Extracto
biomarcadores de cáncer de facilitar la inspección y la detección temprana, pero son conocidos por sólo unos pocos tipos de cáncer. Hemos demostrado el principio de la inducción de tumores de secretar un biomarcador de suero utilizando un vector de suministro de genes se administra sistémicamente que se dirige a tumores para la expresión selectiva de un casete de ingeniería. Hemos explotado replicación tumor selectiva de un virus condicionalmente replicativo Herpes simplex (HSV) combinado con un promotor viral tardío dependiente de la replicación para conseguir la expresión de biomarcadores-tumor selectiva como un vector ejemplo la entrega de genes. La replicación del virus, la producción y la citotoxicidad de biomarcadores fueron bajas en reposo humano normal queratinocitos de prepucio y alta en células de cáncer de
in vitro
. Después de la inyección intravenosa de virus & gt; 90% de los ratones portadores de tumor mostró mayores niveles de biomarcador que los ratones no portadores de tumores y en la necropsia, se detectó virus exclusivamente en los tumores. Nuestra estrategia de forzar a los tumores que secretan un biomarcador de suero podría ser útil para la detección del cáncer en pacientes de alto riesgo, y posiblemente para el seguimiento de la respuesta al tratamiento. Además, porque los vectores oncolíticos para la entrega de genes específicos de tumores son citotóxicos, pueden complementar nuestra estrategia de cribado como un agente "theragnostic". El método de detección de cáncer se presenta en este trabajo introduce un cambio de paradigma en la utilidad de administración de genes, que prevemos mejorar mediante vectores alternativas dirigidas a la entrega de genes y la expresión de los tumores. El perfeccionamiento de este enfoque sea el comienzo de una nueva era para la detección del cáncer clínico que puede ser implementado en el mundo desarrollado y subdesarrollado
Visto:. Browne AW, Leddon JL, curtidor MA, Williams JP, Frischer JS, Collins MH, et Alabama. (2011) Detección del cáncer mediante la administración sistémica de un vector de expresión de genes de codificación de entrega Tumor-Selective segregable de biomarcadores. PLoS ONE 6 (5): e19530. doi: 10.1371 /journal.pone.0019530
Editor Syed A. Aziz, Health Canada, Canada |
Recibido: March 1, 2011; Aceptado: March 31, 2011; Publicado: 11 de mayo de 2011
Derechos de Autor © 2011 Browne et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por la Alianza Pediátrica niños CancerFree Investigación del cáncer (AWB) y el premio de los NIH 1R01-CA114001-01A2 (TPC). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
detección temprana del cáncer es vital para mejorar las tasas de curación porque la etapa del cáncer predice el pronóstico. biomarcadores sanguíneos asociados con el cáncer han sido identificados en unos pocos tipos de cáncer, como el antígeno prostático específico (PSA) en el cáncer de próstata y la alfa fetoproteína en algunos cánceres de hígado y de la línea germinal. Los biomarcadores no han sido identificados para la mayoría de los cánceres pediátricos y muchos cánceres en adultos. Las innovaciones en la transferencia de genes sistémica plantean la posibilidad de entregar y activar genes que codifican marcadores fácilmente detectables en las células tumorales que no producen biomarcadores séricos conocidos de forma selectiva. Hemos tratado de desarrollar una estrategia de cribado de cáncer de prototípico el que la información genética que codifica un biomarcador de suero universal para el cáncer se inyecta en un paciente de forma sistémica, y entregado a expresa dentro de las células tumorales de una manera selectiva del tumor. Los tumores efectivamente se verían obligados a segregar un biomarcador de suero, lo que podría medirse en la sangre o en la orina como prueba de detección mientras que los pacientes libres de tumor mostrarían que no hay o sólo bajos niveles de biomarcadores después de la administración sistémica del vector de suministro de gen (Fig. 1a)
(a) Pasos para la estrategia de detección del cáncer son los siguientes:. 1) virus del herpes simple cáncer de metas (HSV) se inyecta por vía sistémica. 2) Ingeniería de HSV se replica selectivamente en los tumores, mientras que borrarse de tejidos no cancerosos sanos. 3) biomarcador se produce selectivamente en tumores. 4) Las muestras de sangre se recogen y se analizan para los niveles de biomarcadores. 5) niveles en suero de exógenamente entregados biomarcador son más altas en los ratones portadores de tumor que los ratones libres de tumor sanos. (B) los mapas de genes de HSV de tipo salvaje y novedoso recombinante RQ-M38G.
