Extracto
Antecedentes
regiones diferencialmente metilado (DMR) están asociados con muchos genes impresos. En los ratones metilación en un DMR aguas arriba de la
H19
gen conocido como la región de Control de Impresión (IC1) se adquiere en la línea germinal masculina e influye en el estado de metilación de DMR 100 kb de distancia en el factor de crecimiento similar a la insulina adyacentes 2 (
Igf2)
génica a través de interacciones de largo alcance. En los seres humanos, de la línea germinal-deriva o post-zygotically adquirió imprinting defectos en IC1 están asociados con la activación aberrante o represión de
IGF2
, lo que resulta en los trastornos del crecimiento congénitas de Beckwith-Wiedemann (BWS) y Silver-Russell (SRS) síndromes, respectivamente. En el tumor de Wilms y el cáncer colorrectal, la expresión bialélico de
IGF2
se ha observado en asociación con la pérdida de metilación en un DMR in
IGF2.
Esta DMR, conocido como DMR0, se ha demostrado que es metilado en el silencio de la madre
IGF2
alelo presumiblemente con un papel en la represión. El efecto de
IGF2
cambios en la metilación DMR0 en la etiología de SBW o SRS es desconocido.
Los resultados Metodología /Principales
Se analizó el estado de metilación de la DMR0 en BWS, pacientes con tumor de Wilms SRS y por secuenciación de bisulfito convencional y pirosecuenciación. Mostramos aquí que, contrariamente a los informes anteriores, el
IGF2
DMR0 es en realidad metilado en el alelo paterno activo en la sangre periférica y el riñón. Esto es similar al estado de metilación IC1 y es incompatible con la función de silenciamiento de la propuesta materna
IGF2
alelo. De Beckwith-Wiedemann y Silver-Russell pacientes con defectos de metilación IC1 tienen defectos de metilación similares en el
IGF2
DMR0, en consonancia con la regulación de metilación IC1 a
IGF2 Hoteles en
cis
. En el tumor de Wilms, sin embargo, los perfiles de metilación de IC1 y
IGF2
DMR0 son indicativos de cambios en la metilación que ocurren en ambos alelos de los padres en lugar de en
cis
.
Conclusiones /Importancia
Estos resultados apoyan un modelo en el que DMR0 y IC1 tienen susceptibilidades opuestos a hiper hipometilación global y durante la tumorigénesis independiente de la matriz de impronta origen. Por el contrario, durante la embriogénesis DMR0 es metilado o desmetilado de acuerdo con la huella de la línea germinal metilación en el IC1, indicando diferentes mecanismos de pérdida de impronta en células neoplásicas y no neoplásicas
Visto:. Murrell A, Ito Y, Verde G , Huddleston J, K Woodfine, Silengo MC, et al. (2008) Distintos cambios en la metilación en el
IGF-2-H19
Locus en trastornos del crecimiento congénitas y cáncer. PLoS ONE 3 (3): e1849. doi: 10.1371 /journal.pone.0001849
Editor: Suzannah Rutherford, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Estados Unidos de América
Recibido: 14 Diciembre, 2007; Aceptado 19 de febrero de 2008; Publicado: 26 Marzo 2008
Derechos de Autor © 2008 Murrell et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por CRUK senior Research Fellowship cáncer (AM) y Società Italiana di Cancerología y la beca Fundación Pezcoller (FC) y subvenciones de AICR (AM), MIUR PRIN 2005 (AR), Istituto Superiore di Sanità (AR), Associazione Italiana Ricerca sul cancro (AR y DP), Teletón-Italia subvención No. GGP04072 (AR), y la Associazione Bianca Garavaglia, Busto Arsizio, Varese, Italia (DP)
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no compiten existen intereses.
