Extracto
Antecedentes
Las células epiteliales en el ADN comunicado de las condiciones malignas en el extracelular compartimiento. De células libres de ADN de origen tumoral puede actuar como un ligando de mecanismos de detección de ADN y mediar cambios en las interacciones epitelio-estroma.
Objetivos
Para evaluar y comparar el potencial efecto regulador autocrina y paracrina de la normalidad y malignos epiteliales ADN en TLR9 y las vías de STING mediado en células HT-29 adenocarcinoma colorrectal humano y fibroblastos normales. relacionados con las células
Materiales y Métodos
ADN aislado de epitelio del colon normal y tumoral de fresco muestras de tejidos extirpados quirúrgicamente congelado se utilizan para el tratamiento 24 y 6 horas de HT-29 de carcinoma de colon y células de fibroblastos HDF-alfa. Se realizó el análisis de todo el genoma de la expresión del ARNm y QRT-PCR para los elementos /miembros de TLR9 vía de señalización. La inmunocitoquímica se realizó para marcadores epiteliales (es decir, CK20 y E-cadherina), 3a ADN metiltransferasa (DNMT3a) y NFkB (para células tratadas HDFα).
Resultados
La administración de tumor derivado de ADN en células HT29 células como resultado significativa (p & lt; 0,05) alteración en el nivel de ARNm de 118 genes (logFc≥1, p = 0.05), incluyendo la sobreexpresión de los genes de metalotioneína (es decir,
MT1H
,
MT1X
,
MT1P2
,
MT2A
), los genes asociados a metástasis (es decir,
TACSTD2
,
MACC1
,
MALAT1
), biomarcador tumoral (CEACAM5 ), los genes del metabolismo (es decir,
INSIG1
,
LIPG
), los genes de moléculas mensajeras (es decir,
DAPP
,
CREB3L2
).
aumento de los niveles de proteína de
CK20, E-cadherina, y se observó después del tratamiento DNMT3a ADN tumoral en células HT-29. tratamiento con ADN sano afectada la expresión de ARNm de 613 genes (logFc≥1, p = 0.05), incluyendo aumento de la expresión de moléculas adaptadoras clave de la vía TLR9 (por ejemplo,
MYD88
,
Irak2
,
NFkB
,
IL8
,
IL-1β
), vía Sting (ADAR, IRF7, CXCL10, CASP1) y el
FGF2
gen.
Conclusiones
ADN del epitelio de colon tumoral, pero no de las células epiteliales normales actúa como un factor pro-metastásico de células HT-29 a través de la sobreexpresión de genes pro-metastásicas a través de vía independiente TLR9 /MYD88. Por el contrario, el ADN derivado de vía TLR9 y Sting inducida sana epitelio del colon señalización en fibroblastos normales
Visto:. FURI I, Kalmar A, B Wichmann, Spišák S, Schöller A, B Barták, et al. (2015) DNA Cell libres de tumor Origen induce una «metastásico» Expresión perfil de HT-29 línea celular de cáncer. PLoS ONE 10 (7): e0131699. doi: 10.1371 /journal.pone.0131699
Editor: Javier S. Castresana, Universidad de Navarra, ESPAÑA
Recibido: Abril 8, 2015; Aceptado: 5 Junio 2015; Publicado: 2 Julio 2015
Derechos de Autor © 2015 FURI et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están disponibles a través de la Expresión génica Omnibus (GEO) con el número de GSE67557
Financiación:. Este estudio fue financiado por el Fondo de Investigación y Tecnología de la innovación, Hungría, KMR_12-1-2012-0216 al BM e Investigación Científica de Hungría Fondo (subvención OTKA-K111743) a la SD. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Altered interacciones epitelio-estroma son fundamentales en la formación del cáncer. Entre los ligandos reguladores conocidos (por ejemplo, factores de crecimiento, citocinas, quimiocinas, hormonas sexuales) ADN derivado de tejido tumoral también está involucrado en esta comunicación a través de receptores celulares de detección de ADN [1] De acuerdo con varios estudios [2-4] los fragmentos de ADN de origen del tumor (es decir, 21 a 500 bases de secuencias cortas de origen humano) juegan un papel en la formación de un microambiente de apoyo tumor (es decir, la promoción de la invasión tumoral y la evasión de la vigilancia inmune) [5-8] el ADN libre de células se origina en necrótica /células tumorales apoptóticas, y puede ser liberado de forma activa por las células vivas para el compartimiento intercelular [9-12]. Este tejido tumoral se originó ADN es detectable en el plasma y suero, y podría servir un biomarcador útil para la detección del cáncer [11]. Contiene una serie de entidades específicas del cáncer, incluyendo oncogenes, genes supresores de tumores, microsatélites, genes aberrantes de metilación aberrante del ADN y los cromosomas reordenados ADN [12]. Estudios recientes confirman la captación y la retención de los oncogenes que estimulan la proliferación celular en las células no malignas después de la integración (oncometastasis) en los receptores cell's genoma [13].
