los diagramas muestran los niveles de fosforilación relativas después de la normalización para GAPDH. Las células estimulada por ligando sin tratar se establecieron como 3 (
n
= 3). Los datos se representan como la media ± SEM. *
p Hotel & lt; 0,05, **
p
. & Lt; 0,01
Para detectar la función de cytohesins o Arno en la vía IGF, SecinH3 y Arno -siRNA [17] en las células HCT116 inhibido cytohesins /ARNO. En el ensayo, las células HCT116 se cultivaron en platos con fondo de vidrio 35 mm marcados como grupo A, B, o C. Todas las células se cultivaron con medio de 1% de cultivo FBS. Se añadieron SecinH3 (20 M o una mezcla de 100 pmol de ARNO-siRNA en 5 l de Lipofectamine 2000) a los platos del grupo B cuando las células se habían extendido para cubrir el 70% de los platos durante 10 h. Al mismo tiempo, se añadió 0,2% de DMSO (o 5 Lipofectamine 2000 l) a los platos de los grupos A y C como un control, a continuación, 25 ng /ml se añadió IGF-1 a los platos de los grupos A y B durante 5 min. Se utilizó el análisis de transferencia de Western para poner a prueba la expresión de moléculas de la vía asociada a IGF incluyendo ARNO, IGF-IR, pIGF-IR, PIR, y pAKT. Los resultados indicaron que cuando cytohesins fueron bloqueados por SecinH3 o inhibidas por ARNO-siRNA, la expresión ARNO se redujo en las células HCT116. Además, las moléculas fosforiladas de la vía de IGF incluyendo pIGF-IR y pAKT se downregulated en las células HCT116 (Fig. 3).
(a y b) SecinH3 y ARNO-siRNA reducen la señalización del receptor IGF-IR. se muestra el análisis de transferencia Western de las células HCT116 tratadas con SecinH3 (a) o ARNO-siRNA (b) y se estimularon con IGF-1. La fosforilación de las proteínas indicadas se determinó mediante inmunodetección utilizando anticuerpos phosphospecific. Gliceraldehído fosfato deshidrogenasa (GAPDH) sirvieron como control de carga. Los diagramas muestran los niveles de fosforilación relativas después de la normalización para GAPDH. Las células estimulada por ligando sin tratar se establecieron como 3 (
n
= 3). Los datos se representan como la media ± SEM. *
p Hotel & lt; 0,05, **
p
. & Lt; 0,01
cytohesins bloqueo reducen la proliferación y migración de células colorrectales
la inmunohistoquímica de tejidos de cáncer de los pacientes reveló que ARNO más de expresión se correlacionó con una mejora de EGFR y el IGF-IR. Este hallazgo nos llevó a pensar en la posibilidad de la proliferación o migración de células EGFR /IGF-sensibles reducida cuando Arno está bloqueado. Para seleccionar líneas celulares EGFR /IGF-sensible, se realizó un ensayo de MTT mediante el cultivo de las líneas celulares de cáncer colorrectal HT29, SW620, SW480, HCT116, y LOVO en 1% de SFB con EGF o IGF. Se encontró que HT29 fue la línea celular de EGFR-dependiente y HCT116 fue IGF sensibles (datos no mostrados). Ambas líneas celulares fueron identificados como de tipo salvaje para KRAS y BRAF (datos no mostrados). Para detectar la relación de ARNO con la proliferación y migración celular en el cáncer colorrectal, añadimos sesinH3 al medio de cultivo y encontramos que puede reducir la proliferación (ensayo MTT con SecinH3 en 0 (DMSO), 10, 20 y 40 mM durante 24, 48, y 72 h) (Fig. 4b), y la migración (Tran hinche con SecinH3 en 0 (DMSO), 10, 20 y 40 m para 48 h) de HT29 y células HCT116 (Fig. 4a). Esto demuestra que SecinH3 puede inhibir la infiltración y migración de las células HT29 y HCT116. Y los efectos son proporcionales a la concentración de SecinH3 y el tiempo de operación
.