Introducción
impronta aberrante del factor de crecimiento similar a la insulina 2 (
IGF2
) gen juega un papel en la patogénesis de la enfermedad sobrecrecimiento síndrome de Beckwith-Wiedemann (BWS, OMIM#130650), la condición de crecimiento de restricción síndrome de Silver-Russell (SRS, OMIM#180860), así como varios tipos de cáncer humanos incluyendo el tumor de Wilms, rabdomiosarcoma, hepatoblastoma, colorrectal y de carcinomas de mama [1] - [6] .
los modelos de ratones se han utilizado para demostrar que la expresión de la impresa estrechamente vinculada
Igf2
y
H19
genes está controlada por determinadas regiones diferencialmente metilado (DMR) [7 ] - [10]. Uno de estos DMR (el
H19
DMR) está situado a 5 'de la
H19
promotor está metilado en el cromosoma paterno y se conoce como la región de control del IC1 impresión debido a que funciona como un aislante mediada por el factor de unión CCCTC (CTCF) [11] - [14]. Supresión de los resultados IC1 maternas en la activación de la materna normalmente silenciosa
Igf2
alelo y en la baja regulación de
H19
[9]. Además, existe como una relación jerárquica entre la metilación en IC1 y
Igf2
que la deleción o mutación en el IC1 también resulta en cambios en la metilación en DMR dentro del
Igf2
de genes [15]. Hemos demostrado previamente que IC1 realidad interactúa con
Igf2
DMR en un mutuamente excluyentes y los padres de manera específica origen influenciado por la unión CTCF y la metilación del ADN [16], [17]. La aplicación de este modelo a la humana se ha visto obstaculizada por las diferencias en la organización genómica de
IGF2
DMR en ratones y humanos. En concreto,
IGF2
DMR0, situado a 5 'de la principal
IGF2
promotores está metilado en el alelo materno sólo en placentas en el ratón [18], pero tiene la metilación diferencial en todos los tejidos en seres humanos [19]. La metilación del DMR0 en la materna
IGF2
alelo se infiere el uso de líneas celulares derivadas de un paciente con BWS disomía uniparental paternal en loci 11p15.5 (UPD) [19] y en los pacientes renales Wilms tumor con la pérdida de heterozigosidad del alelo materno [20]. El análisis de metilación de la
IGF2
DMR0 se ha realizado en muchos estudios de cáncer después de la demostración de que la hipometilación de este DMR se asocia con la pérdida de impresión en Wilms tumor [20] y el cáncer de colon [21]. La actual interpretación de estos resultados es que la pérdida de metilación en el
IGF2
DMR0 juega un papel en la reactivación del alelo materno en silencio [21].
La base molecular de BWS es heterogénea, con 5 % de pacientes que muestran el aumento de la metilación en IC1 con la activación bialélico de
IGF2
y el silenciamiento bialélico de
H19.
Otro grupo de pacientes tiene BWS metilación IC1 normal, pero la metilación anormal en IC2, una vía materna metilado imprinting región de control dentro de la
KCNQ1
y
Kcnq1ot1
grupo de genes que parece operar independiente de
IGF2
y
H19
[2]. BWS pacientes con defectos IC1 tienen una particularmente alta predisposición a desarrollar un tumor de Wilms, mientras que los pacientes con defectos IC2 son aparentemente más en riesgo de otros tumores [2], [22]. La hipermetilación en el IC1 es también una característica frecuente en los pacientes con tumor de Wilms no sindrómica que junto con los perfiles de predisposición tumoral distintos en pacientes BWS sugieren que los defectos epigenéticos similares conducen al crecimiento excesivo de todo el soma y el cáncer. SRS también tiene una etiología molecular compleja y heterogénea y un subconjunto de individuos tiene pérdida de metilación en IC1 con silenciamiento bialélico de
IGF2
y activación bialélico de
H19
[6].
hasta la fecha no ha habido informes sobre el estado de metilación de la
IGF2
región DMR0 en pacientes BWS y el SRS y no se sabe en qué medida la función de silenciamiento de esta propuesta DMR contribuye a la etiología de BWS y SRS. tanto, nuestro estudio matriz de metilación origen en el DMR0 en diversos subtipos de pacientes BWS y SRS y también en una cohorte de muestras de tumor de Wilms. Nuestros resultados indican que la paterna activa
IGF2
alelo está metilado en el DMR0 en
cis
con
H19
metilación en individuos normales y que en SRS y el BWS DMR0 y IC1 tener anormalidades de metilación similares. En contraste, en las muestras de tumor de Wilms DMR0 metilación se correlaciona negativamente con la metilación IC1. Estos resultados implican
IGF2 imprinting
defectos en los trastornos del crecimiento congénitas y tumores de Wilms surgen a través de diferentes mecanismos epigenéticos.