administrados exógenamente biomarcadores codificados por genes requieren la entrega y /o la expresión génica dirigida al tumor. Orientación de pequeñas moléculas y partículas de tumores puede lograrse mediante la permeabilidad mejorada pasiva y retención (EPR) [1], [2], [3], activa la orientación ligando guiada por [4], [5], [6], [7 ], tumor microambiente dependiente de la orientación [8], [9], [10], o una combinación de cada uno [11]. Los virus son de origen natural nanopartículas optimizados para entregar la información genética en las células diana. La principal ventaja de los virus más de vectores no virales para la administración de ADN es su predilección inherente para la replicación en los tumores y la consiguiente amplificación de señal
.
El Virus Herpes Simplex (HSV) tipo 1 es un vector de suministro de gen modelo porque puede infectar una amplia gama de tipos de células humanas, la transducción de ambas células divisorias y quiescentes de manera eficiente, se ingeniería genética para expresar productos transgénicos, aceptar transgenes conducidos por promotores heterólogos u homólogos, es epigenómico, tiene una producción escalable y segura se pueden controlar con fármacos antivirales [ ,,,0],12]. Las mutaciones en los genes HSV selectivos confieren replicación viral del cáncer selectivo. La mutación en los genes de HSV que codifican la subunidad grande de la ribonucleótido reductasa (ICP6 /U
L39) y la tarde ICP34.5 proteína viral (γ
134.5) limita la replicación viral robusto para tumores [13], [14], [ ,,,0],15], [16] y se ha demostrado ser seguro en ensayos clínicos. La activación de la estricta T genes virales finales
L38 depende de la anterior secuencia de activación de los genes inmediatos temprana y primeros virales y los factores de transcripción celular [17] y la T
promotor L38 (T
L38p) se ha demostrado para ser activado de forma selectiva en las células cancerosas en el contexto de la replicación γ competente
134.5
- /- mutantes de HSV [18]. La dependencia de la expresión génica tardía después de la activación por los primeros genes hace U
L38p un fuerte candidato para la entrega de transgenes a células de cáncer con expresión selectiva en el contexto de un doble mutante que carece de HSV ICP6 y γ
134.5.
Hemos desarrollado un HSV como vector de administración génica ejemplo para inducir la secreción de biomarcadores de forma selectiva de los tumores. Otros han incorporado genes que codifican marcadores biológicos secretables a los virus oncolíticos como reporteros para la actividad del virus [19], [20], [21], [22] y casetes del gen para la monitorización no invasiva virales entregado genes [23]. genes cotransportador de sodio-yoduro codificados en los virus oncolíticos también facilitan imágenes de medicina nuclear y el tratamiento de tumores infectados [24], [25]. Recientemente, se identificó y se desarrolló como una poderosa molécula informadora nueva Gaussia luciferasa (gluc) [26] que se secreta fácilmente a partir de células por lo que es útil tanto para
in vitro e
in vivo sobre las aplicaciones donde la cinética de expresión son de interés. Empleamos gluc como un biomarcador de la muestra para esta prueba de principio, porque gluc es 1000 veces más brillante que otras luciferasas, es más sensible que la fosfatasa alcalina segregable, y es detectable en la sangre y la orina
in vivo
[27], [ ,,,0],28]. Utilizando un enfoque de recombinación dirigida [29], hemos diseñado un mutante de HSV, RQ-M38G, con gluc bajo el control del promotor viral tardío U
L38 (Fig. 1b).
Hemos tratado de evaluar nuestra ingeniería vector de suministro de gen viral en modelos animales para varios tipos de tumores diferentes formó diferentes ubicaciones: intraperitoneal, subcutánea, intramuscular y tumores intrarrenales ortotópico. Después de la inyección sistémica de nuestro vector de suministro de gen (RQ-M38G) en la sangre de ratones portadores de tumores, se observó RQ-M38G producir citotoxicidad y biomarcador producción dependiente de células de cáncer. Hemos observado también varios casos en los RQ-M38G fue capaz de forzar cargas tumorales microscópicas para producir biomarcador sanguíneo detectable. Estos ensayos experimentales demostraron el principio de la detección de tumores, obligándoles a expresar un biomarcador segregable.
