Extracto
Antecedentes
El mecanismo molecular entre la infección por Helicobacter pylori (H. pylori) y cáncer gástrico sigue siendo en gran parte desconocido. En este estudio, se determinó el papel de los genes miARN en H. pylori inducida por el cáncer gástrico.
Métodos y resultados
Hemos encontrado que el miR-204 se redujo en los tejidos H. pylori positivos por QRT PCR. Desmontables de miR-204 mejora la capacidad de invasión y proliferación de células de cáncer gástrico in vitro. Ensayo de la luciferasa reveló que era SOX4 gen diana de miR-204, que fue encontrado hasta reguladas en H. pylori positivo tejidos. El descenso de regulación de miR-204 y la sobre expresión de SOX4 promovido proceso de transición epitelio-mesenquimal.
Conclusión
En conjunto, nuestros resultados demostraron que el miR-204 puede actuar como un supresor tumoral en H. pylori induce cáncer gástrico por la orientación SOX4
Visto:. Zhou X, Li L, D J, Zhang G (2014) Disminución de miR-204 en H. pylori asociada a cáncer gástrico promueve la proliferación celular y la invasión del cáncer al dirigirse a SOX4. PLoS ONE 9 (7): e101457. doi: 10.1371 /journal.pone.0101457
Editor: P. Jin Cheng, H.Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 18 Marzo, 2014; Aceptado: 5 Junio 2014; Publicado: 1 de julio 2014
Derechos de Autor © 2014 Zhou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Guoxin Zhang fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81.270.476) (http://www.nsfc.gov.cn/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico es el cuarto cáncer más común y la segunda causa de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. Hasta la fecha, se han investigado los mecanismos moleculares en el cáncer gástrico, sin embargo, no han comprendido plenamente [2]. carcinomas gástricos se supone que deben desarrollarse de acuerdo con un proceso de varias etapas de la carcinogénesis, que está fuertemente asociada con la infección por el patógeno bacteriano,
Helicobacter pylori gratis (
H. pylori
) [3].
H. pylori
, que coloniza el estómago de 50% de la población mundial, ha sido clasificada como una clase I carcinógeno debido a su papel causal en el desarrollo de cáncer gástrico [4].
Se ha informado que el desarrollo y progresión del cáncer gástrico pueden ser atribuidos a microRNAs (miRNAs) [5] - [8]. MiRNAs son pequeños ARN no codificantes, que regulan la expresión de genes diana a través de la represión o de la traducción del ARN mensajero (ARNm) la degradación [9]. MiR-204 expresión aberrante se informó a asociarse con diversos tipos de cáncer [10], [11]. Sin embargo, poco se sabe acerca de la función de miRNA-204 en el cáncer gástrico. Matsushima realizó miARN estudio matriz en H. pylori positivo tejidos y contols y se encontró que la expresión de miR-204 fue significativamente menor en los tejidos H. pylori positivos [12].
En los seres humanos, la región determinante del sexo Y (SRY ) de la familia caja, también se hace referencia a la familia SOX, un total de 20 factores de transcripción altamente conservadas que desempeñan papeles importantes en el desarrollo del cáncer de próstata [13]. Estos factores de transcripción se definen por una secuencia de firma conservada en el dominio de unión a ADN grupo de alta movilidad (HMG) (DBD) [14], [15]. SOX4 es una proteína de 47 kDa está altamente conservada en vertebrados y su importancia clínica ha ganado una creciente atención en los últimos años, con numerosos informes que sugieren que SOX4 puede contribuir a la progresión del tumor [16], [17]. El aumento de expresión SOX4 se encuentra en los tumores de la vejiga, próstata y colon, y con los tumores de pulmón de células no pequeñas [18] - [21]. La expresión desregulada de SOX4 se ha correlacionado con la proliferación aumento de células de cáncer, la supervivencia celular, la inhibición de la apoptosis y la progresión tumoral en el cáncer gástrico [22]. Su sobreexpresión también se ha relacionado con un mal pronóstico en las clínicas y es un marcador para predecir el resultado de los pacientes con cáncer gástrico [23]
.
