Extracto
Antecedentes
Los pacientes generalmente mueren de cáncer después del fracaso de las terapias actuales para eliminar la enfermedad residual. Una subpoblación de células tumorales, denominada células madre del cáncer (CSC), parece el único capaz de alimentar el crecimiento de diversos tumores histológicamente y fenotípicamente. Se ha propuesto, por lo tanto, que el hecho de tratar con eficacia el cáncer puede ser en parte debido a la resistencia de éstos preferencial CSC a los agentes quimioterapéuticos. La subpoblación de células tumorales colorrectales humanos con un ESA
+ CD44
+ fenotipo son únicamente responsables de la tumorigénesis y tienen la capacidad de generar tumores heterogéneos en un entorno de xenoinjertos (
es decir.
CoCSC). La hipótesis de que si las células no tumorigénicas son más susceptibles a los agentes quimioterapéuticos, a continuación, podría esperarse que los tumores residuales que contienen una mayor frecuencia de CoCSC.
métodos y las conclusiones
tumores xenogénicos iniciados con CoCSC eran permitido llegar a ~ 400 mm
3, en la que se asignaron al azar a los ratones de punto y se iniciaron los regímenes quimioterapéuticos sobre la ciclofosfamida o irinotecán. Los datos de los análisis fenotípico tumor individual y trasplantes realizados en serie dilución limitante muestran que los tumores residuales están enriquecidas en células con el fenotipo CoCSC y han aumentado la frecuencia de células tumorigénicas. Además, la capacidad inherente de CoCSC residual para generar tumores parece estar conservado. Aldehído deshidrogenasa expresión del gen 1 y la actividad enzimática se encuentra elevado en CoCSC y utilizando un
in vitro sistema de cultivo in Windows que mantiene CoCSC como lo demuestran los trasplantes de serie y lentiviral marcado de los clones derivados de células individuales, una vez más demuestran que la actividad enzimática ALDH1 es un importante mediador de la resistencia a la ciclofosfamida:. un agente quimioterapéutico clásico
Conclusiones
CoCSC se enriquece en los tumores de colon después de la quimioterapia y seguir siendo capaz de regenerar rápidamente los tumores de donde se originaron. Al centrarse en la biología de CoCSC, los principales mecanismos de resistencia a los agentes quimioterapéuticos específicos pueden atribuirse a genes específicos, lo que sugiere vías para mejorar la terapia del cáncer
Visto:. Dylla SJ, Beviglia L, Parque IK, Chartier C, Raval J, Ngan L, et al. (2008) células madre del cáncer colorrectal se enriquecen en tumores xenogénicos después de la quimioterapia. PLoS ONE 3 (6): E2428. doi: 10.1371 /journal.pone.0002428
Editor: D. Gary Gilliland, Brigham y Hospital de Mujeres, Estados Unidos de América
Recibido: 29 Noviembre 2007; Aceptado: May 8, 2008; Publicado: 18 Junio 2008
Derechos de Autor © 2008 Dylla et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. MFC es uno de los fundadores y miembro de la junta consultiva de pago de OncoMed Pharmaceuticals Inc., y tiene una posición de equidad en la empresa. Todos los demás autores son empleados de OncoMed Pharmaceuticals Inc., una compañía biotecnológica centrada en el enfoque terapéutico de las células madre del cáncer que ha solicitado patentes relacionadas con este estudio. Se obtuvo financiación para estos estudios a través de la financiación privada; Sin embargo, estos partidos no tuvo ningún papel en la decisión de realizar, analizar o publicar los resultados
Conflicto de intereses:. MFC es uno de los fundadores y miembro de la junta consultiva de pago de OncoMed Pharmaceuticals Inc., y tiene una posición de equidad en la compañia. Todos los demás autores son empleados de OncoMed Pharmaceuticals Inc., una compañía de biotecnología que ha solicitado patentes relacionadas con este estudio.