Resultados
En la caracterización in vitro Red de HSV mutante RQ-M38G
mediada por rQ-M38G transducción de gluc, la replicación y la citotoxicidad se ensayaron mediante la infección de una amplia gama de tipos de células con diversas concentraciones de virus y la evaluación de los niveles de gluc en medios de cultivo (Fig. 2a, Fig. S1), virus de número de copias del genoma (Fig. 2b, Fig. S2) y la citotoxicidad (Fig. 2c, Fig. S3) en los días 2, 4 y 6 después de la infección. se observó citotoxicidad celular dependiente de la replicación en la replicación de prepucio humano (HFK queratinocitos-R), mientras que la citotoxicidad fue atenuada o ausente en diferenciada humano /de reposo prepucio queratinocitos (HFK-q) (Fig. S3). Vero, una línea celular de riñón de mono verde africano que se conoce para la replicación de HSV permisiva, mostró expresión gluc alto y RQ-M38G la replicación después de una dosis baja de infección RQ-M38G (MOI = 0,001, 1 virus por las células 1000).
(a) Gaussia luciferasa (gluc) expresión de los transgenes, (b) la replicación del virus, y (c) la citotoxicidad después de la infección de células Vero y un panel de líneas celulares tumorales humanas con rQ-M38G (MOI = 0,001).
Se evaluó la expresión del transgen, la replicación del virus y la citotoxicidad después de la infección rQ-M38G de 5 líneas de células tumorales humanas. SK-NEP_Luc (sarcoma de Ewing) demostró expresión gluc elevada, la replicación del virus y la susceptibilidad citotóxica similar a las células Vero. Osteomet (osteosarcoma), STS26T_dsRed (TMVNP), y S462.TY (TMVNP) cada demostraron una menor sensibilidad en los tres ensayos. Por último, se evaluó la citotoxicidad en 3 modelos de tumores de ratón bien establecidas derivadas de un fondo C57 /Bl6 (Fig. S3) y varios tiroides murino espontáneo o líneas tumorales de pulmón de células pequeñas generadas por un colaborador (datos no mostrados). HGF116 (rabdomiosarcoma) fue la única línea celular que muestra cualquier citotoxicidad medible, pero sólo a una dosis alta de virus (MOI = 1, 1 virus infecciosos por célula). Estos datos identificados SK-NEP_Luc como un objetivo primordial para los
in vivo
de detección sistemática mediante RQ-M38G mientras que otras líneas celulares tumorales humanas se prevé que sean menos susceptibles de cribado con RQ-M38G.
Sistémico administración de RQ-M38G para identificar tumores presencia
Hemos probado la idoneidad de RQ-M38G como un vector de suministro de genes para forzar la secreción específica del tumor de un biomarcador después de la administración sistémica de RQ-M38G en ratones con y sin tumores . Once ratones fueron inyectados de forma ortotópica con 10
6 células SK-NEP_Luc en su subcapsule renal. los ratones de tumores implantados y los ratones libres de tumor de control fueron inyectados posteriormente por vía intravenosa (i.v.) con 1,2 × 10
7 pfu de RQ-M38G 5 semanas después de la implantación del tumor. En los días 1, 4 y 7 siguientes ratones de inyección de virus fueron imágenes para identificar tumores de luciferasa-positivas y muestras de sangre de luciérnaga se recogieron por ojo retro-orbital y se ensayaron para sangrar gluc suero (Fig. 3a).
In vivo
imágenes identificó 10 de los 11 ratones que recibieron inyecciones de células tumorales se habían formado tumores (Fig. 3b). Un ratón (# 9) nunca se formó un tumor y un ratón (# 11) tenían un tumor que fue apenas detectable. En todos los ratones, donde la carga tumoral era aparente (9 de 11), los niveles de gluc suero fueron de 15 a 440 veces mayor que los ratones libres de tumor, mientras que gluc suero de los otros dos ratones mantenido por debajo de los niveles de gluc suero de control de ratón (Fig. 3). Por lo tanto, RQ-M38G administra sistémicamente para inducir la producción de biomarcadores dio como resultado una sensibilidad de detección del 90% para los ratones de NEP_Luc-cojinete SK. Se obtuvieron resultados similares para los tumores en diferentes sitios anatómicos (Fig. S4).