En la medida en que se entienden, la detección de ADN mecanismos en las células diana comprenden dos principales vías de adaptador, es decir, los receptores tipo toll (TLR9) y el estimulador de genes de interferón (STING) itinerarios. [14] citoplasmática TLR9 reconoce ligandos endógenos, tales como patrones moleculares asociados de peligros (apaga) como las secuencias de ADN no metilado [7, 8, 15] la cantidad total de ADN no metilado aumenta en paralelo con la hipometilación del ADN a nivel mundial en el tejido tumoral en comparación con el tejido normal [16]. El aumento de la expresión de TLR9 se detectó en varios tipos de tumores. [1, 17 a 20] El aumento de expresión de TLR9 en células de carcinoma se asoció con un mayor potencial metastásico, mientras que una mayor expresión de TLR9 por células similares a fibroblastos se asoció con una baja probabilidad de metástasis [ ,,,0],21]
la vía de señalización de picadura es un adaptador de ADN a través de la unión de dinucleótidos cíclicos generados por el GMP-AMP (cGAMP) sintasa cíclica enzima (CGA). [22-24]
fuerte sinergismo se ha observado entre cooperar Sting y señalización TLR9. Estas dos vías de señalización están diferencialmente regulados por moléculas cruciales adaptadores (IRF3 /7, Sting, y MyD88) [25]. Además Deng et al. (2014) y Woo et al. (2014) proporcionan evidencias que sugieren las células dendríticas detectar el ADN de las células tumorales a través de la vía de detección de ADN mediada por STING, citosólica. [22, 26, 27]
En base a los resultados anteriores, las células de adenocarcinoma de colon humano HT-29 reflejan el nivel de metilación del ADN alterado (a través de la actividad methyltranferase elevada DNMT3a) y la expresión de marcadores epiteliales CK20 después de la re-administración de ADN auto . [28] en el presente estudio se analizaron los efectos autocrinos y paracrinos de ADN de tumor y el tejido sano en las células HT-29 de cáncer y fibroblastos de análisis de la expresión de ARNm genómico entero, y QRT PCR para la validación de los genes de la vía TLR9. Además se realizó un análisis inmunocitoquímico para marcadores seleccionados de diferenciación, moléculas de adhesión por células, y las metiltransferasas, para la verificación a nivel de proteínas después del tratamiento con el ADN de tejidos sanos y tumorales.
Materiales y Métodos
HT -29 de cultivo de células
HT-29 células de adenocarcinoma de colon humano se adquirieron de LGC Standards (cat. No. ATCC HTB-38) y se cultivaron en un laboratorio de cultivo celular específica libre de patógenos a 37 ° C en 5% CO
2. células HT-29 se mantuvieron en de McCoy 5a medio modificado (Cat No. M8403-500 ml Sigma-Aldrich, St Louis, EE.UU.) suplementado con 10% (vol /vol) de suero bovino fetal (FBS; calidad tipo; PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria), 160 mg /ml de gentamicina (Sandoz, Sandoz GmbH, Austria), y 125 mg /ml de anfotericina B (Sigma-Aldrich, St Louis, EE.UU.). Francia culture
HDFα celular
HDFα células se adquirieron de Life Technologies (cat. No. C0135C) y se cultivaron en un laboratorio de cultivo celular específica libre de patógenos a 37 ° C en 5% de CO2. HDFα células se mantuvieron en medio 106 (Life Technologies Corporation, Carlsbad, EE.UU.) suplementado con LSGS (Life Technologies Corporation, Carlsbad, EE.UU.) y anfotericina B (Sigma). 160 mg /ml de gentamicina (Sandoz, Sandoz GmbH, Austria).