Introducción
La presencia de diversas poblaciones de células en el tejido normal y neoplásico tiene larga sido reconocido. Mientras que la estructura del tejido normal y la función se ve facilitado por diversos tipos de células, generados durante el desarrollo y continuamente reemplazados para mantener la homeostasis, el cáncer se caracteriza generalmente por sobreproliferación desorganizado. Debido a que el material genético se propaga durante largos períodos de tiempo debido a las propiedades de auto-renovación de las células madre, las mutaciones de capitalización requeridos para la tumorigénesis se han planteado la hipótesis de que surjan en estas células raras y no en su más numerosa progenie, que tienen una vida útil finita, una vez comprometido a la diferenciación. Al igual que las células madre de tejido residente normales que soportan la jerarquía celular que comprende un tejido particular durante la vida de una persona, las células madre del cáncer (CSC) se definen por su capacidad de auto-renovación por tiempo indefinido, mientras que mantiene su capacidad de generar tanto tumorigénico (TG células) y no tumorigénicos (NTG) [1]. A diferencia de en el desarrollo normal, sin embargo, las poblaciones de células progenitoras neoplásica pueden obtener capacidades de auto-renovación, por lo tanto también el cumplimiento de la definición de un CSC [2], [3]. En última instancia, la demostración de las capacidades de auto-renovación y diferenciación que definen una célula madre, tanto normales como neoplásicas, puede ser confirmada por estudios de trasplante de serie que permiten la discriminación de células que poseen la capacidad de auto-renovación frente a aquellos capaces de numerosos, aunque finito no auto, -renewing divisiones celulares [4].
el paradigma CSC se basa en el fundamento de que la heterogeneidad del tumor puede ser generado por una sola CSC. Debido a que las líneas de células tradicionales y xenoinjertos no recapitulan la heterogeneidad celular y morfológica observada en xenoinjertos derivados de la implantación de células tumorales tomadas directamente de los pacientes y no a pases
in vitro
, CSC biología depende de la última forma de xenoinjertos. A pesar de la relevancia de estos, y todos, los xenoinjertos de tumores de pacientes ha sido cuestionada [5] - [7], el trasplante de células humanas en ratones es el único modelo de sistema que no exponga las células humanas a un aphysiological
ex vivo
entorno compone de plástico de cultivo de tejido y medio de cultivo y que pueden recapitular la heterogeneidad celular de un tumor primario
in vivo
. Otro tema de controversia en la base de la hipótesis de CSC es la proposición de que la heterogeneidad completa de un tumor puede ser resultado de una única célula [8], [9]. Sin tener en cuenta el estroma, endotelial, y elementos hematopoyéticos reclutados e incorporados en el tumor, se ha sugerido que surgen poblaciones TG y NTG de diferentes células y no de un solo [9] CSC. Si CSC de hecho puede generar la heterogeneidad celular observada en los tumores de los pacientes, y xenoinjertos de ratón compuestos por células estrictamente a pases
in vivo
mejor mantener las características de los tumores en los pacientes, entonces el foco de los esfuerzos en el campo de la biología del cáncer debe estar en ángulo recto en estas células y su nicho microambientales.
quimioterapéuticos estrategias que se dirigen a células que se dividen rápidamente han sido utilizados principalmente para el tratamiento de tumores de origen epitelial. Aunque a menudo eficaz en la reducción del volumen de la masa tumoral, estos agentes no han logrado erradicar la enfermedad [10]. Una razón a menudo se atribuye a este fracaso es que los subconjuntos de células adquieren resistencia a la terapia a través de mutación genética y la selección natural. Si bien esta conjetura puede ser cierto, especialmente en un entorno de tratamiento prolongado, un principio de la "cáncer vástago hipótesis de las células" postula que las células responsables de la recurrencia del tumor pueden ser inherentemente más resistente a los agentes debulking tumor a través de uno cualquiera de una serie de mecanismos ; lo que explica el crecimiento del tumor refractario siguiendo estos tratamientos [11]. En apoyo de esta hipótesis, la resistencia a la radiación puede resultar de elevada expresión de genes de respuesta al daño de ADN, como es el caso para CD133
+ células madre glioblastoma [12]. En analogía a las células madre hematopoyéticas, tumor sólido CSC se han propuesto para exhibir la expresión de alto nivel de genes de la familia del transportador de múltiples fármacos, tales como ABCG2 y ABCB5, probablemente como resultado de flujo de salida más eficiente de los fármacos quimioterapéuticos [13] - [15]. CSC también puede entrar en el ciclo celular con menos frecuencia, lo que les permite resistir la toxicidad por fármacos que se dirigen a células que se reproducen. La evidencia de la quimio-resistencia de las células madre como en líneas de células epiteliales y células derivadas de tumores xenogénicos se ha presentado [16] - [19]; líneas celulares sin embargo, estos estudios han utilizado ya sea adaptado al cultivo de tejidos y /o no evalúan la alteración de la frecuencia de células iniciadoras del tumor
in vivo
después de la quimioterapia. Por definición, las células iniciadoras del tumor se enumeran de forma retrospectiva, por lo tanto alterado CSC frecuencias después de la terapia se demuestra mejor mediante el trasplante de serie.