Sin embargo, hasta hace poco, no está claro que sea H. pylori puede inducir la expresión SOX4 través de la regulación negativa de miR-204. Por lo tanto, hemos realizado nuestro estudio para investigar más a fondo el papel de miR-204 y SOX4 en H. pylori carcinogénesis inducida.
Materiales y Métodos
muestras clínicas
Los pacientes con o sin H.
pylori
se habían sometido a gastroscopio en el primer hospital Afiliado de la Universidad médica de Nanjing, provincia de Jiangsu, china a partir de marzo de 2012 y diciembre de 2013. las muestras tomadas de los 250 pacientes (150 pacientes cancerosos y 100 pacientes con tumor) se recogieron, y se identificaron positivo cuando la prueba rápida de ureasa fue positiva. Estos pacientes seleccionados fueron confirmados también por
prueba de aliento con 13C. pacientes no cancerosos se clasificaron en gastritis superficial, gastritis atrófica y la displasia de acuerdo con la clasificación patológica. Este protocolo fue aprobado por el Comité Ético del primer hospital afiliado de la Universidad de Medicina de Nanjing, y cada paciente había escrito el consentimiento informado.
Cultivo de células
SGC-7901 /MKN45 líneas celulares de cáncer gástrico ( adquirido de ATCC) se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Gibico) y penicilina (100 U /ml). Las células se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera húmeda con 5% de CO
2.
El cultivo bacteriano y la infección modelo
H
. pylori se inoculó en la placa y se cultivó a 37 ° C en una atmósfera microaerofílica con 5% O
2, 10% de CO
2 y 85% N
2. Después de 3 días, la bacteriano se resuspendió en medio RPMI-1640 sin FBS y células infectadas en un MOI de 100. Después, las células se recogieron después de 48 h de infección.
Aislamiento de RNA total y RT-PCR cuantitativa
total de ARN se extrajeron a partir de tejidos recogidos y líneas celulares utilizando Trizol (Tarkara, Japón) y luego ambos genes miARN y mRNA fueron transcritas inversa a cDNA. La transcripción inversa se realizó usando el kit de transcripción inversa (Takara, Japón). La expresión de miRNAs maduros y posibles genes diana se midieron mediante QRT-PCR con el kit SYBR Green PCR (Takara) en Applied Biosystems StepOne-Plus Real-Time PCR System y ARN U6 humano se amplificó como un control interno. La proporción relativa de la expresión de miR-204 se calculó por el método -ΔΔCT 2
. Las reacciones de PCR se realizaron con los siguientes cebadores: para hsa-miR-204, hacia adelante, 5'-CAUCUUCCAGUACAGUGUUGGA-3 'y para U6, adelante, 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'. los niveles de expresión relativos de SOX4 mRNA fueron examinados por SYBR Green PCR en tiempo real (RT-PCR) y se normalizó a GAPDH. Los cebadores para SOX4 fueron hacia adelante, 5 'AGCCATCTCGGAGGAATA 3' y revertir, 5 'CAGACAACCGGCCTTTAT 3'; y para GAPDH, adelante, 5'-CGTGGGCCGCCCTAGGCACCA-3 'y revertir, 5'-TTGGCTTAGGGTTCAGGGGGG-3'. RT-PCR se realizó utilizando el Fast Real-Time PCR sistema ABI 7500 (ABI, CA, EE.UU.).
La inmunohistoquímica
Los tejidos se fijaron en paraformaldehído al 4% y se cortan desde el bloque de parafina para 5 m de espesor. Después de desparafinado con xileno y la rehidratación con una serie graduada de etanol, los portaobjetos se calentaron en la autoclave durante tres minutos usando tampón de citrato de sodio (pH 6,0) y se incubaron con el anticuerpo SOX4 (Tecnología de Señalización Celular) a 4 ° C durante la noche. Tampón de bloqueo de suero o dilución de anticuerpo se utilizó como controles negativos. Los anticuerpos utilizados antes fueron los mismos que para el análisis de transferencia Western. Las fotografías fueron tomadas por el Microscopio de (Nikon Eclipse 50i). Se contó el número de células de tinción positiva que muestran inmunorreactividad de SOX4 en diez campos microscópicos representativos, y el porcentaje de células positivas se calculó también. El porcentaje de puntuación de las células tumorales inmunorreactivas se describe como sigue: 0 (0%), 1 (1-10%), 2 (11-50%), y 3 (& gt; 50%). La intensidad se puntuó como sigue: 0 (negativo), 1 (débil), 2 (moderada), y 3 (fuerte). El nivel de expresión de SOX4 se midió multiplicando el porcentaje y la puntuación de intensidad. muestras de alta expresión significa tumores con una puntuación superior a 4 multiplicado mientras que los otros fueron considerados como una baja expresión.