(a) Evolución temporal de la expresión gluc en subcapsule renal (RSC) SK-NEP_Luc-cojinete y los ratones libres de tumores inyectados sistémicamente con 1,2 x 10
7 pfu o rQ-M38G. Los números en la leyenda representan ratones individuales. (B) la expresión gluc y
in vivo
imágenes de los ratones SK-NEP_Luc que portan cuatro días después de la inyección sistémica de 1.2 × 10
7 pfu de RQ-M38G. Los niveles séricos de gluc para los ratones inyectados con tumor y de control que no recibieron inyecciones tumorales (gráfico de barras) y
in vivo de imágenes
luciferasa de los ratones que recibieron inyecciones de células tumorales.
Para determinar la ubicación de RQ-M38G en los tejidos siguientes iv inyección y confirme que la señal de gluc suero estaba siendo expresada a partir de tumores y no los órganos normales, los órganos se recogieron de los ratones 7 días después de la infección de virus y se sometieron a inmunofluorescencia para la expresión de GFP y la PCR cuantitativa para los genomas de virus. Sólo tumores demostraron la expresión de GFP tanto en el control (datos no mostrados) y los ratones experimentales (Fig. 4a) inyectados sistémicamente con RQ-M38G. PCR cuantitativa para las copias del genoma de virus refleja la misma distribución de virus en los ratones portadores de tumores como se ha visto con la expresión de GFP en que las copias de virus eran al menos 2.100 veces mayor en los tumores que los tejidos sanos (Fig. 4b). Inmunofluorescencia y qPCR indican que la infección por virus predominó en el tumor mientras que ser mínima en los tejidos sanos. Por lo tanto, se administra sistémicamente RQ-M38G identifica con éxito la presencia de tumores SK-NEP_Luc forzando tumores para producir un biomarcador secretable. Hemos demostrado resultados similares en modelos de tumores que son menos susceptibles a la infección por virus, incluyendo los modelos de tumores de la vaina nerviosa periférica malignos (en ambos lugares subcutánea e intraperitoneal) y osteosarcoma (Figuras S5, S6, S7)
.
(a) inmunofluorescencia GFP en ratones SK-NEP_Luc devengan con y sin administración del virus sistémica. Los ratones que recibieron el virus (# 1 y#2) se observó expresión de GFP selectiva en el tumor, mientras que los ratones que no recibieron el virus (Virus Sin control) mostraron GFP-negatividad global. Barra de escala = 15 micras. (B) La biodistribución del virus en ratones con tumores SK-NEP_Luc después de la administración sistémica según lo determinado por qPCR para los genomas virales.
inducción de la expresión gluc en los tumores mediante inyección intratumoral de virus
se observó una diferencia clara entre los otros tres modelos de tumores analizados, que cada uno mostró SK-NEP_Luc y menor
in vitro
citotoxicidad y la expresión gluc junto con una menor expresión de biomarcadores
in vivo
. Para identificar si la entrega de mayores dosis de virus a los tumores podría aumentar
en
biomarcador expresión, administramos RQ-M38G directamente en los tumores mediante inyección intratumoral en modelos de S462.TY y Osteomet.
Los ratones in vivo teniendo Osteomet flanco subcutánea tumores mayores de 200 mm
3 fueron inyectados con 1,9 × 10
5 pfu de virus. Las muestras de sangre se recogieron y analizaron para gluc en cada punto de tiempo (Fig. S7a), mientras que dos ratones fueron sacrificados a cada punto de tiempo y se analizaron para copias genómicas virales por qPCR (Fig. S7b). Los niveles séricos de gluc en la sangre de los ratones portadores de tumores inyectados con RQ-M38G era más alto que los niveles de gluc en ratones no infectados de control, y el aumento de gluc con el tiempo trazado un perfil similar al número de copias viral en los tumores. A pesar de una amplificación genómica 4.000 veces en los tumores, los niveles de gluc suero aumentaron sólo 10 veces por encima de los controles no infectados. La inyección intratumoral con 8 × 10
3 pfu u 8 × 10
7 pfu de virus se repitió en los tumores S462.TY cuando los tumores eran mayores de 500 mm
3. Cuatro días después de i.t. los niveles séricos de inyección gluc se ensayaron como se representan en la Fig. S8. Todos los ratones que recibieron la inyección intratumoral de virus demostraron niveles gluc más altos que en los controles libres de tumor sin una diferencia significativa en la concentración de gluc entre la dosis baja y la dosis 10.000 veces alta virus, lo que sugiere la saturación a la dosis baja (por lo menos a través de la ruta intratumoral).