La ciclofosfamida (CPA) e irinotecán son agentes que se dirigen a las células que proliferan y se utilizan comúnmente en los agentes quimioterapéuticos el tratamiento de tumores sólidos. A través de diferentes mecanismos, tanto actúan para inhibir la replicación del ADN resultante en el retardo o la inhibición de la división celular y que resulta en la apoptosis. La resistencia a la CPA ha sugerido que el resultado de alta aldehído citoplásmica deshidrogenasa actividad de la enzima (ALDH): en particular la de ALDH1 y ALDH3 [20], [21], que se oxida y inactivar el subproducto metabólico bioactivo de CPA, aldofosfamida /4-hidroxiciclofosfamida ( 4-HC) [22], [23]. ALDH1, en particular, puede jugar un papel importante en la resistencia a la CPA, ya que es
K
m Opiniones de CPA es ~52 M, mientras que la de otros miembros de la familia de ALDH con actividad catabólica CPA, ALDH3 (
ALDH3A1
) y SSDH (
ALDH5A1
), son 10 veces menores (
K
m Hotel & gt; 520 m) [24]. Aunque muchos tejidos son relativamente resistentes a raíz de tratamiento CPA [25], sólo se hematopoyéticas y células madre neurales se ha demostrado que contienen una alta actividad de ALDH en la reconstitución de los estudios de trasplante después del aislamiento de estas poblaciones de células [26] - [28]. Dado que el cáncer colorrectal probable que surge de las células madre de colon o progenitoras, es tentador para la hipótesis de que mecanismos similares pueden hacer resistentes a la CPA CoCSC.
Cáncer vástago poblaciones celulares ahora se han identificado de forma prospectiva a partir de diversos tumores de origen epitelial, incluyendo la mama, colon y de próstata [19], [29] - [33]. En todos los tumores colorrectales que hemos investigado hasta la fecha, los tumores pueden transplantarse con éxito utilizando los números pequeños (
por ejemplo, Hotel & lt; 1,000) de las células fenotípicamente positivos tanto para el antígeno epitelial específica (
es decir, la ESA o
EpCAM) y CD44 [30]. En algunos tumores, el aislamiento de células positivas para CD166, además de la ESA y CD44, enriquece aún más para las células madre del cáncer colorrectal (CoCSC), lo que permite la tumorigénesis eficiente con tan sólo 200 ESA
+ CD44
+ CD166
+ células [30]. No sólo identificar este fenotipo CoCSC en xenoinjertos de tumores, pero la tumorigénesis puede iniciarse a partir de muestras de tumor primario con un pequeño número de ESA
+ CD44
+ células
+ CD166. La identificación reproducible de CoCSC usando la ESA y CD44 facilita no sólo los estudios de eficacia terapéutica en todos los xenoinjertos derivados de pacientes estudiados hasta la fecha, sino que también facilita la disección de las vías moleculares implicadas en la tumorigénesis y la resistencia a la terapia.
Aquí demostramos que el ser humano eSA
+ CD44
+ CoCSC generar adenocarcinomas que se asemejan a tumores parentales, tanto en su fenotipo y la histología tras el trasplante en serie en un entorno de xenoinjerto y se enriquecen en los tumores después de regímenes quimioterapéuticos clásicos destinados a reducir los tumores. Además, demuestran tanto
in vitro
y
in vivo
que la resistencia a la CPA está mediada, al menos en parte, por la actividad de la enzima ALDH1 y que la resistencia a otros agentes quimioterapéuticos (
por ejemplo
el irinotecan) no es probable que atribuye a este mecanismo. A lo mejor de nuestro conocimiento, esta es la primera demostración de que una población funcional CSC epiteliales humanas, tal como se define por el trasplante de serie, se enriquece en tumores sólidos residuales después de la quimioterapia. Además, demuestran que la heterogeneidad del tumor en forma de un adenocarcinoma complejo compuesto de poblaciones TG y NTG puede ser generado por una sola célula. Por último, los métodos experimentales utilizados aquí proporcionan una plataforma para evaluar la eficacia de nuevos fármacos dirigidos a las células madre tumorales sólidas.