aislamiento del ADN
ADN genómico se aisló de las áreas macroscópicamente normales cerca de los cánceres colorrectal (CCR) y de las zonas de tejidos tumorales de quirúrgicamente frescas CRC muestras congeladas retirados macrodissected (etapa II, moderadamente tumores de colon sigmoide y el recto (25-50 mg de tejido) por PCR de alta kit de preparación de plantilla de Pure (Roche GmbH, Alemania) diferenciados. Estos pacientes con CCR fueron confirmados por diagnóstico histológico definitivo y recibido quimioterapia preoperatoria o radioterapia. El aislado, el ADN libre de proteína se trató con 20 l de ARNasa a /T1 mezcla a 37 ° C durante 1 hora (Thermo Scientific, Alemania). La concentración de ADN aislado y purificado se determinó por Nanodrop- 1000 espectrofotómetro (Thermo Scientific, Alemania).
Ética declaración
el estudio se realizó de acuerdo con la declaración de Helsinki y aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Semmelweis y el gubernamental Comité regional e Institucional de Ciencia y Ética de la Investigación (TUKEB), N °: 23970-2 /2011). escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes incluidos en el estudio.
tratamiento con ADN de las células se sembraron HDFα
HT-29 y HDFα células (HT-29 y con una densidad de 0,5x10
6 y 0.1x10
6) en 6 pocillos de cultivo de células Corning Cellbind placas de múltiples pocillos en RPMI 1640 suplementado con gentamicina, anfotericina B y FBS. Cuando las monocapas alcanzaron el 80-90% de confluencia, 15 g de ADN normal o tumor (disuelto en 200 l de fosfato estéril solución salina tamponada (PBS) se añadieron a los pocillos. El control negativo compuesto por volúmenes apropiados de PBS. Las células se incubaron a 37 ° C en una atmósfera de 5% CO2 y 95% de humedad.
Aislamiento de RNA total por Affymetrix HGU133 Plus 2,0 microarrays y la expresión de genes de QRT-PCR
analiza
Después de 24 horas, las células se lavaron dos veces en 5 ml de PBS estéril. Después del segundo lavado, las células se resuspendieron en 5 ml de PBS. 2.5 se utilizó ml de suspensión de células para el aislamiento de ARN total. el ARN total a partir de los aislados de células HT-29 fue extraído con el kit RNeasy Mini (Qiagen, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. el ARN aislado se almacenó a -80 ° C.
expresión de mRNA de microarrays análisis
la cantidad y la calidad del ARN aislado se ensayaron midiendo la absorbancia y mediante electroforesis en gel capilar usando el 2100 Bioanalyzer y RNA 6000 Kit Pico (Agilent Inc, Santa Clara, EE.UU.). sondas biotiniladas de ARNc se sintetizaron a partir 4,82 ± 0,60 g de ARN total y fragmentado usando el de un ciclo Target Labeling and Control Kit según la descripción Affymetrix. Diez g de cada muestra de cRNA fragmentado se hibridaron en HGU133 Plus2.0 array (Affymetrix) a 45 ° C durante 16 horas. Microarrays se lavaron y se tiñeron usando Fluidics estación 450 (Affymetrix) y un método de tinción de amplificación anticuerpo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las señales fluorescentes fueron detectados por un escáner GeneChip 3000 (Affymetrix).
Evaluación estadística de los perfiles de expresión de ARNm se realizaron análisis
Pre-procesamiento y control de calidad de acuerdo con las sugerencias de los análisis del tumor Mejor Grupo de Trabajo de prácticas (Análisis Mejor Grupo de Trabajo de las prácticas del tumor, 2004). Las imágenes escaneadas se inspeccionaron en busca de artefactos; fueron evaluados y grado de la degradación del ARN; el porcentaje de llamadas presentes (25% & gt). Sobre la base de criterios de evaluación, todas las mediciones cumplen los requisitos mínimos de calidad. En el caso de experimentos de células HT29 y HDFα, la similitud de los 2-2 repeticiones biológica se indicó mediante el método de la distancia euclidiana. Affymetrix arrays de expresión fueron pre-procesados por gcRMA con cuantil normalización y resumen de mediana polaco.
los nuevos análisis para identificar las características expresados diferencialmente se realizó con el análisis de la importancia microarrays (SAM). Se aplicó el método de centroide más cercano disminuido (análisis de predicción de los microarrays = PAM) para la clasificación de la muestra a partir de datos de expresión génica. Predicción del análisis de microarrays utiliza de umbral suave para producir un centroide disminuido, lo que permite la selección de genes característicos de alto potencial predictivo (Tibshirani et al, 2002). Pre-procesamiento, minería de datos y pasos estadísticos se realizaron utilizando bibliotecas Bioconductor en el R-medio ambiente. Anotación y clasificación funcional de los genes discriminatorias se realizaron utilizando el sistema Affymetrix NetAffx.