Columna de la izquierda del diagrama (a) son imágenes representativas de Tran hinchan ensayo de HT29 y HCT116 células tratadas con SecinH3 en 0, 10, 20 y 40 mM respectivamente. Las imágenes izquierda son el resultado de las células HT29 sin SecinH3 (DMSO 0,2% durante 48 h) y con SecinH3 (20 m para 48 h) (aumento original x 100). Parece que SecinH3 puede inhibir la migración de células HT29 y HCT116. Los resultados son la correlación con la concentración de SecinH3 y el tiempo. Los diagramas (b) muestran el número relativo de células de HT29 y HCT116 determinado por el ensayo de MTT en presencia de SecinH3 en 0, 10, 20, y 40 M durante 24, 48, y 72 h. Parece que SecinH3 puede inhibir la infiltración de células HT29 y HCT116. Los resultados son también correlación con la concentración de SecinH3 y el tiempo. Los datos se representan como la media ± SEM. * P & lt; 0,05, ** p & lt;. 0.01 (
n
= 5)
SecinH3 redujo el crecimiento de xenoinjertos de tumores colorrectales HT29
La fuerte expresión de ARNO en el tejido de cáncer colorrectal y su correlación significativa con pEGFR y pIGF-IR nos llevó a preguntarse si el bloqueo cytohesins in vivo puede inhibir la proliferación de células tumorales. Para investigar esta hipótesis, las células HT29 que tienen la más alta expresión de EGFR que otras células del cáncer colorrectal [17], fue seleccionada para hacer el modelo de xenoinjerto de ratón. Así que inyecta por vía subcutánea células HT29 en ratones desnudos para generar los xenoinjertos tumorales. Cuando el tamaño de xenoinjerto de tumor alcanzó 6-7 mm en los ratones que habían sido inyectados las células HT29 durante casi una semana, los ratones comenzaron a tratar con o sin SecinH3. Los tumores del grupo SecinH3 se inhibieron el crecimiento obviamente después del tratamiento con SecinH3 durante más de una semana. Los dos grupos tuvieron diferencias obvias hasta los días 11 después del tratamiento (Fig. 5a). La tinción inmunohistoquímica del marcador de proliferación celular Ki-67 en tumores resecados confirmó la proliferación celular reducida. a continuación, se contaron el Ki-67 el número de células positivas total y el porcentaje. Encontramos el diferente nivel de expresión altamente significativa entre de los ratones tratados con o sin SecinH3 después del tratamiento de 14 días (p = 0,0083, n = 7) (figura 5b, c, d). Se utilizó el análisis de transferencia de Western para poner a prueba la expresión de moléculas de la vía asociada a EGF en ratones tumores tratados durante 2 semanas, incluyendo ARNO, pEGFR. Los resultados indican que cuando SecinH3 bloqueado cytohesins, ARNO y expresión pEGFR se redujeron en xenoinjertos HT29. (Fig.5e).
El diámetro de xenoinjertos de tumores establecidos en ratones se midió mediante ecografía cada 2 días durante el tratamiento (Diagrama A). T
1 fue el grupo de control. T
2 fue el grupo SecinH3. Los tumores del grupo SecinH3 se inhibieron el crecimiento obviamente, después de las inyecciones intraperitoneales diarias de SecinH3 durante más de una semana. No hubo diferencia significativa entre los dos grupos en el TH 11
14
º días después del tratamiento. El diagrama (b) y (c) representan los resultados de inmunohistoquímica esfuerzo para Ki-67 de tumor de los ratones después de tratados con (b) o sin SecinH3 (c) durante 14 días, (aumento original x 200). Se costuras que SecinH3 disminuye la expresión de Ki-67 en xenoinjertos HT29. El diagrama (d) representa la velocidad de expresión positiva de Ki-67 en los tumores de ratones portadores de xenoinjertos de HT29 en el 14
TH días después del tratamiento con o sin SecinH3. El diagrama (e) representa la expresión positiva de ARNO, pEGFR en los tumores de ratones portadores de xenoinjertos de HT29 después del tratamiento con o sin SecinH3 durante 2 semanas. La expresión Arno y pEGFR de los dos grupos tienen diferencias significativas. Los diagramas muestran los niveles de fosforilación relativas después de la normalización para GAPDH. Los datos se representan como la media ± SEM. *
p Hotel & lt; 0,05, * *
p Hotel & lt; 0,01, n = 7.
Discusión
EGF e IGF son críticos reguladores de las características biológicas de las células, especialmente en los tipos de cáncer [20]. Nuestro estudio anterior ha demostrado que es el ARNO cytohesin más importante y está sobreexpresado en líneas celulares de cáncer colorrectal como un activador que juega un papel crucial en la vía EGFR señalización [17].
Para verificar la hipótesis de que es ARNO relacionada con el cáncer colorrectal mediante la activación de EGF e IGF, se realizó inmunohistoquímica de los adenocarcinomas colorrectales humanos resecados manchados por ARNO, pEGFR, y pIGF-IR. En comparación con el tejido colorrectal o tejido normal adyacente colorrectal benigna, ARNO, pEGFR, y pIGF-IR fueron sobreexpresado en los adenocarcinomas. También se encontró una correlación altamente significativa entre los niveles de expresión de Arno y pEGFR o pIGF-IR.