sensibilidad de biomarcadores
Los pequeños modelos animales utilizados para detectar cargas mínimas tumorales presentes desafíos de escalabilidad teóricos en la traducción de los resultados a lo práctico a escala humana. Para hacer frente a estos retos tratamos de evaluar los límites de detección de biomarcadores teóricos para nuestra base de un
in vitro
ensayo y detectar pequeños tumores pesados
in vivo fotos: por 3 métodos: formación de imágenes de luminiscencia IVIS, mediada por virus gluc expresión en el suero y post mortem análisis histológico. El volumen de sangre en un ratón es de aproximadamente 2 ml (8% del peso total 25 g cuerpo [30]). Esférica tumor SKNEP-Luc compone de 10
6 células se determinó que era de 1,83 mm de diámetro mediante la medición de volumen ocupado en una muestra centrifugada de un número igual de células, suponiendo tumores pequeños están compuestos predominantemente por células tumorales. De diez a 1 millón de células se colocaron en 2 ml de medio de cultivo celular y co-infectados con RQ-M38G a una MOI de 3 para asegurar todas las células estén infectadas. Dos días después de la infección medios de cultivo celular se recogió y se analizó la concentración de gluc. Virus mediada expresión gluc se podría resolver simultáneamente fiable por la transducción de 1.000 células, que se aproxima a un tumor esférica de diámetro
Se establecieron 183 micras (Fig. S9). Tumores del sarcoma de Ewing (SKNEP-Luc) de diferentes tamaños en 11 ratones mediante la inyección de 10
6 células en el riñón izquierdo subcapsularly en 3 grupos de ratones de 3 semanas consecutivas. Los ratones con tumores que se habían desarrollado a través de 2, 3 y 4 semanas y 4 ratones de control libres de tumor fueron infectados sistémicamente con 1 × 10
7 pfu de RQ-M38G. Cuatro días después de la infección los ratones fueron imágenes a través de IVIS, las muestras de sangre recogidas para gluc cuantificación, y los ratones fueron sacrificados para determinar el tamaño del tumor histológico.
In vivo
de formación de imágenes para la expresión de la luciferasa reveló ratones desnudar tumores drásticamente diferentes en tamaño en el momento de la infección y el sacrificio (ejemplos extremos mostrados en la Fig. 5a). La concentración sérica de gluc en ratones portadores de tumores 4 días después de la infección revelaron niveles gluc mayor que los ratones de control libres de tumor infectadas de manera similar (Fig. 5b). La evaluación histológica de los tumores en cada ratón reveló un tumor macroscópico y microscópico en focos tumorales de ratón
i
y
ii
respectivamente (Fig. 5c).
a)
imágenes in vivo Red de dos ratones (
i
y
ii
) con muy diferentes cargas tumorales SKNEP-Luc. b) La concentración sérica gluc en i ratón, II y cuatro ratones de control libres de tumor 4 días después de la infección sistémica con 1 × 10
7 pfu de RQ-M38G. c) hematoxilina y eosina imágenes macroscópicas de los riñones portadores de tumor (T = tumorales, barras de escala = 1 mm) y las inserciones de focos tumorales microscópicos en el parénquima renal de ratón
ii gratis (barra de escala = 200 micras).
Discusión
Hemos desarrollado una nueva estrategia de cribado del cáncer mediante el cual los tumores se ven obligados a secretar un biomarcador. Hemos desarrollado un VHS condicionalmente replicativo, RQ-M38G, para forzar selectivamente las células tumorales que secretan Gaussia luciferasa como una demostración de esta estrategia de cribado. animales portadores del tumor dado intravenosa RQ-M38G expresan mayores niveles de biomarcadores en comparación con los animales libres de tumor, que mostraron sólo es baja, la expresión de fondo. La utilidad de RQM-38G para el cribado parecía ser una función de la capacidad de un tumor dado para apoyar la replicación de HSV. Independientemente del tipo de tumor o la localización, la detección del tumor mediante RQ-M38G era muy sensible a la presencia del tumor.