Transcripción reversa y cuantitativa en tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa
Después de un análisis cuantitativo (Nanodrop) y cualitativa (RNA Kit BioAnalyzer 6000 Pico programa de ARN kit de chips; RIN & gt; 8 en todos los casos), la transcripción inversa se realizó usando 1 g de ARN total (alta capacidad de cDNA transcripción reversa kit, Applied Biosystems, EE.UU.)
cuantitativa en tiempo real (QRT. ) La PCR se realizó utilizando sondas Maestro y SYBR verde (Roche GmbH, Alemania). los niveles de expresión génica para cada muestra individual se normalizaron a GAPDH expresión. Se determinó la expresión génica relativa media y las diferencias se calcula utilizando el método de 2? C (t). Los cebadores de oligonucleótidos de TLR 9 (dependiente de MyD88) vía de señalización se enumeran en la Tabla 1.
Ensayos de viabilidad celular
0.1x10
6 células HT-29 se sembraron a una densidad de 0.1x10
6 en cultivo celular Corning Cellbind placas de múltiples pocillos en RPMI 1640, suplementado con gentamicina y FCS. Después de 24 horas, se cambió el medio; y, 15 g de tumor y el ADN normal [disuelto en 200 l de fosfato estéril (PBS)] se añadió a los pocillos. El control negativo se compone de un volumen apropiado de PBS. Las células se incubaron a 37 ° C en una atmósfera de 5% CO2 y 95% de humedad durante 72 h.
Después de tratamiento de 72 horas, se recogieron las células, se lavaron dos veces en 0,5 ml de PBS estéril, se resuspendieron en 1,0 ml de hielo frío de etanol al 70% y se almacenan a -20 ° C. La medición se realizó por triplicado para cada grupo de tratamiento.
Las muestras se centrifugaron durante 3 min a 1300 rpm. Entonces, las células se resuspendieron en 300 μ1 de tampón de extracción; y, se añadieron 3 l de RNAsa (ARNasa A /T1 Mix, Thermo Fisher Scientific Báltico UAB, Vilnius, Lituania). Después de 15 minutos de incubación a temperatura ambiente, 3 l de jodide propidio (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA; Cat No. 81845.) Se añadió. La medición de FACS se realizó en BD FACScalibur (Nueva Jersey, EE.UU.).
Se realizaron pruebas de exclusión con azul Trypan para evaluar la viabilidad celular tras la exposición a tumor y el ADN libre de células normal. a continuación, la viabilidad cell's HT-29 se cuantificó contando el número de células muertas y vivas utilizando un hemocitómetro al tumor punto 72h tiempo tras la administración normal y ADN.
inmunocitoquímica análisis
De se utilizaron los HT-29 suspensión de células de 2,5 ml para inmunocitoquímica (CPI) analiza. células HT-29 fueron cito-centrifuga en un cubreobjetos y se fijaron en metanol a -20 ° C durante 10 min, y luego se incubaron en TBS que contenía 1% de albúmina de suero bovino, 10% de suero normal de cabra, glicina 0,3 M y 0,1% de Tween 20 , durante 1 hora para permeabilizar las células y bloquear las interacciones no específicas proteína-proteína.
2x10
5 HDFα fibroblastos se sembraron a una Lab-Tek cámara de diapositivas de 8 pocillos en 500 l de medios (Thermo Scientific, Rochester, NY) y se cultivaron hasta el 80-90% de confluencia. Después del tratamiento del ADN las células se fijaron en metanol enfriado con hielo a -20 ° C durante 10 min, y después se incubaron en PBS que contenía 1% de albúmina de suero bovino, /10% de suero normal de cabra, /0.3 glicina M y en 0,1% de Tween 20, . TBS-Tween durante 1 hora para permeabilizar las células y bloquear las interacciones no específicas proteína-proteína
para la inmunotinción, las células se trataron con anticuerpo monoclonal de ratón anti-humano anti-TLR9 IgG (1: 300; ab85860, Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.), y anti-IgG DNMT3a (1: 300; ab13888, Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.) a 4 ° C durante la noche, usando células HeLa como control positivo; anti-citoqueratina 20 (1: 200, clon: PCK-26, Dako, Glostrup, Dinamarca), E-cadherina (1: 2, clon: ECH6, Histopatología Ltd, Pecs, Hungría) mediante la mucosa del colon humano como control positivo; y conejo anti-IgG NFkB (1: 100, GTX102090, Genetex, San Antonio, Texas, EE.UU.), utilizando células HepG2 como control positivo
Las secciones se incubaron durante 30 min con peroxidasa de rábano picante-polímero marcado con peroxidasa. (HRP) conjugado con inmunoglobulinas de cabra de conejo (Envision + System-HRP-DAB; Dako, Glostrup, Dinamarca) anti-ratón /. La tinción se completó mediante incubación con 3,3 'Diaminobencidina solución de cromógeno (solución de cromógeno es parte del kit de Envision). Las secciones se counterstained con hematoxilina.