Resultados
IGF2 DMR0 estado de metilación en pacientes BWS y SRS
Se examinó el estado de metilación de DMR0 en el ADN de leucocitos de sangre periférica procedentes de pacientes BWS con hipermetilación IC1 (n = 7), hipometilación IC2 (n = 37) o la metilación normal en tanto IC1 e IC2 (n = 27) y SRS pacientes con hipometilación IC1 (n = 2), utilizando el análisis de bisulfito y pirosecuenciación. La región analizada se muestra en la figura 1A. Para nuestra sorpresa, 6/7 pacientes con BWS hipermetilación en IC1 también tenían hipermetilación en DMR0 (metilación La mediana de 69,2%, rango intercuartil (IQR) 60,5%; 75,1%) y 2/2 SRS con hipometilación IC1 también tenía DMR0 hipometilación (28,2% y 36,28%). Los pacientes con metilación normal en IC1 o IC2 en hipometilación tenían niveles de metilación normales en DMR0 (metilación mediana de 53%; IQR 48,2%, 57,1%). Estos resultados sugieren que, o bien los cambios de metilación en BWS y SRS se estaban produciendo en
trans
o que la metilación en el DMR0 está en el alelo paterno.
A. Localización de DMR0 dentro de la
gen IGF2
relación a la región de control IC1 impronta paterna metilado que está aguas arriba de
se utilizó H19.
Pirosecuenciación para analizar la metilación en seis CpG dentro de la región DMR0 (NCBI 36 : 11, 2125904 hasta 2126160, que contiene rs3741210 SNP). Bisulfito (BSQ) y pirosecuenciación (PSQ) Primer posiciones son como se indica. Esta región contiene las GPC (numerada 15,16,17) marcados en gris que han sido previamente publicados para ser hypomethylated en el cáncer colorrectal [21]. Las líneas verticales indican
Msp
/
Hpa II
sitios en la DMR0. B. Diagrama de cajas que muestra la mediana, los RIC, máx. y min. valores para
IGF2
los niveles de metilación DMR0 medida por pirosecuenciación de ADN convertida bisulfito obtenido a partir de muestras de sangre periférica de pacientes con BWS y SRS. porcentajes de metilación reflejan la proporción de citosinas convertidas bisulfito en las GPC medidos en el ensayo. los niveles de metilación normales para DMR impresos son 45-55% (véase C). BWS categorías de pacientes incluyen aquellos con: ningún defecto de impronta en la región IC1 e IC2 la región (NM); bajo la metilación (LM) en el IC2 (IC2-LM); aumento paterna 11p15 través de la duplicación paterno o disomía uniparental (pUPD); y la hipermetilación en IC1 (IC1-HM). SRS pacientes incluidos dos de cada uno de duplicación maternal de 11p15 (Mat DUP) y hipometilación en IC1 (IC1-LM). BWS con hipermetilación en el IC1, también tienen la hipermetilación en DMR0, mientras que SRS con IC1 hipometilación tiene hipometilación en DMR0. C. El padre de origen específica de metilación en condiciones normales, y los pacientes BWS SRS. Los pacientes BWS y SRS han imprinting defectos en IC1. Bisulfito convierte ADN se amplificó con los cebadores específicos de alelos para el polimorfismo rs3741210 en
IGF2
DMR0 antes de pirosecuenciación para la metilación. El alelo T se muestra mediante cuadrados y alelos C se muestran mediante triángulos en las parcelas. Los círculos muestran el porcentaje de metilación total de las GPC ensayadas. El alelo paterno es más metilado en DMR0 que el alelo materno. Ambos alelos están hypermethylated en BWS y ambos alelos están en hypomethylated SRS.