La proliferación celular assasy
La proliferación celular se examinó mediante ensayo de sal de tetrazolio soluble en agua utilizando la célula contando Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japón). En, células cortas (1,5 × 10
3 /pocillo) se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos por triplicado y se incubaron durante 4 días a 37 ° C /5% de CO2 en un incubador humidificado. Las células viables se cuantificaron en cada intervalo de 24 h mediante la medición de DO450 utilizando un lector de microplacas. (Epoch; BioTek, Winooski, VT)
Las células (2 × 10
6) se fijaron con 75% de etanol a 4 ° C durante la noche y después se lavó con PBS frío y se trató con RNaseI, seguido de tinción con yoduro de propidio durante 30 minutos en la oscuridad. a continuación, el análisis del ciclo celular se realizó por citometría de flujo (FACSCalibur; Becton Dickinson, Sparks, MD).
Las células se tripsinizaron y se sembraron en placas de 6 pocillos (500 células /pocillo) y se cultivaron durante 2 semanas. Las colonias se tiñeron con 1% de cristal violeta durante 30 minutos después de la fijación con 4% de paraformaldehído durante 30 minutos. El número de colonias, que se define como & gt; se contaron 50 células /colonia. Se llevaron a cabo tres experimentos independientes. Los datos se calculó mediante la prueba de t pareada.
ensayo de migración celular (cicatrización de heridas)
Un ensayo de cicatrización de heridas se utilizó para evaluar la capacidad de la motilidad de células tumorales. Brevemente, las células (1 * 10
6 /pocillo) se sembraron en placas de seis pocillos, cultivadas durante la noche, y transfectadas con el miR-204 imita o inhibidor, pcDNA-SOX4 o pcDNA-NC. Al llegar a la confluencia, la capa de células se raspó con una punta de plástico estéril y después se lavó con medio de cultivo dos veces y se cultivaron de nuevo durante un máximo de 48 con medio de suero reducido que contiene 1% de FBS. La reducción de distancias se midió y los datos se resumieron basa en ensayos séxtuples para cada experimento.
invasión de la célula de ensayo
actividad de la invasión de las células se evaluó a través de insertos de cultivo celular recubiertas con matriz de membrana basal (BD Biosciences , Bedford, MA) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, un total de 1 x 105 células en 0,2 ml de medio RPMI-1640 sin suero se sembraron en un aparato Transwell. Se añadió medio RPMI-1640 que contiene 10% de FBS (600 l) a la cámara inferior. Después de la incubación de las células durante 24 horas a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%, las células en la superficie superior de la pieza de inserción se eliminaron frotando con un hisopo de algodón. Las células que invadieron a la superficie inferior del inserto se fijaron en metanol pre-enfriamiento 100% durante 30 minutos, se tiñeron en 0,5% de cristal violeta durante 30 minutos, luego se enjuagaron en PBS y se sometieron a inspección microscópica. Las células se contaron bajo el microscopio en cinco campos aleatorios y la invasión y la migración relativa se interpretaron como el número medio de células ± desviación estándar por campo.
se prepararon Western blotting
proteínas totales y cuantificaron utilizando un ensayo de proteínas (método BCA, Thermo, EE.UU.). Las proteínas se fraccionaron por electroforesis en dodecilsulfato de sodio en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) transferidos a fluoruro de polivinilideno (PVDF) de la membrana, bloqueado en la leche en polvo al 5% a temperatura ambiente durante 1 hora y a inmunotinción con anticuerpos a 4 ° C durante la noche utilizando anti-SOX4 ( 1:1000, CST, EE.UU.), anti-N-cadherina (1:1000, CST, EE.UU.) y anti-e-cadherina (1:1000, CST, EE.UU.). Anti-GAPDH (1:5000, Sigma, EE.UU.) se utilizó como control de carga. Los resultados se visualizan a través de un sistema de detección de quimioluminiscencia (Pierce ECL sistema de detección por transferencia Western sustrato, Thermo, Pittsburgh, PA) y después se expone en el Sistema Molecular Imager ChemiDoc XRS (Bio-Rad, Hercules, CA).