Resultados
CoCSC se enriquecen en tumores residuales después de la administración de CPA
xenoinjertos de tumores humanos principios de paso generadas a partir de células nunca se expandieron
in vitro
parecer que se parecen mucho a las de los pacientes y por lo tanto puede servir como un excelente modelo para estudiar el cáncer. Recientemente hemos demostrado que la subpoblación de células tumorales colorrectales humanos con un ESA
+ CD44
+ fenotipo es el único responsable de la generación de los adenocarcinomas heterogéneos en un entorno de xenoinjertos (Figura 1 A & amp; B) [30]. ESA humana
+ CD44
+ células de tumores colorrectales xenogénicos pueden subdividirse en base a la expresión de CD166, dando como resultado el enriquecimiento de células oncogénicas (TG) entre el CD166
+ población. En contraste, todas las células de cáncer restantes de origen humano parecen incapaces de iniciar el crecimiento del tumor y se conocen como no tumorigénicos (NTG). Tener identificadas las células madre del cáncer colorrectal (CoCSC), capaces de alimentar el crecimiento tumoral xenogénico, hemos tratado de abordar una pregunta persistente en el campo con respecto a si CSC son preferentemente resistentes a los fármacos quimioterapéuticos.
Un
) perfil fenotípico de los tumores colorrectales UM-C4 para la ESA, CD44 y CD166, tras la exclusión de Mlin
- células.
B Opiniones) y fijados con formalina, incluidos en parafina tumor secciones de CPA o ratones de control tratados con vehículo teñidas con hematoxilina & amp; Eosina (H & amp; E), para la proliferación Ki-67
+, o por TUNEL
+ células muertas. barra de negro = 100 micras.
C
) Después de la aleatorización para normalizar los grupos de tratamiento en 400 mm
3 en el día 0, el doble de la administración semanal de vehículo (cajas verdes) o 38 mg /kg de CPA (círculos rojos) comenzó y los tumores se midieron periódicamente .
D
) El análisis fenotípico de los tumores individuales, mostrando el porcentaje de células tumorales humanas con el SEC
+ CD44
+ fenotipo como una función del tamaño del tumor.
E
) Representante histograma que muestra la expresión superficial de superposición CD166 en el SEC humana
+ CD44
+ células tumorales de los animales con vehículo o CPA-tratados. La línea de color negro representa la tinción de control de isotipo de la ESA
+ CD44
+ células tumorales.
La ciclofosfamida (CPA) es un agente de alquilación cuyo subproducto, mostaza phosphoramide metabólica, reticula ADN e induce la apoptosis en las células que se dividen rápidamente [22]. CPA es un fármaco quimioterapéutico usado comúnmente en el tratamiento de diversos tipos de cáncer, tales como sarcomas de tejidos blandos, cáncer de mama y el linfoma no Hodgkins, pero no se utiliza generalmente para tratar el cáncer colorrectal debido a una resistencia a la existente en la parte de estos tumores . Para investigar esta resistencia a la terapia, se exploró si CoCSC se enriquecen en tumores residuales después de la administración de CPA
in vivo
. Para abordar este tema de interés, los tumores se iniciaron con CoCSC altamente purificada a partir de múltiples líneas tumorales xenogénicos (UM-C4 y amp; UM-C6) y al llegar a ~ 400 mm
3, los ratones fueron asignados al azar para recibir ya sea vehículo o 38 mg /kg CPA, dos veces por semana. Dentro de los 15 días de la aleatorización y administración, el crecimiento del tumor fue notablemente retrasados en los animales tratados con CPA (Figuras 1C y Figura S1A). Después de la eutanasia, los tumores se retiraron para el análisis histológico y fenotípica. Aunque el porcentaje de proliferación de células tumorales (
es decir
Ki-67
+) no parecía alterado, no era notablemente más muerte celular (es decir TUNEL
+ células; Figura 1B) y la ESA
+ CD44
+ fueron más frecuentes en los tumores de los ratones tratados con CPA (Figura 1D). La tendencia hacia una mayor frecuencia ESA
+ CD44
+ células en los tumores tratados con CPA llevan a cabo generalmente verdad independiente del volumen del tumor y fue más pronunciado a dosis más altas (CPA
por ejemplo
38 mg /kg versus 25 mg /kg; datos no mostrados). El enriquecimiento de la ESA
+ CD44
+ CD166
+ células fue aún más sorprendente y particularmente evidente cuando la expresión CD166 se analizó el residuo humano ESA
+ CD44
+ células (Figuras 1E, S1 B & amp ; C). Se observaron resultados similares con las dos líneas tumorales xenogénicos investigados.