Para distinguir entre estas posibilidades, se examinaron 13 pacientes con BWS exceso de copias del cromosoma 11p15.5 paterna (12 pacientes tenían paterna UPD y uno paciente tenía una duplicación 11p15.5) y dos pacientes con SRS duplicaciones 11p15.5 maternas. También se determinó directamente el origen parental de la metilación en el
IGF2
DMR0 en algunos de nuestros pacientes y BWS SRS y 6 individuos de control con el fin de confirmar nuestros hallazgos. Los pacientes con la duplicación materna habían reducido los niveles de metilación (44%), mientras que todo el paternal UPD y de los pacientes de duplicación paternos tenían hipermetilación ((metilación mediana de 60,2%; IQR 56,1%, 64,3%), la figura 1B.). En todas las familias informativas pudimos confirmar que el alelo paterno fue metilado preferentemente en la DMR0 (en particular las GPC 15-17) en
cis
con la metilación en el IC1 (Fig. 1C y Fig. S1). Por tanto, estos resultados sugieren que la metilación en la metilación influencias IC1 en el
IGF2
DMR0. BWS casos y SRS con defectos de metilación en el IC1 adquieren el mismo defecto de metilación en el DMR0 en la línea germinal o el desarrollo temprano del feto tal que la materna
IGF2
ganancias alelo metilación y se activa (BWS) o el alelo paterno falla para convertirse en metilado y es silenciado (SRS). Estos cambios de metilación específicos de alelo tienen el efecto de un interruptor de pie de imprenta de modo que ambos alelos parecen ya sea un alelo paterno (BWS) o un alelo materno (SRS). pirosecuenciación resultados se verificaron mediante secuenciación de bisulfito (Fig. S1).
Análisis de metilación IGF-2 en muestras tumorales de Wilms
Se analizaron DMR0 metilación en dos pacientes con tumor de Wilms que había surgido en los individuos afectados por BWS y una serie de pacientes con tumor de Wilms no sindrómicas. Uno de los pacientes tenía BWS hipermetilación constitucional en IC1, el otro tenía UPD paterna. Los no sindrómicas pacientes el tumor de Wilms compuesto de individuos que tenían hipermetilación IC1 específico de tumor (n = 10), LOH 11p15.5 con la pérdida del alelo materno (n = 13) o la metilación normal (n = 10) en el IC1. Sorprendentemente, todos los tumores con hipermetilación en IC1 y la mayoría de las personas con LOH, incluyendo aquellos surgido en los individuos afectados por BWS, demostraron una reducción de la metilación en DMR0 (metilación La mediana de 24,8%, IQR 16,52, 34,9), mientras que aquellos con metilación normal tuvo IC1 metilación DMR0 normal (mediana de metilación 45,1%, IQR 34,2; 52,3) (figura 2A-B.). En efecto, una correlación inversa significativa (Pearson r = 0,7118; IC -8718-0,4146) pudo demostrarse entre DMR0 y los niveles de metilación en IC1 paciente con un tumor de Wilms (Fig. 2C). Al igual que en los leucocitos de sangre, tejido no tumoral adyacente mostró metilación predominante del alelo paterno (Fig. 2D y datos no presentados). Estos resultados muestran cambios epigenéticos distintas en el tumor de Wilms en comparación con los trastornos del crecimiento congénitas.
Diagrama de cajas que muestra la mediana, los RIC, max. y min. valores para
IGF2
los niveles de metilación DMR0 medida por pirosecuenciación de sangre periférica (caja abierta), renal normal (recuadro rayado) y las biopsias de tumores (caja gris) de los pacientes del tumor de Wilms que no cuentan con BWS. porcentajes de metilación reflejan la proporción de citosinas convertidas bisulfito en las GPC medidos en el ensayo. los niveles de metilación normales para DMR impresos son 45-55% (véase D.). muestras de pacientes Wilms tumor incluyen sangre periférica y ADN tumoral de pacientes con metilación normal en IC1 en sus tumores (NM); sangre periférica, riñón y de ADN tumor normales muestras de pacientes con la hipometilación del IC1 en sus tumores (IC1-HM); y muestras de ADN tumoral de pacientes con pérdida de heterocigosidad (LOH) en sus tumores. Sorprendentemente, los pacientes con tumor de Wilms hipermetilación en IC1 tienen hipometilación en DMR0 en sus tumores. los niveles de metilación B en sangre periférica, tejido del riñón afectado y el tejido renal tumor de Wilms de dos pacientes (uno con BWS hipermetilación IC1 y uno con pUPD). Ambos pacientes tienen hipometilación de
IGF2
DMR0 en sus tumores. curva de regresión lineal C que muestra la relación inversa entre los niveles de metilación en el IC1 y DMR0 de tumor de Wilms. Los tumores con hipermetilación en el IC1 tienen pérdida de metilación en DMR0. D. La sangre periférica y tejido renal de un paciente con tumor de Wilms que no tiene hipermetilación en IC1. El alelo C se hypermethylated, mientras que el alelo T se hypomethylated tanto en la sangre y los riñones, lo que indica matriz similar de metilación origen en estos tejidos.