Construcción de plásmidos
Predicción de sitios de unión de miR-204 se realizó utilizando el software TargetScan (http://www.targetscan.org). secuencia 3'-UTR de SOX4 que se predijo para interactuar con miR-204 o una secuencia mutante con los sitios diana predichos se insertaron en los sitios KpnI y SacI del promotor pGL3 vector (Invitrogen). Ellos fueron nombrados pGL3-SOX4 y pGL3-SOX4-mut. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos y se transfectaron con 100 ng de pGL3-SOX4 o pGL3-SOX4-mut, y miR-204 imita (50 nm) utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp, CA, EE.UU.). Hemos normalizado las diferencias en la eficacia de transfección por co-transfección de una luciferasa de Renilla vector pRL-SV40 (5 ng).
gen SOX4 se sintetizó (adquirido de Genscript, Piscataway, NJ) a la digestión restrictiva utilizando Mlu I y se subclonó plásmido pLV-GFP, y nombrado pLV-GFP-SOX4. lentivirus recombinante se genera a partir de células 293T usando precipitación con fosfato de calcio. líneas celulares SGC-7901 fueron transfectadas con lentivirus utilizando polibreno (8 ug /ml).
Las actividades de luciferasa análisis
Las células se cultivaron en placas de 24 pocillos y se transfectaron con 0,2 mg de cualquiera generalizada tipo o mutante plásmido pGL-SOX4 que contiene luciferasa de luciérnaga, junto con 0,01 g del vector pGL-SOX4 (Invitrogen) que contiene luciferasa de renilla y 1 g oligonucleótidos. La transfección se realizó usando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen). la actividad de luciferasa relativa se calculó 48 h después de la transfección de luciferasa por el reportero de ensayo dual (Promega). Todos los experimentos de transfección se llevaron a cabo por triplicado y se repitieron tres veces de forma independiente. Los datos se expresan como la media ± desviación estándar.
El análisis estadístico
t de Student o el análisis unidireccional de la varianza se utilizó para el análisis estadístico cuando sea apropiado. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS 17.0 (SPSS, Chicago, IL). Un valor de dos colas de P & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
miR-204 se forma aberrante el regulado en
H.. pylori positivos
tejidos y células
La expresión de miRNAs seleccionados de acuerdo a los datos de microarrays anteriores [10] se detectaron en 75 pares de H. pylori tejidos normales positivos y negativos, y 50 pares de H. pylori positivo y los tejidos tumorales negativos por PCR en tiempo real. Encontramos que el miR-204 fue uno de los más significativos miRNAs abajo reguladas tras la infección por H. pylori (Figura S1 A, Figura 1A, B). Además, el miR-204 se expresó en niveles inferiores de la gastritis más severa (Figura 1C). Asimismo, comparó su expresión en tejidos tumorales con los tejidos normales, independientemente del estado de H. pylori y encontramos que el miR-204 se expresó significativamente menor en los tumores (Figura S1B). Dividimos a los pacientes con tumor de acuerdo a los diferentes estadios TNM y pacientes T2-T4 y M1 expresado significativamente más bajos de miR-204 que los pacientes T1 y M0 (Figura S1C, S1D). También se examinó la expresión de miR-204 en células infectadas con H. pylori y se encontró que la expresión de miR-204 fue significativamente menor en múltiples H. pylori células que el control (Figura 1D, la figura S1E) infectados.
