Extracto
intratumoral heterogeneidad (ITH) conduce a una subestimación del paisaje mutacional retratado por una sola biopsia con aguja y por lo tanto afecta a la precisión del tratamiento. La extensión de la colorrectal ITH genética del cáncer (CRC) no se entiende bien en pacientes chinos. Por lo tanto, se realizó la secuenciación profunda mediante el uso de la OncoGxOne
™ Panel Plus, destinado a 333 genes específicos de cáncer en las biopsias múltiples región de tumores metastáticos primarios y hepáticas de pacientes con CRC tres chinos. Se determinó que el grado de ITH varió entre los tres casos. En promedio, el 65% de todas las mutaciones detectadas eran comunes dentro de los tumores individuales.
KMT2C
aberraciones y el
NCoR1
mutación eran los únicos eventos ubicuos. posterior análisis filogenético mostró que los tumores se desarrollaron de forma ramificada. La comparación de los tumores primarios y metastásicos revelado que
PPP2R1A gratis (E370X),
SETD2 gratis (I1608V),
SMAD4 gratis (G382T), y
AR
mutaciones del sitio de empalme pueden ser específicas para el cáncer metastásico del hígado. Estas mutaciones pueden contribuir a la iniciación y la progresión de metástasis a distancia. En conjunto, nuestro análisis permitió identificar un porcentaje sustancial de ITH genética en el CCR, que debe ser considerado para las estrategias terapéuticas personalizadas
Visto:. YW Lu, Zhang HF, Liang R, Xie ZR, Luo HY, Zeng YJ, et Alabama. (2016) Cáncer Colorrectal heterogeneidad genética delineado por Multi-Región secuenciación. PLoS ONE 11 (3): e0152673. doi: 10.1371 /journal.pone.0152673
Editor: Hiromu Suzuki, Universidad Médica de Sapporo, Japón
Recibido: 23 Noviembre 2015; Aceptado: 17 Marzo de 2016; Publicado: 29 Marzo 2016
Derechos de Autor © 2016 Lu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Los datos de secuenciación están disponibles en la secuencia Recuperar Archivo (SRA) de base de datos (número de acceso SRP065361)
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación médica de Talento líder de la provincia de Yunnan (Nº L-201205) KHW, Fundación de Yunnan Instituto de Enfermedades Digestivas (núm 2014NS122) KHW, Departamento de Ciencia y Tecnología de la provincia de Yunnan-Kunming Medical University (NO. 2015FB100) HFZ, Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81460007) XYK. http://www.nsfc.gov.cn/. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es una de las principales causas de muerte en todo el mundo, lo que representa un estimado de 1.2 millones de nuevos casos y 600.000 muertes cada año [1]. CRC es el tercer cáncer más frecuente y la quinta causa principal de muerte por cáncer en China. La incidencia de CCR también ha aumentado en la población china en los últimos años [2]. Aunque se han hecho progresos considerables en cuanto al tratamiento de CRC, incluyendo la terapia dirigida, la supervivencia relativa a cinco años de los pacientes con metástasis a distancia es sólo el 12,5% [3]. Por lo tanto, es altamente deseable una amplia comprensión de la biología molecular de CRC. Estos nuevos conocimientos serían posteriormente, mejorar el tratamiento de la CRC.
intratumoral heterogeneidad (ITH) conduce a una subestimación del paisaje mutacional retratado por una sola biopsia con aguja y por lo tanto afecta a la precisión del tratamiento. Con el desarrollo de secuenciación de próxima generación (NGS), ITH Recientemente se ha dilucidado en detalle sustancial en varios tipos de cáncer [4-7], incluyendo CRC [8, 9]. Kim et al. [8] llevó a cabo biopsias múltiples región de regiones primarias y metastásicas hepáticas de cinco CRC a través de la secuenciación del exoma y observó que sólo el 19,8% -53,9% de las mutaciones en una muestra dada fuera universal. También identificaron
APC
,
KRAS
, y
TP53
mutaciones en todas las biopsias regionales. La cobertura de la secuenciación de su estudio es relativamente bajo, lo que puede llevar a pasar por alto la mutación de baja frecuencia. Mientras que en el estudio Kogita, [9] que sólo se concentraron 50 genes del cáncer, y de ahí el que determinar la medida de CRC ITH genética era limitado. Además, la extensión de la CRC ITH genética no ha sido establecida en pacientes chinos.
Hemos llevado a cabo la secuenciación profunda cobertura utilizando el Kit SureSelect Target Enrichment y OncoGxOne
™ Plus Panel de ADN a partir de biopsias múltiples de la región Los tumores primarios y metastásicos del hígado de tres pacientes con CRC chinos para caracterizar CRC ITH en pacientes chinos. Se determinó el paisaje mutación e identificamos el nivel sustancial de ITH genética en el CCR.