Discusión
Los resultados de nuestros estudios genéticos demuestran que DMR0 está metilado en el alelo paterno que contradice las conclusiones de dos estudios previos que han informado de que la metilación es DMR0 en el alelo materno [19], [20]. En el primer informe de metilación fue investigado por la totalidad de
IGF2
de genes en muestras de tumor de Wilms con y sin pérdida de impresión [20]. En este estudio, la metilación diferencial en la región DMR0 se muestra en riñón normal y en tumores con expresión monoallelic, mientras que los tumores con pérdida de impresión, se hypomethylated [20]. Las GPC que hemos analizado en nuestros ensayos de metilación fueron también examinadas por estos autores utilizando
Msp
/Hpa II
análisis de restricción (Figura 1) y la región es atravesado por la sonda 9 en las figuras 1 y 3 en [20]. En cuatro casos con pérdida de heterozigosidad de 11p15.5 donde se perdió el alelo materno, se encontró el alelo paterno retenido ser no metilado y por lo tanto el alelo materno se infiere que el alelo normalmente metilado [20]. Se examinaron 13 casos con LOH y mostraron patrones similares hipometiladores, lo que sugiere que las células con LOH se inclinan a cambios en la metilación en el DMR0 como resultado de haber sido tumores. El segundo estudio que informó de que la madre es DMR0 metilados nuevos caracterizado transcripciones de
IGF2
durante el desarrollo. Estos autores examinaron una línea celular establecida de paciente pUPD y encontraron que el DMR0 se hypomethylated [19]. Hemos encontrado que DMR0 tiende a ser desmetilado en líneas celulares de hibridoma con un solo cromosoma humano 11, independientemente de su origen parental (observación no publicada) y asumir que este puede ser un fenómeno de cultivo celular.
La función de DMR0 es aún desconocido. Se ha postulado que el papel de la metilación DMR0 es mantener el silenciamiento en la materna
IGF2
alelo. Sin embargo, el conocimiento de que el origen parental de
IGF2
DMR0 metilación es paterna elimina un papel en la represión de metilación mediada por la materna
IGF2
alelo. De hecho en lugar de actuar como un regulador autónomo de la impronta, nuestros resultados sugieren que la metilación DMR0 está influenciada por metilación IC1 en células no neoplásicas. Así, durante la embriogénesis, los padres de los patrones de metilación específicos de origen humano en el
IGF2 CD -.
H19
locus se estableció en
cis
similares a lo observado en ratones [15]
en los ratones que se han mutado sitios CTCF, la exclusión de CTCF del IC1 materna ha resultado en metilación del IC1 [23] y
Igf2
DMR [16]. Además, en adultos plexo coroideo ratón, un tejido cerebral en la que
Igf2
se expresa de ambos alelos y
H19
no se expresa, IC1 y la
Igf2
DMR están metiladas en ambos cromosomas parentales [24]. Hemos demostrado que la ganancia o pérdida de metilación aberrante en el IC1 está acoplado al mismo cambio metilación en
IGF2
DMR0. La principal diferencia es que los ratones tienen una DMR1 y un DMR0 específica placenta, mientras que en los seres humanos, DMR1 falta y de la DMR0 parece comportarse más similar a la del ratón DMR1. El efecto final de IC1 influir
IGF2
metilación es que epimutation de IC1 tiene la consecuencia de ambos alelos de los padres que muestran una impronta paterna en el caso de BWS o una impronta materna en el caso de SRS (Fig. 3).
