Extracto
La activación constitutiva de quinasas favor de la supervivencia se ha convertido en un objetivo prometedor de moléculas pequeñas con un creciente interés en el desarrollo de múltiples agentes -targeted. Los mecanismos que subyacen a la capacidad de respuesta a la mayoría de los agentes de la orientación específica de cáncer de las vías de supervivencia son aún poco conocidos pero crítico para su aplicación clínica. En este estudio, se encontró que sunitinib, un inhibidor de molécula pequeña de múltiples tirosina quinasas incluyendo VEGFR y PDGFR induce la apoptosis e inhibe el crecimiento celular en células de cáncer de colon en cultivos celulares y modelos de xenoinjerto a través de la BH3-única proteína PUMA. El tratamiento con sunitinib indujo
PUMA
transcripción a través del eje AKT /FoxO3a. PUMA, miméticos BH3, o 5-Flurourical sensibilizan las células de cáncer de colon a la apoptosis inducida por sunitinib. Por otra parte, PUMA fue inducida por el tratamiento con sunitinib en xenoinjertos de tumores, y la deficiencia en
PUMA
suprimió de forma significativa los efectos antitumorales de sunitinib. Nuestro estudio sugiere que la apoptosis mediada por PUMA es importante para las respuestas terapéuticas a sunitinib, y la activación de la vía mitocondrial por miméticos BH3 o manipulación PUMA puede ser útil para la mejora de la actividad antitumoral de sunitinib. La modulación de PUMA y miembros de la familia Bcl-2 selectivos podría ser potenciales biomarcadores para predecir las respuestas de sunitinib
Visto:. J Sun, Sun Q, Brown MF, Dudgeon C, J Chandler, Xu X, et al. (2012) La Targeted-Multi Inhibidor de quinasa Sunitinib induce la apoptosis en células de cáncer de colon a través de PUMA. PLoS ONE 7 (8): e43158. doi: 10.1371 /journal.pone.0043158
Editor: P. Jin Cheng, H.Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: March 2, 2012; Aceptado: 17 Julio 2012; Publicado: 17 Agosto 2012
Copyright: © Sun et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo con el apoyo de los Institutos nacionales de Salud (NIH) CA129829 subvención, subvención Sociedad Americana del cáncer RGS-10-124-01-CCE y FAMRI (J. Yu), y por subvenciones NIH CA106348, CA121105 y la Sociedad Americana del cáncer de subvención RSG-07- 156-01-CNE (L. Zhang). Este proyecto utiliza las instalaciones UPCI compartidos que se apoya en parte por el premio P30CA047904. J. Sol y Y. Shu están apoyados en parte por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China Subvenciones 30772549. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.
Conflicto de intereses: los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es la tercera causa principal de muerte por cáncer en los EE.UU. y la incidencia está encendido. el aumento en los países en desarrollo [1]. Incluso con la combinación de la mejora de la quimioterapia y la radiación en las últimas décadas, la supervivencia a los 5 años de los pacientes con enfermedad avanzada CRC sigue siendo inaceptablemente bajo. la activación aberrante de las diversas vías de la quinasa es común en la mayoría de los tumores sólidos, que pueden conducir a un aumento de la proliferación, supervivencia, angiogénesis o invasión [2], [3]. En los últimos años, considerable esperanza se ha colocado en agentes desarrolladas para quinasas oncogénicas, cuyo uso en combinación con la quimioterapia o la radiación puede mejorar la supervivencia y el pronóstico de los pacientes de CRC [4]. Se espera que el enfoque específico para entregar en última instancia, más seguros y más eficaces terapias contra el cáncer [5]. Un reto importante en el uso clínico de estos agentes es la prevalencia de la resistencia intrínseca y adquirida, cuyos mecanismos subyacentes permanecen en gran parte desconocida y un tema de intensa investigación [4], [5].
El sunitinib (también conocido como SU11248) fue desarrollado como un inhibidor de objetivos múltiples receptor tirosina quinasa (RTK), y aprobado por la FDA en 2006 para el tratamiento del carcinoma de células renales (CCR) y el tumor del estroma gastrointestinal (GIST resistente a imatinib) [6], [7] . ensayos clínicos en curso se llevan a cabo para evaluar su eficacia en otros tipos de tumores, incluyendo cáncer de colon metastásico [7], [8] (http://clinicaltrials.gov/). Sunitinib inhibe una variedad de tirosina quinasas de receptor (RTK) que están mutados o activados en el cáncer tampoco. Estos incluyen receptores del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-R α y ß) y receptores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR1, 2 y 3), así como KIT (CD117), RET, CSF-1R, y flt3 [6] , [7]. Sunitinib se ha recomendado como tratamiento de segunda línea en los GIST que desarrolló resistencia a imatinib debido a mutaciones secundarias en
c-KIT
. La inhibición de la angiogénesis, la modulación inmune y la inducción de la apoptosis ha sido sugerido para mediar los efectos antitumorales de sunitinib [7]. Los mecanismos subyacentes a los efectos autónoma de células de sunitinib tales como la muerte celular no es bien entendida.