(a) Los niveles de expresión de miR-204 en los tejidos positivos H. Pylori humanos y tejidos normales en relación con U6 se determinaron mediante qRT-PCR. (B) Los niveles de expresión de miR-204 en H. pylori tejidos tumorales positivas y negativas. (C) Los niveles de expresión de miR-204 en CG, CAG y la displasia de H. pylori positivo tejidos y H. pylori negativo de tejido. (D) Los niveles de expresión de miR-204 en células infectadas por H. pylori. (* P & lt; 0,05).
miR-204 suprime la migración /invasión y proliferación de células de cáncer gástrico en el SGC-7901 y 45-MKN células
Estamos transfectadas SGC7901 y MKN45 células con hsa-miR-204 imitan los oligonucleótidos y /inhibidor examinado los efectos sobre la proliferación celular y la migración /invasión. En primer lugar, se realizó qRT-PCR para verificar la eficacia de la transfección, tal como se indica en la figura. 2A, la transfección de células con miR-204 imita /inhibidor mostró un aumento significativamente /disminución de la expresión de miR-204 en comparación con el control negativo (CN /INC). Wound ensayo de curación mostraron que la sobre expresión de miR-204 podría suprimir la migración de células, mientras que su caída indujo la migración celular, con una significativa brecha más cerca de control (Figura 2B). Consistentemente, ensayo de invasión de Matrigel también mostró que la sobre expresión de miR-204 atenúa la invasión de células, mientras que desmontables de que podría invertir el afecto (Figura 2C). También se realizó el ensayo de MTT y se encontró que la tasa de crecimiento de las células transfectadas con el inhibidor de miR-204 se incrementó significativamente en comparación con los controles, mientras que las células con miR-204 se mostraron imita el diferente (Figura 3A, B). También se examinó si el ciclo celular se vería afectada por la caída /sobre-expresión de miR-204 utilizando células activadas por fluorescencia (FACS) el análisis de las células teñidas con yoduro de propidio-. Desmontables de miR-204 dio lugar a un aumento significativo de los porcentajes de células en las fases G2 mientras que la sobre-expresión mostró el efecto opuesto (Figura 3C). ensayos de formación de colonias revelaron que la inhibición de miR-204 aumentó significativamente la tasa de crecimiento de líneas de células (Figura 3D). También comparamos las funciones celulares de la transfección con el miR-204 imita con mímica y la infección por H. pylori. Encontramos que el miR-204 imita podrían suprimir la migración celular, invasión y proliferación a infección por H. pylori (Figura S2). Estos resultados, junto mostraron que la baja regulación de miR-204 inducida por la infección por H. pylori promover la migración /invasión y proliferación de la línea celular de cáncer gástrico in vitro.
(A) miR-204 de nivel en las células transfectadas con miR-204 imita, inhibidor de miR-204, de control negativo (CN) y el inhibidor de control negativo (iNC). El resultado fue validado por PCR en tiempo real. (B) Las imágenes fotografiadas a 0 h (superiores) y 24 h (inferior) después de la herida se muestra con una ampliación de x200. C. Las células fueron tratadas con miR-204 imita, inhibidor de miR-204, Carolina del Norte e INC durante 24 h. Las imágenes representativas de las células invasoras en la parte inferior de la membrana se tiñeron con violeta cristal se visualizaron como se muestra. Las cuantificaciones de la migración celular se presentaron como el número de células migraron porcentuales. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se presentan como media ± desviación estándar. * Indica una diferencia significativa en comparación con el grupo control (P & lt; 0,05). Cada experimento independiente se realizó 3 veces.
Las células (A) transfectadas con el miR-204 inhibidor y se determinaron las viabilidades con CCK-8 ensayo. (B) Las células transfectadas con el miR-204 imita y se determinaron las viabilidades con CCK-8 ensayo. (c) Efectos de miR-204 imita o inhibidor sobre el ciclo celular de las células de cáncer gástrico mediante citometría de flujo. (D) ensayo de colonias después de las células transfectadas con el miR-204 imita y inhibidor. (* P & lt; 0,05).