Evaluación CPI
Las láminas fueron digitalizadas utilizando un instrumento de alta resolución panorámica Scan (3DHistech Ltd., Hungría) y se analizaron con el software de visualización panorámica Histoquant Módulo (3DHistech Ltd ., Hungría). Se evaluaron 1000 células /diapositivas. En el caso de E-cadherina, CK20, inmunorreacciones citoplasmáticos fue evaluado como negativo (-), débil (+), moderada (++) y fuerte (+++). NFkB, expresiones citoplasmáticos nucleares /DNMT3a fue evaluado como negativo (-), débil (+), moderada (++) y fuerte (+++) inmunorreacciones. La densidad del negativo (-)., Débil (+), moderada (++) y positivo fuerte (+++) se evaluó píxeles de células inmunorreactivas
Resultados
Efecto de la normal y ADN epitelial maligno de células HT-29
En primer lugar, se trataron las células HT-29 con el ADN aislado a partir de tejido normal o tumoral. Ambos tratamientos inducidos mRNA sobreexpresión de genes de metalotioneína (es decir MT1H, MT1G, MT1X, MT1P2 y MT2A) (1H metalotioneína, -1G, -1X, -1P2, -2A) (Fig 1A y 1B). tratamiento con ADN derivado de tejido del tumor resultó en la sobreexpresión significativa de n = 118 genes (en el nivel de mRNA). Entre estos genes, se observó metástasis genes asociados por ejemplo, tumor biomarcador CEACAM5 (carcinoembrionario adhesión celular molécula relacionada antígeno-5), por ejemplo genes metabólicos INSIG1 (insulina inducida por el gen 1) LIPG (lipasa endotelial) y los genes molécula mensajera DAPP1 (adaptador dual de fosfotirosina y 3 fosfoinosítidos), CREB3L2 (proteína de unión al elemento de respuesta a AMPc 3-como 2) (Tabla 2)
mapa de calor de expresión de ARN que representa los cambios en las células de control HT-29 y células HT-29 tratadas con ADN aislado de salud (A) y tumoral (B) epitelio del colon.
Una lista completa de genes regulados está disponible en (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) con el número de acceso GSE67557.
Análisis de los 12 elementos de la vía TLR9 en células HT-29 de QRT-PCR
En las células HT-29 o bien tumor y el ADN derivado de tejido de colon sano afectaron significativamente la expresión del gen de IL-1β relacionada con PBS controles tratados. La sobreexpresión de este gen fue mayor después del tratamiento de ADN derivado de tejido del tumor (log Fc 2,33; p = 0.05), que en las muestras tratadas con ADN normal (log Fc 1,59; p = 0.05) en relación con los controles no tratados (figura 2A y 2B).
cambios de expresión de genes de la vía TLR9 MyD88 dependientes de Affymetrix T 133 2.0 de microarrays en el control, se trató de ADN de muestras normales y tumorales (a) y Figura q análisis de RT-PCR de la vía dependiente de TLR9 MYD88 de las células HT-29 ( B).
ensayos de viabilidad celular
los resultados del ensayo de exclusión de azul de tripano reflejan que el tratamiento de células tumorales de ADN libre aumentó significativamente el número de células que viven en la relación con el grupo control (av. 54.22 ± 3,03 vs 42,00 ± 3,78; p = 0.05). También detectadas disminuyó significativamente el número de células vivas en el grupo tratado con ADN normal relacionada con el grupo control (av 28.67 ± 3.08 vs 42.00 ± 3.78;. P = 0.05); (Figura 3A y 3B)
Número de vivir (A) y muertos (B) células HT-29 determinados por Trypán prueba de exclusión con azul.; PI-análisis del ciclo celular de las células HT-29 de cáncer de colon (C).