Una característica crítica para la detección del cáncer es la capacidad de detectar tumores pequeños, en última instancia, en las personas. Una
a priori
preocupación era que los tumores pequeños pueden estar asociados con menos área de superficie vascular disponible para la entrada de HSV. Este problema no parece ser una limitación en los ratones, ya que en algunos de los modelos hemos sido capaces de detectar tumores tan pequeñas como 4-5 mm de diámetro (50 mm
3) y en otro modelo que detectan la carga tumoral microscópica . Escalabilidad para los seres humanos (con volúmenes de sangre más grandes) es difícil de predecir, pero algunas estimaciones son posibles.
In vitro
evaluación de los números de células tumorales SKNEP-Luc creciente indica que la infección de tan sólo 1.000 células en un volumen de medio de cultivo celular igual a unos rendimientos en volumen de sangre de ratón detectable secreción gluc. Por lo tanto, la expresión simultánea de gluc de 1.000 células en cualquier momento en un ratón es teóricamente detectable. En estas condiciones infectan 10% de las células en un tumor de diámetro 400 mm (10
4 células) sería detectable en un ratón. Cuando escalado de un ratón a un humano el límite teórico de la detección se incrementa en una proporción de 1:2600 (25 mg kg mouse:65 humano) y diluyendo el biomarcador en un volumen de sangre humana media mayor de 4,7 L. El uso de estos números, el límite teórico de detección cuando la infección de 10% de las células en un tumor se cambia de una masa 394 um de diámetro en un ratón a un diámetro del tumor 1-4 mm en un ser humano. Si sólo el 1% de las células tumorales se transducen por el virus, tumores tan pequeños como 8,5 mm de diámetro todavía podrían ser detectables mediante estos cálculos. Esta sensibilidad sugiere un fuerte potencial para la identificación de las cargas mínimas de tumores, incluso cuando se escala a las proporciones humanas
.
La capacidad de esta estrategia de cribado para revelar tumores depende de factores virales, microambiente tumoral, y limitaciones en la detección de biomarcadores cada uno de los cuales pueden ser mejorado de verdad practicidad mundo. Aquí hemos empleado un HSV doblemente atenuada para efectuar una transducción específica de tumor y la expresión génica. Tales vectores ya se han documentado para ser seguro para uso humano [31]. virus alternativos con mutaciones simples o menos atenuantes demuestran mayor capacidad oncolítico también ya están en ensayos clínicos (por ejemplo, HSV1716, ver www.clinicaltrials.gov, NCT00931931). El acoplamiento de esta estrategia de detección para los virus atenuados menos probable que diversificará su utilidad entre los diversos tumores malignos sólidos, así como mejorar el componente terapéutico. Los agentes que son al mismo tiempo tanto de diagnóstico y terapéutica se han denominado "theragnostic". Es posible nuestra estrategia podría ser refinada aún más por el uso de un promotor más robusto cáncer dependiente para conducir la expresión de biomarcadores. de administración de vector mejorado para el tumor también se puede conseguir usando tumor estrategias de focalización captación de mejora de moléculas pequeñas y nanopartículas como recientemente descrito con el uso de la internalización de péptidos RGD [8]. comercialización eventual de nuestra estrategia de cribado propuesto beneficiarse del uso de biomarcadores que ya están en uso generalizado como ßhCG (prueba de embarazo), PSA (cáncer de próstata) y αFP (hígado y tumores malignos de células germinales). la sensibilidad del ensayo de biomarcadores en el contexto de esta estrategia de cribado todavía puede mejorar exponencialmente a medida que se está realizando con las tecnologías de microfluidos [32], [33], [34], [35].
Una preocupación significativa para el cáncer prototípico método de cribado desarrollado en este trabajo es el desarrollo de una respuesta inmune al agente de administración de genes o el biomarcador transducidas que impida el uso repetido de la herramienta de detección. El trabajo previo en el campo ha demostrado que los animales pre-inmunizado siguen teniendo el beneficio terapéutico del HSV con una eficacia sostenida [36]. Debido a que 80% de la población general ha sido expuesto a HSV, la aplicación de esta estrategia de detección con HSV dependerá de la eficacia de los virus del herpes simple de ingeniería administrados a inmunocompetentes sujetos que han sido previamente expuestos a los de tipo salvaje cepas de HSV.
in vitro
detección de líneas de células tumorales de ratón reveló que todas las líneas de ratones que probados mostraron comparativamente baja susceptibilidad a la infección por el virus de nuestro mutante atenuada, a la par con las células humanas normales quiescentes. En modelos in vivo de HGF116 no demostraron sensibilidad del virus tras i.t. o por vía i.v. inyección. Por lo tanto, no podemos evaluar nuestra estrategia de cribado del cáncer en un modelo inmunocompetentes hasta que la identificación de modelos de ratón que son más susceptibles a HSV humano. La aplicación de esta estrategia puede evolucionar con vectores no virales [37] o vectores virales enmascarados en liposomas [38].