miR-204 hasta reguladas expresión SOX4 en el cáncer gástrico
Se identificaron los objetivos de abajo de miR-204 por la predicción computacional para dilucidar los mecanismos por los el que el miR-204 suprime la invasión de células de cáncer gástrico. Entre cientos de genes predichos por el sitio web en línea de predicción de genes miARN objetivo (base estelar, http://starbase.sysu.edu.cn/), que forcused nuestra atención en SOX4. SOX4 había sido reportado para regular la progresión del cáncer gástrico y EMT o actuar como un objetivo funcional subyacente de miR-204. Para identificar la predicción, a través de QRT-PCR e inmunohistoquímica, se encontró que SOX4 fue hasta reguladas en H. pylori positivo tejidos. Su expresión también fue mayor en los CAG de CG en H. pylori positivo tejidos. (N = 75, p & lt; 0,05; Figura 4A-C), que fue inversamente correlacionada con miR-204. Utilizando el análisis de correlación de Pearson de la expresión del ARNm SOX4-miR-204, se obtuvo una correlación inversa estadísticamente significativa (Figura S3 A, R = -0,849, p = 0,002). El uso de inmunohistoquímica, también descubrimos que la expresión SOX4 se asoció significativamente con la histología gástrica (p & lt; 0,05; Tabla 1). In vitro, también se encontró que SOX4 ARNm y proteínas fueron hasta reguladas en células de cáncer gástrico infectados por H. pylori (Figura S3 B, S3C). a continuación, se determinó la expresión de SOX4 en respuesta a los cambios en la expresión de miR-204. Western blot y ensayos de QRT-PCR mostraron que la sobre expresión de miR-204 podría regular hacia abajo-significativamente el ARNm y la expresión de proteínas de SOX4, mientras que el efecto de la caída de miR-204 fue la opuesta (Figura 3D). También se encontró que la expresión de marcadores de EMT, N-cadherina y E-cadherina, también fue cambiado en relación con el miR-204 expresión (Figura 4E), lo que sugiere que el miR-204 podría afectar el proceso de EMT.
los niveles de mRNA de SOX4 en relación con GAPDH en H. pylori positivo tejidos humanos (a), incluyendo CG y CAG y los tejidos normales (B) fueron evaluados por QRT-PCR. Los datos se presentan como diagrama de dispersión de la mediana. * Significativamente diferente en comparación con la de control (P & lt; 0,05). (C) la expresión de proteínas en los tejidos SOX4 H. pylori positivos y negativos se detectó por tinción inmunohistoquímica. los niveles de proteína y SOX4 mRNA en las células transfectadas con el control negativo (CN), miR-204 imita (D); miR-204 inhibidor e INC se analizaron por Western Blot-y QRT-PCR. GAPDH se utilizó como control de carga. Los valores promedio de densidad óptica integrada (IOD) se evaluaron mediante el análisis de cinco campos por portaobjetos y se registran en el histograma. (E) E-cadherina y N-cadherina niveles de proteína en las células transfectadas con el control negativo (CN), miR-204 imita; miR-204 inhibidor e INC se analizaron por Western Blot-. GAPDH se utilizó como control de carga. Los datos se representan como media ± DE. * Indica P & lt;. 0,05
SOX4 es un gen diana directa de miR-204 en células de cáncer gástrico
Aunque SOX4 ha sido considerada como un objetivo directo de miR 204, no está claro si el miR-204 puede reconocer directamente la 3'-UTR del ARNm SOX4. De acuerdo con el sitio de destino predicho a partir de TargetScan, hemos clonado el fragmento 3'-UTR que contiene el sitio predicho en el vector indicador de luciferasa pGL3 (pGL3-SOX4). El fragmento 3'-UTR con secuencia mutada en el sitio de destino predicho también se clonó como un control (pGL3-SOX4-mut). Los resultados mostraron que la co-transfección con miR-204 imita y el vector pGL3-SOX4 disminución de la actividad luciferasa en células SGC-7901. Sin embargo, miR-204 imita no tenían el efecto sobre la actividad de la luciferasa cuando las células fueron transfectadas con vector pGL3-SOX4-mut (Figura 5). Estos datos sugieren que el gen SOX4 fue uno de los blancos directos de miR-204.