El análisis del ciclo celular PI mostró población célula viva significativamente mayor (G1 + S + G2 + M fase) en el ADN tumoral tratada grupo vs grupo control (av 39,11 ± 0,57 vs 32,00 ± 2,50;. p = 0.05). tratamiento con ADN normal no afectó el ciclo celular de células contadas, pero se observó un recuento de células inferior en las muestras tratadas de ADN normales (figura 3C).
Efecto de ADN epitelial normal y maligno de células de fibroblastos
Tratamiento de fibroblastos HDFα con ADN normal resultó en la sobreexpresión de muchos genes en la vía TLR9 MYD88, citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento, genes relacionados con la apoptosis, y las prostaglandinas. En total, el ADN de tejido de colon normal resultó en un cambio significativo de expresión para n = 613 genes (Fig 4A). En contraste, el tratamiento con ADN derivado de tejido tumoral afectó a la expresión de sólo n = 12 genes (Fig 4B).
Mapa de calor que representa los cambios de expresión de ARN en las células de control y células HDFα HDF-alfa tratados con ADN aislado de saludable (a) y tumorales (B) epitelio del colon.
importantes cambios de expresión génica inducidos por el tejido sano se originaron tratamiento ADN en las células HDFα se resumen en la Tabla 3. el ADN libre de células indujo la regulación positiva de quimioquinas ligandos como factores quimiotácticos, prostaglandinas y receptores de prostaglandinas, además de las vías de detección de ADN.
Después del tratamiento ADN tumoral de fibroblastos HDFα, se observó que no la sobreexpresión de los elementos de vía de TLR9, quimiocinas, factores de crecimiento , genes relacionados con la apoptosis, prostaglandinas y receptores de prostaglandinas.
Una lista completa de los genes regulados está disponible en (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) con el número de acceso GSE67557.
Análisis de 12 elementos de la vía de TLR9 en fibroblastos de QRT-PCR
cinco genes de la vía canónica TLR9 (Irak2, MYD88, NFKB, IL-8, IL-1β) mostraron sobreexpresión significativa después del tratamiento con el tejido normal de ADN libre de células derivado relacionado con las células control. tratamiento con ADN derivado de tejido tumoral no afectó a los genes de la vía TLR9 MYD88. (Log Fc ≥1; p = 0.05); (Figura 5A y 5B).
cambios de expresión de genes de la vía TLR9 MyD88 dependientes de Affymetrix T 133 2.0 de microarrays en el control, se trató de ADN de muestras normales y tumorales (A) y q análisis de RT-PCR de la vía dependiente de TLR9 MYD88 HDF en las células alfa (B).
análisis de la CPI de los marcadores de diferenciación, adhesión y metilación epiteliales
a continuación se seleccionaron tres marcadores epiteliales, es decir, CK20. E-cadherina, DNMT3a base a los resultados anteriores. [28] tratados con PBS células HT-29 mostraron membrana débil CK20 (Fig 6A), E-cadherina (Fig 6D) y débil /moderada DNMT3a citoplásmica (Fig 6G) expresión de la proteína. tratamiento con ADN tumoral inducida aumento de la expresión de CK20 positiva fuerte (+++) píxeles, (Fig 6C) E-cadherina débil (+) y (++) píxeles positivos moderados (Fig 6f) y DNMT3a débiles (+) píxeles positivos ( Fig 6I). (P = 0.05). ADN tumoral promovido CK20 y E-cadherina expresión en las, HT-29 células de adenocarcinoma de colon no diferenciadas tanto en el nivel de ARNm y proteína (Tabla 4, Figura 6C y 6F) (p = 0.05). DNMT3a sobreexpresión de la proteína correlaciona con los resultados anteriores [28].
expresión CK20 en células HT-29 de cáncer de colon después del tratamiento por PBS estéril (A), por el ADN del epitelio de colon normal (B), por el ADN de tumoral epitelio de colon (C) la expresión de E-cadherina después del tratamiento por PBS estéril (D), por el ADN del epitelio de colon normal (E), por el ADN del epitelio de colon tumoral (F) expresión DNMT3a después del tratamiento por PBS estéril (G) , por el ADN del epitelio de colon normal (h), por el ADN del epitelio del colon tumoral (I).