El desafío de la detección del cáncer en toda la población es el desarrollo de ensayos clínicos que sean fiscal práctica, universales través de un espectro de tipos de cáncer, y fácil de implementar. El examen físico, mientras que asequible, a menudo no para identificar tumores malignos que son profundos o asintomática. beneficios de imagen de alta sensibilidad, pero no siempre pueden distinguir masas benignas o no específicos de la enfermedad maligna (por ejemplo, nódulos pulmonares pueden ser granuloma o cáncer), es un desafío financiero y difícil de aplicar en términos generales. Con la identificación de biomarcadores adecuados, la detección del cáncer podría potencialmente ser económicamente viable con el punto automatizada de pruebas de atención (POCT) tecnologías (www.i-stat.com, www.biosite.com, www.siloambio.com [39]).
Este trabajo demuestra el principio de la inducción de la expresión de un transgén segregable en el cáncer utilizando un agente de administración de genes administra por vía sistémica como un biomarcador para la detección de la presencia del tumor. El nuevo principio de información propuesto y demostrado en este trabajo podría contener implicaciones inmediatas para los pacientes con riesgo de cáncer conocidos, como la predisposición genética (BRCA-1, las mutaciones NF1) o pacientes con antecedentes de cáncer que están en alto riesgo de recurrencia. En última instancia, la administración exógena de un agente de administración de genes de cáncer de orientación (infeccioso o no) podría forzar a cualquier enfermedad maligna de secretar un biomarcador y podría utilizarse como un primer paso universal para la detección del cáncer de toda la población. El impacto de este enfoque sería revolucionar la tecnología para la detección del cáncer en los países industrializados y los países en desarrollo, donde las imágenes y el diagnóstico basado en la biopsia puede no ser tan fácil de conseguir.
Materiales y Métodos
Las células y Los virus
líneas de células tumorales humanas se han descrito anteriormente [40], [41] o fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), excepto SK-NEP_Luc, que era una especie de regalo de Jason Frischer (CCHMC, Cincinnati, OH). Las células se cultivaron en DMEM o medio McCoys 5A (ATCC, SK-OV-3, SK-NEP_Luc) con 10% de suero bovino fetal (Hyclone, Logan, UT) y penicilina /estreptomicina (Life Technologies, Carlsbad, CA). líneas celulares de ratón C57 /Bl6 LLC
GFP [42] (carcinoma pulmonar de Lewis) y B16-BL6 (melanoma) fueron regalos de tipo Joe Palumbo (CCHMC, Cincinnati, OH) y HGF116 (rabdomiosarcoma) se derivó de una ingeniería genética ratón. primarios de prepucio humano queratinocitos (ML) fuera una especie de regalo de Susa Wells (CCHMC, Cincinnati, OH), que se cultiva en EpiLife Media (Cascade Biologics, Portland, OR) y diferenciada en los queratinocitos en reposo con 10% de SFB y 1 mmol /l de CaCl
2 [43]
rQ-M38G se construyó como sigue:. El U
promotor L38 fue aislado de HSV rRp450 por PCR usando cebadores diseñados anteriormente [18] que se han modificado para incluir un 5 ' BglII y 3 'sitios HindIII (F1, R1 en la Tabla S1) y se clonó en los sitios BglII y HindIII de pCMV-gluc (Invitrogen), reemplazando el promotor de CMV. El casete de U
L38p-gluc se amplificó por PCR a partir de pU
L38p-gluc con inclusión de un 5'SpeI y 3 'EcoRI y se clonó en los sitios SpeI-EcoRI del plásmido lanzadera "HSV-rápido", pT-OriSIE4 /5 [29] (un especie de regalo de Yoshinaga Saeki, la Universidad Estatal de Ohio, Columbus, Ohio), en la que se había eliminado el oriS (/5 fragmento E4 Kpn I. el plásmido resultante, pT-T
L38p-gluc, fue utilizado en el sistema de HSVQuick BAC para generar rQ-M38G [29]. los cebadores para el análisis de PCR y secuenciación se muestran en la Tabla S2. los virus se propagaron y se titularon [44] mediante ensayo de placas en células Vero. citotoxicidad de la célula se determinó en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos utilizando un MTS /PMS ensayo modificado (Promega, Madison, WI).