Para determinar si el aumento fenotípica en CoCSC después de la administración CPA correlacionado con un auténtico aumento en la frecuencia de células TG, que en serie trasplantado 4 grupos de ratones con mayor UM-C4 las células tumorales utilizando un enfoque de dilución limitante y anotó como positivo o negativo para el crecimiento del tumor después de tres meses. Los ratones con tumores palpables a los 90 días se mantuvo vivo para determinar si el crecimiento del tumor continuaría más allá de 200 mm
3, se pueden producir masas palpables como raras, pero que contiene elementos del estroma murino y no hay células humanas detectables en el análisis en la terminación de la estudio (datos no mostrados). Sobre la base de
Poisson
estadísticas de distribución, las células fueron TG & gt; 2,2 veces más frecuente en los tumores tratados con CPA que en los ratones se administró vehículo (
P = 0,0016
; Tabla 1 & amp; Figura 2A) . Es importante destacar que, el fenotipo celular de estos tumores secundarios en serie trasplantados eran idénticas a las células tumorales parentales utilizados para iniciar el estudio (Figura 2B), lo que demuestra que la intervención de tratamiento y el trasplante en serie de células en la limitación de la dilución no alteró ya sea el potencial tumorigénico de CoCSC ni su capacidad de generar tumores heterogéneos que contiene predominantemente no tumorigénico (
es decir
CD44
-) se utilizó células
a) análisis de dilución limitante de células tumorales UM-C4 no fraccionadas para calcular TG. la frecuencia de células utilizando
Poisson
estadísticas de distribución (nivel de confianza del 95% ±; *
P = 0,0016
).
B Opiniones) Porcentaje de la ESA humana
+ CD44
+ y la ESA
+ CD44
+ CD166
+ células en tumores secundarios que surgen de células oncogénicas residuales trasplantados en serie para limitar dilución siguiente vehículo o de tratamiento CPA regímenes.
Dado que las células TG fueron más frecuentes y poblaciones de células tumorales de animales tratados con CPA fueron enriquecidos por los fenotipos asociados con CoCSC, aislamos próxima células de fenotipo de CoCSC UM-C4 tumores de los ratones tratados con vehículo frente-CPA y preguntaron si estas células inherentemente diferían en su capacidad de generar tumores secundarios. El trasplante de serie de la ESA 50
+ CD44
+ o ESA
+ CD44
+ CD166
+ células de los tumores en los ratones de control frente a CPA tratados con vehículo dio lugar a tumores secundarios con aproximadamente la misma frecuencia (Tabla 1), que cuando se considera en conjunción con las observaciones anteriores sugieren que CoCSC son más frecuentes dentro de los tumores expuestos a CPA regímenes quimioterapéuticos y no se ven afectados en su capacidad para impulsar el crecimiento del tumor.
CoCSC tiene una alta expresión de
ALDH1A1
En la búsqueda de marcadores CoCSC adicionales, se utilizó previamente una herramienta que puede identificar hematopoyéticas y las poblaciones de células madre neurales: actividad de la enzima ALDH [30]. Usando el reactivo de Aldefluor ™, que se somete a un cambio en la fluorescencia después de la escisión enzimática por enzimas ALDH, y la diethylaminobenzaldehyde inhibidor-ALDH1 específico (DEAB) [34], una gran subpoblación de ESA
+ CD44
+ células de ambos líneas tumorales UM-C4 y C6-UM se determinó que tenía una alta actividad de ALDH (Figura 3A) [30]. Similares observaciones se hicieron también en otras líneas derivadas del paciente de xenoinjerto colorrectal tumorales (Figura S2). Además, cuando ESA
+ CD44 se subdividieron células
+ basado en la actividad de ALDH y aislados por FACS, ALDH
+ células eran tumorigénicas en todos los casos de investigación [30]. Es de destacar que la tumorigenicidad está estrictamente conferido por la ESA
+ CD44
+ ALDH
+ células de la línea tumoral colorrectal UM-C4 (Figura 3B). Aunque los tumores pueden surgir de la ESA
+ CD44
+ ALDH
- células tomadas de la UM-C6, OMP-C5 y líneas tumorales OMP-C8 [30], una ALDH
+ subconjunto de TG ESA
+ CD44
+ células existe en todas las líneas tumorales de colon xenogénicas investigados hasta la fecha (n = 6). Por el contrario, una subpoblación de CD44
-. Células con alta actividad de ALDH también existe en todas las líneas tumorales, pero estas células dejan de generar tumores sobre el trasplante
A
) el perfil fenotípico de Las células tumorales humanas ESA
+ UM-C4 para la actividad enzimática ALDH1. Puertas demarcar subpoblaciones tumorales aisladas por FACS para los estudios de carcinogénesis, en el que
B Opiniones) cinética de crecimiento de CD44
+ ALDH
+ (círculos rojos), CD44
+ ALDH
- (naranja cajas) y CD44
-ALDH
+ (triángulos verdes) se representan poblaciones. Las mediciones reflejan solamente los ratones con tumores palpables. Datos representativos de n = 3 experimentos independientes.