El sitio de unión de miR-204 potencial en el 3'-UTR del ARNm SOX4 se predijo computacionalmente por TargetScan. Las células fueron co-transfectadas con el miR-204 imita (o control negativo) con pGL3-SOX4 (o pGL3-SOX4-mut) vectores. La actividad de luciferasa se normalizó por la relación de señales de luciferasa de Renilla y luciérnaga. * Indica P & lt;. 0,05
La sobreexpresión de la SOX4 tiene el efecto de miR-204 en el cáncer gástrico células invasión
Para determinar SOX4 como el efector funcional de miR-204 en la invasión del cáncer gástrico, que SOX4 sobre-expresada mediante la transfección con lentivirus y examinó sus efectos en las células de cáncer gástrico. La sobreexpresión de la SOX4 en la línea celular fue confirmado por Western Blot (Figura 6A). También se encontró que la E-cadherina se redujo reguladas, mientras que la N-cadherina es regulada hasta después de la transfección PLV-SOX4. A través de la cicatrización de heridas y el ensayo de invasión Matrigel, entonces descubrimos que la sobre-expresión de SOX4 promovió significativamente la migración y la invasión de células (Figura 6B y 6C). Con el fin de demostrar además que miR-204 induce la pérdida de la proliferación y la invasión de células de cáncer gástrico SOX4 suprimido, las células fueron transfectadas con miR-204 imita y SOX4 sobre-expresión vector juntos y los resultados mostraron que la supresión de la migración, invasión y la proliferación de miR-204 fue atenuada (figura S4).
(a) SOX4, N-cadherina y expresión de la proteína e-cadherina se analizaron por Western Blot en las células mediante transfección con lentivirus, plásmido de control, y Mock. GADPH se muestra como control interno. (B) de la herida ensayo de estas imágenes de curación a 0 h (superior) y 24 h (inferior) después de la herida se muestra con una ampliación de x200. (C) SOX4 sobre-expresados y grupos NC se tiñeron respectivamente. Las imágenes representativas de las células invasoras en la parte inferior de la membrana se tiñeron con violeta cristal se visualizaron como se muestra. Las cuantificaciones de la migración celular se presentaron como el número de células migraron porcentuales. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se presentan como media ± desviación estándar. * Indica una diferencia significativa en comparación con el grupo control (P & lt; 0,05). Cada experimento independiente se realizó 3 veces.
Discusión
El cáncer gástrico es una enfermedad de distribución mundial con una alta incidencia, especialmente en el sudeste de Asia [21]. La tasa de supervivencia a 5 años para el cáncer gástrico es bastante baja. Algunos de los pacientes con cáncer gástrico eran H. pylori relacionada. Por lo tanto, es necesario investigar a fondo la patogénesis y el desarrollo de nuevos tratamientos dirigidos presencia de H. pylori relacionada con el cáncer gástrico.
MiRNAs son una gran familia de genes reguladores que regulan negativamente sus ARNm diana en una secuencia específica. miRNAs pueden funcionar también como supresores de tumores u oncogenes [22]. La evidencia reciente sugiere que miRNAs juegan papeles esenciales en múltiples procesos biológicos relacionados con el cáncer, incluyendo la diferenciación celular, la proliferación, tumorignesis, la angiogénesis, la invasión y la metástasis [23]. MiR-204 se ha descrito que funcionar como un supresor de tumores y la expresión de bajo nivel de miR-204 se asocia con un pobre fenotipo pronóstico en pacientes con cáncer [24], [25]. Sin embargo, había pocos estudios que investigaron la función de miR-204 en el H. pylori relacionados con el cáncer gástrico. Aquí, hemos sido los primeros en presentar evidencia de que el miR-204 fue significativamente las reguladas en H. pylori positivo tejidos (tejidos normales y tumorales) y que la sobre expresión de miR-204 expresión de la proteína SOX4 suprimido y el crecimiento de las células derivadas de tumor gástrico.
en primer lugar, cuantificó la expresión de miR-204 en los tejidos y los controles de infección por H. pylori y se encontró que la expresión de miR-204 es significativamente menor en los pacientes infectados por H. pylori. También se encontró que la expresión se relaciona con la histología de los pacientes, es decir, la expresión de miR-204 es significativamente menor en los pacientes positivos para H. pylori con gastritis atrófica crónica de la gastritis no atrófica crónica. Este patrón de expresión mostró que la posibilidad de que miR-204 se relaciona con los diferentes tipos de gastritis y la más severos los pacientes eran, menor es la expresión de miR-204 estaba. Con base en el nivel de expresión de miR-204, elegimos células MKN45 SGC-7901 y de la posterior ganancia de función y los estudios de pérdida de función, respectivamente. Los resultados sugieren que la baja regulación de miR-204 en células de cáncer gástrico se relaciona con su progresión. Aunque se ha informado de un gran número de miRNAs humanos, muchos de sus objetivos de mRNA permanecen sin identificar [9]. En este estudio, se utilizó una combinación de la bioinformática y enfoque experimental para identificar que SOX4 son la diana en el sentido funcional de miR-204.