En individuos normales,
IGF2
expresión es a partir del alelo paterno y
H19
es del alelo materno. IC1 y DMR0 están metiladas en el cromosoma paterno. En BWS, el patrón epigenotipo y expresión del cromosoma materno se convierte en paterna y en SRS, el patrón epigenotipo y expresión del cromosoma paterno se convierten a la madre (conmutación huella). En el tumor de Wilms,
IGF2
activación y
H19
silenciamiento están asociados con la interrupción de las dos huellas maternos y paternos (pérdida de la impronta somática).
Si a largo Categoría estándar interacciones entre los DMR en este locus son similares en ratones y seres humanos, esto explicaría los defectos de impronta que se encuentran en los trastornos del crecimiento excesivo del BWS y SRS. Sin embargo, los defectos de impronta en el tumor de Wilms siguen siendo difíciles de conciliar con los modelos de competencia y promotor de interacción DMR de largo alcance. En nuestro análisis de este grupo seleccionado de pacientes con tumor de Wilms, la metilación en el DMR0 se pierde en el alelo paterno, mientras que las ganancias IC1 metilación en el alelo materno. los niveles de metilación DMR0 son particularmente bajas en algunos de los tumores, lo que indica una erradicación casi completa de la metilación en este sitio probablemente de ambos alelos (Fig. 2A-C). reprogramación epigenética ocurre así en ambos cromosomas parentales en lugar de en
cis
, lo que indica que los diferentes mecanismos de control
IGF2
imprinting en células neoplásicas y no neoplásicas (Fig. 3). -Soma amplia hipermetilación IC1 en BWS predispone a un tumor de Wilms y cambios epigenéticos similar ocurre en el riñón como eventos pre-neoplásicas en Wilms tumorigénesis [25]. Es posible que DMR0 hipometilación se asocia con una activación más sostenida de
IGF2
en las células tumorales como resultado de la conformación de la cromatina alto nivel alternativa promovida por activadores específicos del tumor.
Durante la tumorigénesis hipometilación mundial ocurre en las regiones ricas de la repetición, la línea y elementos SINE, mientras que las islas CpG relacionados con los promotores están sujetos a la hipermetilación [26]. DMR metilados en la línea germinal y DMR metilados en las células somáticas pueden diferir en su capacidad para ser reprogramados durante la tumorigénesis. Además la comparación de diferentes DMR en términos de la línea germinal y somática frente a la madre frente paternalmente metilados, así como las características genéticas y epigenéticas deberían conducir a una comprensión más profunda de la reprogramación epigenética en el cáncer. Antes de nuestros estudios, la pérdida de metilación es el único epimutation descrito en el DMR0 en tipos de cáncer, mientras que tanto la hiper y la hipometilación se ha descrito en el IC1 [21], [27]. Por otra parte, no todos los informes muestran una correlación directa entre el
IGF2
expresión y cambios en la metilación DMR0 en este locus y nos han informado de excepciones en el cáncer de mama (Ito
et al.
Presentado), mientras que otros tienen excepciones reportadas en cáncer de ovario y vejiga [28], [29]. Los estudios que muestran una relación entre la pérdida de DMR0 metilación y la pérdida de impresión necesitan ser reinterpretados porque la metilación en la región DMR0 se pierde de la paterna activa alelo en lugar de a partir del alelo silencioso.
En resumen, mostramos tres eventos diferentes de reprogramación que se producen en el
IGF-2-H19
locus y se asocia con la pérdida de la impronta en BWS, SRS y el tumor de Wilms. En los trastornos del crecimiento, los cambios de metilación específicos de alelo de la línea germinal tienen el efecto de un interruptor de pie de imprenta de modo que ambos alelos parecen ya sea un alelo paterno (BWS) o un alelo materno (SRS), mientras que en el cáncer tanto parentales marcas se pierden y reprogramarla. Nuestros resultados demuestran que la pérdida de
IGF2 imprinting
es un fenómeno complejo que se produce con diferentes mecanismos en las enfermedades humanas, lo que probablemente refleja diferentes causas moleculares y respuestas.