C
) de datos Taqman QRT-PCR que muestra la expresión relativa de
ALDH1A1 gratis (
1A1
),
ALDH3A1 gratis (
3A1
)
y ALDH5A1 gratis (
5A1
) en tumorigénico (TG; negro) frente a no tumorigénicos (NTG; blancas) células (n ≥ 2) de 2 líneas tumorales de colon xenogénicas derivadas del paciente (UM C4 & amp; UM-C6). Los datos reflejan la media ± SEM, se normaliza frente a
GUSB
y se muestra en relación con la expresión UM-C4 NTG para cada gen.
Un subconjunto de enzimas ALDH puede oxidar, y por lo tanto inactivar, la CPA citotóxica metabolito 4-HC /aldofosfamida [23], [35]. La presencia de ALDH1 citoplasmática y ALDH3, en particular, se han asociado con la resistencia a CPA en la línea celular de cáncer de pulmón A549 [20], [21]. ALDH1 (codificada por
ALDH1A1
) es mayor que 10 veces más eficiente en catabolizing 4-HC /aldofosfamida que sus miembros de la familia relacionados ALDH3 y SSDH: codificada por el
ALDH3A1
y
ALDH5A1
genes, respectivamente [24]. En el análisis Taqman ™ QRT-PCR de UM-C4 y tumores UM-C6,
ALDH1A1
se expresa generalmente en niveles superiores a
ALDH3A1
y
ALDH5A1
.
ALDH1A1
la expresión génica es 2,8 veces mayor en CoCSC que en las células con GTN, ya pesar de una ligera elevación de
ALDH3A1
expresión en comparación con las poblaciones CoCSC NTG (Figura 3C), su mensaje es apenas detectable en cualquiera de las líneas del tumor. Además, mientras que
ALDH5A1
es un poco elevado en comparación con las células TG NTG de tumores UM-C4 (~ 1,5 veces), su expresión es similar entre estas poblaciones de tumores UM-C6 (Figura 3C). La expresión preferencial de
ALDH1A1 Hoteles en células TG observado es compatible con las medidas de actividad enzimática entre el ser humano ESA
+ CD44
+ subpoblación, en el que la mayoría de estas células tienen una alta DEAB sensible, la actividad ALDH1. Cuando se considera en conjunción con el 10 veces mayor competencia de los ALDH1 frente ALDH3 y SSDH en la inactivación de los intermedios de CPA [24], se podría interpretar estos resultados que sugieren que la resistencia a CoCSC CPA podría ser predominantemente mediado por la actividad enzimática ALDH1.
ALDH1A1
,
MYC
, y
¿Cuáles son MYB enriquecida en células TG residual posterior al tratamiento con CPA
Desde
ALDH1A1
gen expresión es elevada en TG frente a las células con GTN, la actividad enzimática ALDH1 es desproporcionadamente alta en las células con el fenotipo CoCSC, y esta actividad puede mediar la resistencia a la CPA, próxima pregunta si la frecuencia de la ESA
+ CD44
+ ALDH
+ se elevó en UM-C4, UM-C6 y C8 tumores OMP de los ratones que recibieron CPA en comparación con los que están siendo administrado el vehículo. Al igual que el aumento fenotípica observada en CD166
+ células (Figuras 1E, S1 B & amp; S1C), la ALDH
+ subpoblación de la ESA
+ CD44
+ células fue consistentemente más alta en comparación con vehículo CPA los ratones de control tratados (67,6 ± 6,3% frente a 56,8 ± 6,8%, respectivamente; n = 5,
P Hotel & lt; 0,012 en emparejado
t-test
). (Figura 4A)
Una Relación
) de ALDH
+ células tumorales entre los humanos ESA
+ CD44
+ población en los tumores de control tratado con el o los ratones tratados con CPA. Los datos reflejan la Media emparejado de 5 experimentos independientes con base en 3 líneas diferentes xenogénicas colorrectales tumorales (UM-C4, UM-C6 & Amp; OMP-C8) y ratones N≥5 por experimento.