SOX4 se sobreexpresa en varios tipos de cáncer y estaba estrechamente correlacionada con la invasión tumoral y la metástasis [ ,,,0],16] - [19]. También es uno de los miembros de inductores EMT-transcripcional [26]. EMT es un programa de desarrollo clave que a menudo se activa durante la progresión del cáncer y puede promover la resistencia a la terapia [27]. Zhang et al [20] mostró que la sobreexpresión de SOX4 en las células epiteliales mamarias humanas condujo a la adquisición de rasgos mesenquimales, y la migración celular y la invasión mejorada. Además, SOX4 regula positivamente la expresión de inductores EMT conocidos y se activa la ruta de TGF-β para contribuir a EMT [28]. Hasta la fecha, EMT es un objetivo atractivo para las intervenciones terapéuticas, proporciona una nueva base de la progresión del carcinoma hacia estados malignos indiferenciadas y más [29]. En primer lugar, nuestro estudio mostró que la infección por H. pylori induce miR-204 en la regulación podría conducir a cáncer gástrico en un proceso de EMT.
Para concluir, nuestra evidencia indica que el miR-204 se redujo reguladas, mientras que SOX4 era ascendente regulado en la infección por H. pylori y cáncer gástrico. Ectópico expresión de miR-204 disminuyó la expresión SOX4 en los niveles de ARNm y proteína en la línea celular de cáncer gástrico. Se demostró además que el miR-204 se une directamente a la 3'-UTR de SOX4. la expresión de miR-204 inhibe la EMT a través de la represión de SOX4. Por otra parte, la vía de miR-204-EMT que hemos identificado puede ser explotada en un enfoque terapéutico para el tratamiento de H. pylori cánceres relacionados.
Apoyo a la Información
Figura S1. gratis (A) La expresión de miRNAs en 5 H pylori tejidos positivos y negativos se detectó mediante qRT-PCR. (B) Los niveles de expresión de miR-204 en los tejidos tumorales y control. (C) Los niveles de expresión de miR-204 de acuerdo con estadios TNM. (D) El nivel de expresión de miR-204 en tres tipos de H. pylori células infectadas. (* P & lt; 0,05)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0101457.s001 gratis (TIF)
figura S2.
Las células transfectadas con el miR-204 imita e imita con infección por H. pylori y viabilidades (A) se determinaron con CCK-8 de ensayo (B) Las imágenes fotografiadas a 0 h (superiores) y 24 h (inferior) después de la herida se muestra con una ampliación de x200 (C) las imágenes representativas de las células invasoras en la parte inferior de la membrana se tiñeron con violeta cristal se visualizaron como se muestra. (* P & lt; 0,05)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0101457.s002 gratis (TIF)
Figura S3. gratis (A) La expresión de mRNA relativa de miR-204 y SOX4, normalizada con U6 y GAPDH, se evaluó en 15 especímenes de H. pylori tejidos positivos y negativos de QRT-PCR. (B) una correlación inversa de SOX4 y miR-204 niveles de expresión fue examinado (R = -0,920, p = 0,001). (C) La expresión de ARNm SOX4 se determinó mediante qRT-PCR en H. pylori células infectadas. (D) La expresión del nivel de proteína SOX4 se determinó por Western blot en H. pylori células infectadas. (* P & lt; 0,05)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0101457.s003 gratis (TIF)
figura S4.
Las células transfectadas con miR-204 imita e imita con viabilidades (A) PLV-SOX4 y se determinaron con CCK-8 de ensayo (B) Las imágenes representativas de las células invasoras en la parte inferior de la membrana se tiñeron con violeta cristal se visualizaron como mostrado. (C) Las imágenes fotografiadas a 0 h (superiores) y 24 h (inferior) después de la herida se muestra con una ampliación de x200 (* p & lt; 0,05)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0101457.s004
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