análisis de factores de transcripción de la CPI y los marcadores de metilación en los fibroblastos
La NF-kB (subunidad p65) reflejó una expresión débil frente al citoplasma /nucleolic en PBS tratada fibroblastos de control (figura 7D). Por el efecto de ADN de tejido normal (Fig 7E), pero no el tejido del tumor originado ADN, (Fig 7F) los fibroblastos reflejan aumento de la expresión de NFkB débiles píxeles positivos (+).
expresión DNMT3a en fibroblastos alfa HDF después del tratamiento por PBS estéril (A), por el ADN del epitelio de colon normal (B), por el ADN del epitelio de colon tumoral (C), la expresión de NFkB después del tratamiento por PBS estéril (D), por el ADN del epitelio de colon normal (E ), por el ADN del epitelio del colon tumoral (F).
La expresión citoplasmática DNMT3a estaba en un (++) nivel débil (+), moderada en los fibroblastos normales (figura 7A). La proporción de píxeles débiles positivos (+) se incrementó ligeramente después del tratamiento normal y el ADN tumoral (Figura 7B y 7C).
Nuestros resultados inmuno-HT en 29 células y fibroblastos HDFα se resumen en la figura 8A, 8B , 8C, 8D y 8E.
evaluación de ICC CK20 (a), e-cadherina (B) y DNMT3a (C) en 29 HT-células de cáncer de colon y NFkB (D) y DNMT3a (e) en fibroblastos alfa HDF.
Discusión
El objetivo principal de nuestro trabajo fue examinar los cambios en la expresión génica después de la administración de ADN libre de células aisladas a partir de tejido de colon sano y tumoral de HT-29 células epiteliales y fibroblastos. No tenemos conocimiento de ningún estudio que han examinado los cambios de expresión en los dos tipos de células diferentes que cooperan durante la tumorigénesis o el efecto de ADN libre de células de diferentes orígenes. De acuerdo con los estudios publicados recientes, ADN bacteriano activa los receptores de detección de DNA, posiblemente debido a la frecuencia de secuencias CpG no metiladas en el genoma bacteriano, que es 20 veces mayor que en el genoma vertebrados. [35] A partir de otros estudios que estaba claro que el ADN de patógeno bacterias regular al alza la expresión de TLR9 [15], en el presente estudio hemos examinado los cambios de expresión génica inducida por el ADN de origen tumoral en las células cancerosas, por genoma gama entera. Este enfoque es similar al descrito por Lee et. Alabama. (2014) demostró que la captación, incorporación y el efecto de este tejido del tumor originado ADN sobre la proliferación celular. [13]
Nuestros resultados se confirman expresión génica se alinean con las observaciones en las publicaciones recientes que demostró que el ADN del tumor intacto se une como un ligando a TLR9 pero no da como resultado la activación aguas abajo de TLR9 vía [36]. En nuestro estudio, los resultados de la matriz de todo el genoma proporcionaron pruebas de que el ADN actos tumorales como un factor pro-metastásico independientemente de las vías de TLR9 y Sting mediante la inducción de la sobreexpresión de los genes asociados a metástasis (MACC1, MALAT1, TACSTD2), el marcador tumoral (CEA) , los genes metabólicos (INSIG1, LIPG) y los genes de moléculas mensajero (DAPP, CREB3L2). MACC1 es un importante factor pro-metastásico que mostró sobreexpresión significativa después del tratamiento con el ADN tumoral. Este gen está estrechamente relacionado con las alteraciones de las expresiones del ciclo-celular y proteínas relacionadas con la invasión. [37] Nuestros resultados reflejan la sobreexpresión de otros genes pro-metastásicos importantes (MACC1, MALAT1, TACSTD2) son confirmadas por los datos anteriores que refleja el papel importante de estos genes en la metástasis y su asociación con mal pronóstico en varios tipos de cáncer epiteliales humanas. [29, 37, 38]
el tejido tumoral tratamiento ADN derivado afectados INSIG 1 y la expresión LIPG. También se sabe que estos dos elementos clave del metabolismo de los lípidos endotelial que se asocia con la progresión del cáncer. [31, 32] El aumento de expresión LIPG se informó como un posible biomarcador de cáncer urinario. [32] Los estudios se describe una mayor expresión de moléculas mensajeras secundarias (DAPP, CREB3L2) en el cáncer de colon con el crecimiento y la invasión de células de cáncer de colon a través de la vía PI3K /AKT activación. [33]