Materiales y Métodos
Pacientes y muestras
Tres pacientes con carcinoma de colon primario multirregional quirúrgicamente resecado en el hospital de las primeras personas de la provincia de Yunnan, entre octubre de 2013 y abril de 2014 se inscribieron en el estudio. estadificación patológica del tumor se realizó de conformidad con la clasificación TNM (Tabla 1). Este estudio fue aprobado por el comité de ética del Hospital de las primeras personas de la provincia de Yunnan (2014YXLH029). Todos los pacientes en el estudio siempre y consentimiento informado por escrito para el uso de tejido resecado.
aislamiento del ADN
Los, incluido en parafina (FFPE) muestras fijadas con formalina se sometieron a un examen histológico , se seleccionaron sólo aquellas células tumorales que contienen suficientes (al menos 70% de células tumorales), como se determina por tinción de hematoxilina y eosina, y los tejidos normales emparejados por aislamiento de ADN. ADN genómico se aisló utilizando el QIAamp
® DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con el procedimiento del fabricante con ligeras modificaciones. muestras de ADN genómico se cuantificaron utilizando el espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Agilent, Santa Clara, CA, EE.UU.). El ADN aislado se almacenó a -80 ° C hasta su análisis.
prueba de microsatélites
La inestabilidad de microsatélites (MSI) de estado se determinó para cada caso mediante el uso de marcadores mononucleótidos o cinco microsatélites dinucleótidos (BAT25, BAT26, D17S250, D2S123, D5S346 y) [10]. Los cebadores fueron 5'-etiquetados con HEX, FAM, TET o (Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China). Todos los loci de microsatélites fueron amplificados a partir de ADN normal y tumoral emparejados través de la reacción de fluorescencia multiplex cadena de la polimerasa (PCR). A continuación, los productos de la PCR fueron secuenciados en el secuenciador automatizado ABI 3730XL mediante el uso de un software de análisis de fragmentos (gen Scan, Perkin Elmer, Waltham, MA, EE.UU.). la estabilidad de microsatélites marcadores se analizó usando el software GeneMapper. El estado de MSI se clasificó como MSI-alto si ≥30% de los marcadores eran inestables, MSI-bajo si. & Lt; 30% de los marcadores eran inestables, y no hay cambios o picos adicionales para microsatélites estables (MSS) de cáncer de colon
enriquecimiento y secuenciación de destino
preparación de enriquecimiento secuencia de muestras y la biblioteca se llevó a cabo mediante el uso de la SureSelect Target Enrichment Kit (Agilent, Santa Clara, CA, EE.UU.) y OncoGxOne
™ panel de cáncer Plus (GENEWIZ, Inc ., South Plainfield, Nueva Jersey, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. OncoGxOne Plus, un panel de oncología dirigida, contiene 333 genes específicos de cáncer (incluyendo todos los genes conocidos de cáncer de controladores y 64 genes específicos y relacionados con la quimioterapia). Brevemente, 200 ng de ADN genómico de cada muestra fue fragmentado por cizallamiento acústica en un instrumento Covaris. Las fracciones de 150 a 200 pb se ligaron a SureSelect Adaptor Oligo y amplificó por PCR durante 10 ciclos. Para el enriquecimiento de destino, toda la biblioteca se hibridó utilizando el Oligo Capture Kit SureSelect durante 16 o 24 horas a 65 ° C. híbridos con biotina fueron capturados, y las bibliotecas enriquecidas se completaron menos de 16 ciclos de PCR. Las bibliotecas purificados resultantes se agruparon y se secuenciaron mediante el uso de la iluminación
® MiSeq
™ instrumento NGS durante 2 x 150 secuenciación de extremo emparejado lee (Illumina, San Diego, CA, EE.UU.) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Los genes en el OncoGxOne
™ panel de cáncer Plus se enumeran en la Tabla S1.
Análisis de Bioinformática
los datos de secuenciación se accede a través del Reportero MiSeq. Calidad de los datos se comprueba utilizando FastQC (http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc/) y después alineado con el genoma de referencia humana (hg19) utilizando la herramienta de alineación Burrows-Wheeler para generar un bam presentar [11]. llamada variante se llevó a cabo utilizando el kit de herramientas de análisis del genoma, por defecto [12]. llamadas variantes primas fueron filtradas a cabo mediante el uso de las frecuencias alélicas & gt; 5% y alterado lee & gt; 7X. A continuación, las variantes resultantes fueron anotados por la versión Variant Illumina Studio 2.2.3 (Illumina, San Diego, CA, EE.UU.) y ANNOVAR [13]. polimorfismos de un solo nucleótido conocidas fueron excluidos mediante el uso de variantes inthedbSNP 137 (hg19) [14] y SNPs se presentan en los datos de 1000 genomas. Las posibles mutaciones germinales fueron secuenciados en los tejidos normales emparejados.
El análisis filogenético
inferir relaciones ancestrales entre tumores primarios y metástasis del paciente 3 por perfiles de mutación. árboles Vecino se construyeron como se ha descrito previamente por Kim et al. [8], con algunas modificaciones. Utilizamos phytools [15] para el cálculo de distancias y vecino vecino algoritmo implementado en el paquete PHYLIP [16] software para inferir el árbol filogenético.
Resultados
Descripción general de los datos NGS
Tres pacientes con CRC (P1, P2, y P3) fueron incluidos en este estudio. Entonces, 10 muestras a partir de 3 pacientes fueron secuenciados, con una cobertura media de 250 lee. Se identificaron ~ 8.000 variaciones de un solo nucleótido somáticas (SNVS) (4.444 a 8.348) y ~ 850 (457 a 1.154) inserciones somáticas y deleciones (indeles) en las muestras de biopsia 10 de los casos 3 CRC (Tabla 2).
paciente 1