Materiales y Métodos
los sujetos
85 BWS y 3 casos SRS fueron reclutados de diferentes departamentos de pediatría italianos y fueron clínicamente diagnosticados de acuerdo con los criterios descritos en la literatura (http://www.geneclinics.org). El estudio también participaron 40 pacientes del tumor de Wilms matriculados por las Unidades de Oncología Pediátrica afiliadas a la Asociación Italiana Ematologia Oncologia Pediatrica (AIEOP). Todos los tumores fueron diagnosticados histológicamente.
aprobación ética
Este estudio fue aprobado por los comités éticos de la Segunda Universidad de Nápoles y el Istituto Nazionale Tumori, INT, Milán.
Identificación de IC1 y IC2 metilación, UPD, LOH y copiar anormalidades número
La metilación del ADN en IC1 e IC2 se analizó por transferencia Southern con enzimas de restricción sensibles a la metilación o COBRA, como se describe [2]. microdeleciones tres muestras con hipermetilación IC1 derivadas de pacientes BWS también habían heredado [30], [31]. UPD, LOH y la duplicación 11p15.5 en loci se determinaron mediante análisis de microsatélites, tal como se describe [32].
Los análisis de metilación DMR0
Se diseñó un ensayo de pirosecuenciación estándar para
IGF-2
región DMR0 (NCBI36: 11,2125904-2126160) que incluía seis CpG, tres de los cuales se había informado anteriormente que se hypomethylated en pacientes con cáncer colorrectal con LOI a
IGF2
[21]. Los CpG dentro de esta región se incluyen en la región DMR0 analizado por otros [19], [20]. 100 ng-2 ug de ADN genómico por muestra se trató de bisulfito usando EZ kit metilación del ADN (Zymo Research). Bisulfito de ADN tratado se utilizó para generar plantillas de PCR amplificados por pirosecuenciación usando el siguiente cebador directo: 5'TGAGGATGGGTTTTTGTTTGGTAT3 'y biotina 5'TCCTCAATCCACCCAAAATAATAT3 cebador inverso'. 10 uL del producto de PCR biotinilado se utiliza para cada ensayo de secuenciación utilizando los siguientes cebadores de secuenciación 5'GGGGTGGAGGGTGTA 3 'y 5'-AAAAGTTATTGGATATATAGT 3'. Pirosecuenciación se realizó en PSQ SA 96 Sistema PyroMark MD del sistema y usando el reactivo de oro Pyro kits (Biotage, Uppsala, Suecia). pirosecuenciación específica de alelo se llevó a cabo mediante la sustitución del cebador biotinilado anteriormente con cebadores biotinilados específicos de alelo, 5'CCCAAAATAATATCTATAAAAAAAAAATTCAC3 ', o 5'CCCAAAATAATATCTATAAAAAAAAAATTCAT3' que se reconoció la G o alelo A del polimorfismo rs3741210 en la hebra inversa después de la conversión de bisulfito.
la metilación se cuantificó usando Pyro Q-CpG Software (Biotage, Uppsala, Suecia) que calcula la proporción de C convertida de (T) a de no convertidos C en cada CpG y expresa como un porcentaje de metilación. metilación promedio en todo el DMR0 de los 6 CpG se calcularon. La mediana de metilación y la RIC para diferentes categorías de pacientes fueron analizados utilizando el software GraphPad Prism.
Hemos verificado la metilación específica de alelos por secuenciación de bisulfito convencional de productos de PCR clonados en todos nuestros casos informativos.
Información de Apoyo
Figura S1. secuenciación
Bisulfito análisis de IGF2 DMR0 metilación en los trastornos de crecimiento normales, congénitas y tumor de Wilms. IGF2 DMR0 metilación en los trastornos de crecimiento normales, congénitas y tumor de Wilms. La metilación de CpG 6 se determinó mediante secuenciación genómica de bisulfito de ADN extraído de leucocitos de sangre periférica (Normal, BWS y SRS) o tejido tumoral (tumor de Wilms) de los individuos informativos para el polimorfismo rs3741210. Los círculos negros representan los CpG metilados y no metilados círculos abiertos GPC. El materna (MAT) y paterno (PAT) alelos de la región IGF2 DMR0 se indican
doi:. 10.1371 /journal.pone.0001849.s001 gratis (1.33 MB TIF) guía
agradecemos la contribución del Comité Científico AIEOP tumor de Wilms y todos los pacientes y sus familias por su participación en este estudio.