B Opiniones) de datos Taqman QRT-PCR para los genes indicados utilizando poblaciones TG y NTG aisladas de tumores (UM)-C4 con vehículo o tratados con CPA V. Los datos representan la Media ± SEM (n ≥ 2).
C
) inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa tinción de tumores congelados o fijados con formalina, incluidos en parafina para ALDH1 o c-Myc, respectivamente, de los ratones tratados con vehículo y CPA. barra de negro = 100 micras
Una serie de productos génicos han sido considerados esenciales para el desarrollo normal del colon y son ampliamente expresada en los tumores de colon [36] -. [39]. Después del aislamiento de TG frente a poblaciones NTG de ambos tumores UM-C4 tratados con vehículo y CPA con & gt; 99% de pureza, la expresión de numerosos genes con lazos sugeridos para el cáncer colorrectal se determinó por Taqman ™ QRT-PCR. Los expresados diferencialmente en TG frente a las células con GTN incluyen no sólo
ALDH1A1
, como se ha descrito anteriormente (Figura 3C), pero también
MYC c-Myb (
MYB
) y c-Myc (
; Figura 4B). En contraste, los genes asociados con la diferenciación y un fenotipo mesenquimal [40], [41], tales como vimentina (
VIM
), fueron más altamente expresado en las células NTG.
De acuerdo con la elevada frecuencia de las células tumorales residuales que expresan altos niveles de marcadores de carcinogénesis asociada, como CD166, la expresión relativa de CoCSC-asociado frente transcripciones asociadas a NTG, como
ALDH1A1
y
VIM
, respectivamente, era más dispares en CPA versus control tratado con vehículo tumores UM-C4 (Figura 4B). Consistentes con la hipótesis de que ALDH1 puede tener un papel en la mediación de la resistencia a la CPA,
ALDH1A1
expresión génica era más elevada en las células residuales con el fenotipo CoCSC, pero
ALDH3A1
y
ALDH5A1
no eran (Figuras 4B & amp; S3). Además, los genes identificados previamente como altamente expresado en el compartimiento de células madre /progenitoras epiteliales en la base de las criptas del colon y en el tejido neoplásico (
por ejemplo, MYB Hotel & amp;
MYC
) fueron más altamente expresado en CoCSC tumor residual que la población NTG de células que representan la mayor parte del tumor, pero que son generados por CoCSC, aparezcan más susceptibles a la citotoxicidad inducida por CPA. los patrones de expresión similares se observaron también en otras líneas tumorales xenogénicos siguientes CPA-tratamiento, incluyendo UM-C6 (Figura S3).
Por último, las diferencias de expresión génica en CPA frente a los tumores de control tratados con vehículo se correlacionaron con más proteínas expresión por inmunofluorescencia y IHC. Los niveles intracelulares de ALDH1 y nuclear c-Myc, por ejemplo, fueron más prevalentes en los tumores tratados con CPA (Figura 4C). Curiosamente, ALDH1 tinción en los tumores tratados con CPA apareció para localizar a la superficie apical, donde puede ser la hipótesis para interceptar los metabolitos de CPA cuando entran en la célula. En contraste, los niveles de proteína ALDH1 fueron menores y más difusa en los tumores de control. Del mismo modo, c-Myc fue notablemente más concentrada en el núcleo de las células tumorales colorrectales de los ratones tratados con CPA, en consonancia con la mayor frecuencia de células TG y elevada
MYC
expresión dentro de esta población resistente.