Hemos observado que el tratamiento con ADN tumoral también da como resultado la sobreexpresión de citoqueratina 20, y e-cadherina que fue validado tanto en el ARN (Tabla 4) y el nivel de proteína (Fig 6C y 6F ). E-cadherina como un factor muy importante la regulación de la interacción célula-célula también mostró una mayor expresión en las células HT-29 tratadas con el ADN tumoral. la sobreexpresión de E-cadherina conduce a la supresión de la β-catenina-Tcf transcripción /Lef-dependiente y es probable que inhibe la apoptosis celular. [39]
cambios en la metilación del ADN mediadas por DNMT3a son característicos de los cánceres de colon. Re-expresión de los factores de orientación expresión DNMT3a disminuido significativamente el crecimiento del tumor. DNMT3a sobreexpresión después del tratamiento con ADN tumoral infiere una conexión potencial entre el estado de metilación de ADN derivado de tejido tumoral y el mecanismo de acción de secuencias de ADN derivados de tejido de tumor que actúan a través de receptores de detección de ADN. Los antiguos estudios ponen de relieve un papel crucial de esta enzima en la formación de cáncer colorrectal. No está aislada [40]
tejido de cáncer de colon, pero con su entorno celular a través de señales de quimiocinas, citocinas, crecimiento y la apoptosis se está comunicando con otros tejidos. Los estudios han examinado el papel de los fibroblastos normales y de cáncer asociados (CAF) en el cáncer colorrectal y demostró que los CAF co-cultivadas con células epiteliales aumenta el crecimiento del tumor [41], pero no determinar la función de los fibroblastos normales por separado en la tumorigénesis. Nuestro objetivo fue determinar la reacción de los fibroblastos normales en los alrededores de las criptas epiteliales al ADN liberado y para detectar las vías incluidas en ese proceso.
En el tratamiento de fibroblastos normales con ADN de tejido normal causada activación de la vía canónica TLR9 , como QRT-PCR reveló sobreexpresión de muchos genes implicados en la ruta dependiente de TLR9 MYD88 (MYD88, Irak2, NFkB, IL-8, IL-1β).
a partir de los resultados integrales de análisis del genoma de microarrays se puede concluir que el ADN sano en fibroblastos no sólo es reconocido por vía dependiente de TLR9 MYD 88, pero se encontró que los elementos de la vía citosólica STING dependiente también mostraron sobreexpresión significativa, lo que inicia la producción de IFN. Utilizando el mapa KEGG vía (http://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?hsa04623+340061) 4 genes (ADAR, IRF7, CXCL10, CASP1) de la vía STING mostraron sobreexpresión significativa después del tratamiento con ADN sano en fibroblastos de HDF-a. Esto activa la sobreexpresión inducida por vía de detección de ADN CGA /STING dependiente de interferón factores reguladores IRF1, IRF2, IRF7, irf9. e inducido incremento en la expresión de genes de los receptores de interferón (IFNAR2, IFNGR2). (Log FC≥1, p = 0.05) La sobreexpresión de CASP1 y NLRC 5 sugieren la activación NLRC5 dependiente de la inflamasoma. Davis et. Alabama. publicó que coopera con NLRC5 mediada desmontables interferencia de ARN NLRP3and de NLRC5 casi eliminado de la caspasa 1 actividad. [42]
NFkB como un factor regulador de la transcripción mostró sobreexpresión significativa en los fibroblastos tratados por el ADN normal. (Fig 7E) Muestra que el ADN libre de células inducida translocación NFkB la regulación de la liberación de citoquinas pro-inflamatorias y factores de crecimiento.
análisis del genoma de microarrays conjunto mostró un número sorprendentemente diferente de genes regulación del tejido derivado administración de ADN sano y tumoral (613 y 12 genes, respectivamente). Mientras que el ADN sano activa los sistemas de detección de ADN y regula positivamente muchos genes de citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento, los genes relacionados con la apoptosis, prostaglandinas, ADN tumoral afectados sólo unos pocos genes, que no involucran en estos procesos de regulación. Pensamos que los fibroblastos normales no reaccionan con el ADN del tumor y una interacción con el cáncer de fibroblastos a largo plazo podría iniciar una transformación de fibroblastos normales a los fibroblastos de carcinoma asociado a apoyar fenotipo "metastásico".
Nuestro estudio señala la posible metástasis