Además, hemos utilizado siRNA y inhibido-SecinH3 ARNO /cytohesins en líneas celulares de cáncer colorrectal para explorar la actividad de Arno y su asociación con el sistema de señalización de EGFR y el IGF-IR. a continuación, hemos detectado la corriente abajo del EGFR y el IGF-IR en asociación con las tasas de incidencia del cáncer colorrectal. Cuando inhibimos cytohesins o ARNO, las moléculas de abajo de la vía EGF se reflejan en la reducción de la activación de pEGFR, pIRS1, POSI, y pERK1 /2. La evidencia sugiere que cytohesins de bloqueo o ARNO podrían reducir el sistema vía EGF. En todo momento, se han detectado vía IGF aguas abajo incluyendo IGF-IR, pIGF-IR, personas en situación irregular, y pAKT. Estas moléculas fueron regulados hacia abajo cuando se inhibió ARNO químicamente o por siRNA. Estas regulaciones abajo indicaron que la amplificación de la señal y las vías de transducción se inhibieron de manera eficiente [21]; [22]. Por lo tanto cytohesins o ARNO estaba fuertemente correlacionado con EGF y la activación de la vía de IGF en el cáncer colorrectal [23].
En un contexto celular, se utilizaron las líneas celulares de cáncer de colon humano HT29 y HCT116 identificados sin ninguna mutación en KRAS y BRAF . Cuando ARNO-siRNA o SecinH3 bloquearon ARNO o cytohesins, la proliferación de células de cáncer colorrectal se redujo en MTT. Además, la reducción de proliferación se correlacionó positivamente con la concentración SecinH3. Para el ensayo de invasión y la migración, se realizó el ensayo oleaje Tran. Los poros en las membranas de olas Tran se bloquearon con un gel (matrigel) compuesto de matriz extracelular para imitar las matrices típicas que las células tumorales encuentran durante el proceso de invasión in vitro. Mediante la colocación de las células colorrectales en la parte superior del gel a ser atraídos por una concentración en suero más alta en el otro lado del pozo, la invasión se determinó contando las células que había atravesado la membrana permeable a las células después de haber invadido y migrado hacia el más alto concentración sérica. En este ensayo, se encontró que inhiben cytohesins por SecinH3 disminuyeron la invasión y la migración de células de cáncer colorrectal. Los investigadores han informado recientemente reducciones similares en el cáncer de pulmón y de próstata [6]; [19]; [24]. Esta reducción puede contribuir a la regulación a la baja de EGF y amplificación de la señal vía IGF-I y la transducción. En el estudio in vivo, inyectamos SecinH3 al día después de los xenoinjertos tumorales HT29 se generaron en ratones desnudos. Se encontró que el crecimiento de tumor se inhibió obviamente después de 9 días de la inyección SecinH3. Después de 14 días de tratamiento, la proliferación de tumores en los ratones también se inhibió.
En una investigación reciente, es encontrar que ARNO es altamente expresado en el cáncer colorrectal, y la expresión se correlaciona con las vías de EGFR y el IGF-IR . inhibición ARNO puede reducir la señalización y la conducción de estas vías, así como disminuir la proliferación, invasión, y la migración de células de cáncer colorrectal in vivo y in vitro. Ludovini [25] informó de que si ambos, el IGF-IR y EGFR son altamente co expresado en el cáncer de pulmón de células no pequeñas resecado, los pacientes pueden lograr supervivencia libre de enfermedad. Choi et al. [26] indicó que la inhibición combinada de la señalización de IGF-IR potencia la inhibición del crecimiento y los efectos inductores de la apoptosis de inhibidor de la vía EGFR. Sin embargo, las células cancerosas siempre tienen muchas formas de canales de la señal de reproducción, y EGFR y IGFR sólo dos de estos caminos son. Aunque ARNO puede ser una nueva diana terapéutica de algunas células de cáncer colorrectal, la mayor concentración de Arno en las células cancerosas que en las células normales pueden deberse a otras razones, como la proliferación y la inmunidad. El mecanismo de la migración también puede estar relacionada con la integrina β [27]. Todas estas hipótesis deben ser objeto de investigación en el futuro.
Reconocimientos
gracias al Dr. Zhou Jiaojiao y el Dr. Tan Chunwen por sus líneas celulares (HT29, HCT116), y también gracias por su apoyo y entusiasmo. Nos gustaría pedir disculpas a aquellos autores cuyo trabajo muy valioso y no se menciona en el citado anteriormente.