resistencia a la quimioterapia CoCSC no es específico de CPA
para determinar si CoCSC también exhiben resistencia a otros agentes quimioterapéuticos importantes, se analizó el impacto de irinotecan (
aka
SN-38) en la frecuencia CoCSC . Los experimentos se iniciaron después de lo cual los ratones portadores de tumores recibieron inyecciones semanales de 15 mg /kg de irinotecan. Después de un ligero retraso de aproximadamente 1 semana, el crecimiento del tumor se detuvo por Irinotecan (Figura 5A). Tras la cosecha del tumor dos semanas después del inicio de la quimioterapia, el porcentaje restante de CoCSC se evaluó mediante citometría de flujo. En los tumores tratados con irinotecan, el porcentaje de las células tumorales a granel con el fenotipo CoCSC se incrementó 61% frente a los ratones de control se administró vehículo (Figura 5B). A continuación, la tumorigenicidad inherente de la ESA
+ CD44
+ CD166
+ células de ratones con vehículo o tratados con irinotecan se puso a prueba en un entorno frente aquellas células que no estén clasificados como fenotípicamente CoCSC trasplante de serie. índices de absorción similares se observaron con CoCSC de tumores o de control tratados con irinotecan en estos trasplantes, y las células fenotípicamente clasifican como tumores "Otros" no inició (datos no mostrados). El aumento de la frecuencia de las células de fenotipo CoCSC en los tumores residuales de los ratones se administra irinotecan y la incapacidad de las células con otros fenotipos trasplantar enfermedad, junto sugieren que CoCSC también son preferentemente resistentes a irinotecán.
A
) Tras la aleatorización para normalizar los grupos de tratamiento a 400 mm
3 a día 43, la administración una vez por semana de vehículo (cajas verdes) o 15 mg /kg de irinotecan (triángulos rojos) comenzó y los tumores se midieron dos veces por semana. se muestran las curvas de crecimiento representan la media ± SEM. Se muestra B) Porcentaje de la ESA humana
+ CD44
+ CD166
+ células de fenotipo CoCSC en tumores residuales. Los datos reflejan los ratones n≥4 por grupo de tratamiento.
resistencia a la CPA es específico para las células con alta actividad ALDH1
Al ver que las células ESA
+ CD44
+ tumorales tienen alta actividad de ALDH, la frecuencia de la ESA
+ CD44
+ ALDH
+ células se incrementa en los tumores de los ratones tratados con CPA, y
ALDH1A1
la expresión génica es elevada en CoCSC CPA-resistentes , por lo tanto, tratamos de determinar si la resistencia a la APC estaba mediado por la actividad de la enzima ALDH1. Debido a que el DEAB inhibidor específico ALDH1 es altamente inestable
in vivo
[42],
in vitro
se establecieron las condiciones de cultivo que apoyan la expansión de células del tumor colorrectal TG. Cabe destacar que el fenotipo celular de las células en mejores condiciones para establecer colonias
in vitro
se ESA
+ CD44
+ CD166
+ (también la de CoCSC), mientras que FACS purificado CD44
- Las células fueron incapaces de hacerlo (los datos ya presentados). Para validar que este sistema de cultivo es compatible con el mantenimiento de las células TG, nos lo solucionaron ESA
+ CD44
+ CD166
+ CoCSC en la limitación de la dilución en placas que contienen mitomicina C-tratada 3T3 o MEF células alimentadoras como soporte, en función de la línea tumoral utilizado: UM-C4 o UM-C6, respectivamente. Colonia frecuencia formación de CoCSC en estas condiciones era más o menos similar a la frecuencia de células TG observado en el trasplante (~1:86 ± 33; n = 7 para UM-C4 y 1:52 ± 5; n = 3 para UM-C6). Las colonias se cultivaron durante 14 días sin pases antes de la reimplantación en ratones. No sólo las células mantienen la ESA, CD44 y CD166 expresión durante
in vitro Francia culture (Figuras 6A & amp; B), pero se conserva la capacidad de generar tumores heterogéneos se asemejan a tumores parentales también (Figura 6C). Para validar que las células iniciadoras de tumores en tumores procedentes de un solo
in vitro tanto se parecía a tumores parentales y se deriva de una sola célula, las células UM-C4 fueron transducidas con un lentivirus llevar GFP-luciferasa, se generaron tumores en Destinia.com colonias y colonias individuales obtenidas a partir de la ESA
+ CD44
+ CD166
+ células fueron trasplantadas en ratones. Tras la cosecha de estos tumores derivados de una sola colonia, cualquiera de las células con el fenotipo CoCSC o todas las demás células tumorales con diferentes fenotipos se aislaron por FACS, y se llevaron a cabo de tumorigenicidad y clonalidad estudios.