Gaussia ensayo de luciferasa
gluc actividad se evaluó en 10 muestras l de cultivo de tejidos medios de comunicación o de suero por ensayo quimioluminiscente [45] en un luminómetro autoinjecting mediante la inyección de 50 l de 50 mM coelenterazina (Prolume, Pinetop, AZ) a cada muestra por triplicado y la integración de la señal durante 2,5 segundos [26].
biodistribución
los estudios con animales fueron aprobados por virus de Niños de Cincinnati el hospital Institucional Cuidado de Animales y el empleo (protocolo animal#9D12095). 5-6 semanas de edad hembra Balb /c atímicos ratones desnudos (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN) fueron inyectados con 1-5 millones de células. Las células se prepararon en 33% de Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, MA) y 66% tampón fosfato salino (PBS, pH 7,4) para la inyección subcutánea (s.q.) y PBS sólo para subcapsule renal (r.s.c) o la inyección intraperitoneal (i.p.). dosis de virus se describen en el texto. Virus se suspendió en 100 a 150 l de PBS para inyecciones vena de la cola y 50 a 100 l de PBS para las inyecciones intratumorales, que se distribuyeron en 5 fracciones en todo el tumor.
Preparación de tejidos y la inmunofluorescencia
Los tejidos fueron fijas, empotradas, y se cortaron en secciones de 12 micras utilizando procedimientos estándar. Las secciones se permeablized con 0,2% Triton-X en PBS durante 10 minutos, se bloquearon en suero de cabra normal al 10% durante 60-90 minutos, y se incubaron con Chicken anti-GFP (# 16901, Millipore /Chemicon, Billerica, MA) durante 60 minutos , se enjuagaron tres veces con PBS, y se incubaron con anticuerpo secundario (de cabra anti-pollo FITC, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), se enjuagaron con PBS, y montado con Fluoromount-G (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA). Todas las diapositivas fueron incluidas en la imagen con el software de imágenes de OpenLab (Improvisación, Waltham, MA) en un microscopio de fluorescencia Zeiss invertido.
HSV genoma cuantificación
Se aisló el ADN de tejidos de ratón utilizando el aislamiento de ADN Puregene Gentra kit (Qiagen, Valencia, CA) y se cuantificó usando el espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE). PCR en tiempo real se realizó utilizando el sistema ABI 7500 (Applied Biosystem, Foster City, CA) [46]. Normas se hicieron a partir de ADN viral purificado HSV1716.
RQ-M38G de expresión de genes y la replicación de los estudios en líneas celulares
Se infectaron las células en placas de 12 pocillos durante 1 hora y se recogieron en los tiempos indicados. 100 uL de la suspensión celular se utilizó para la medición de Gaussia luciferasa, mientras que la suspensión celular restante se sometió a tres ciclos de congelación-descongelación y se centrifugó a 20.000 x g. Los sedimentos se resuspendieron en 200 uL de PBS. Se aisló el ADN utilizando el kit Blood y DNeasy Tissue (Qiagen, Valencia, CA). Fast-PCR en tiempo real se realizó utilizando el Sistema de 7900HT Fast PCR en tiempo real (Applied Biosystem, Foster City, CA). se añadió ADN estándar o ADN extraído de células infectadas (40 ng) a 10 l de Kit SYBR Premezcla Ex Taq II (Takara, Otsu, Shiga, Japón), 1,6 l de una mezcla de cebador de timidina quinasa (TK 290-F: 5 ' TCG CGA ACA TCT ACA CCA CAC AAC; CT 400-R: 5 'CGG CAT AAG GCA TGC CCA TTG TTA; cada uno a 400 nM), 0,4 l Rox (Takara) y agua de calidad para PCR a un volumen final de 20 l por reacción. PCR fue de 1 ciclo de 95ºC durante 30 segundos, 40 ciclos de 95 ° C durante 3 segundos, 60ºC durante 15 segundos y 72 ° C durante 25 segundos.
In vivo
fueron inyectados imágenes
Ratones con 150 mg /kg de D-luciferina (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) y fotografiada por IVIS200 (Calipur Lifesciences).
Apoyo a la Información
Figura S1.