apoptosis mediada por mitocondrias juega un papel importante en las actividades antitumorales de una amplia variedad de agentes quimioterapéuticos convencionales, así como terapias dirigidas [9], [10]. La familia de Bcl-2 de proteínas son los reguladores centrales de la apoptosis mitocondrial mediada, que se dedica a la activación selectiva o la inducción de la proximal BH3-sólo los miembros en respuesta a distinta, así como señales superpuestas [11], [12]. El BH3-única proteína PUMA juega un papel esencial en dependiente de p53 y la apoptosis en células de cáncer -independiente humanos y ratones [13], y activa la vía mitocondrial a través de la miembro de la familia Bcl-2 Bax /Bak siguiente neutralización de todos los miembros de antiapoptótico Bcl -2 moléculas como [14], [15], [16], [17]. daño del ADN inducido por la irradiación gamma o comúnmente utilizado agentes quimioterapéuticos tales como 5-fluorouracilo (5-FU), adriamicina y etopósido, inducir la inducción dependiente de p53 de PUMA y la apoptosis [15], [18]. tensiones no genotóxicos como el factor de privación de crecimiento, venenos retículo endoplasmático y una serie de inhibidores de la quinasa inducir PUMA a través de un número de otros factores de transcripción incluyendo p73, NF-kB y FoxO3a [13], [19], [20], [21], [22], [23].
en el presente estudio, hemos demostrado que induce la expresión de sunitinib PUMA independiente de p53 en células de cáncer de colon. La inducción de PUMA fue mediada por el factor de transcripción FoxO3a a la inhibición de AKT.
PUMA
deficiencia llevó a la resistencia a la apoptosis inducida por sunitinib en las células, así como en los xenoinjertos. Nuestro estudio proporciona un mecanismo molecular de la apoptosis inducida por este inhibidor de quinasa no selectiva en células de cáncer de colon, y tiene implicaciones importantes para el descubrimiento de biomarcadores y posibles estrategias para superar la resistencia.
Materiales y Métodos
Cultivo Celular y Medicamentos Tratamiento
líneas celulares de cáncer de colon se obtuvieron a partir de ATCC. Todas las líneas celulares se mantuvieron a 37 ° C en 5% de CO
2 y se cultivaron en medio 5A de Mycoy (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 10% FBS (Hyclone, Logan, UT), 100 unidades /ml de penicilina y 100 g /ml de estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las células somáticas knockout líneas HCT 116
p53
KO [24], HCT 116
PUMA
KO [15], DLD1
PUMA
KO [18], HCT 116
FoxO3a
caída estable (KD) de las células y de los pequeños ARN de interferencia (siRNA) [19] se han descrito anteriormente. agentes anticancerosos o productos químicos utilizados en el estudio incluyen malato de sunitinib (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), 5-fluorouracilo (5-FU), gosipol (Sigma, St. Louis, MO), HA14-1 (Axxora LLC, San Diego , CA), ABT-737 (Selleck Químicos LLC, Houston, TX). Las soluciones madre de todos los compuestos se prepararon en DMSO y se diluyen por medio de cultivo a concentraciones de trabajo antes de su uso. Las células se infectaron con adenovirus que expresan PUMA, Ad-PUMA [15] (20 MOI) solo o con la adición de sunitinib. La transfección de constructos de expresión de Flag-MCL-1 [16], Bcl-2 y AKT constitutiva (Millipore) se realizó como se describe [20].
Western Blotting y Fraccionamiento subcelular
anticuerpos utilizados para el Western Blot incluidos aquellos en contra de la caspasa-3, Myc (9B11), FoxO3a (total), p-FoxO3a, AKT (total), p-AKT (S473) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), el citocromo c, α- tubulina, Bcl-xL, MCL-1 (BD Biosciences), caspasa-9 (Stressgen Bioreagents, Ann Arbor, MI), citocromo oxidasa subunidad IV (Cox IV, Invitrogen), Bcl-2 (Dako, Carpinteria, CA, EE.UU.) , Flag (Sigma), PUMA [15], p53, p21, Bim, Bid, Noxa, Smac y β-actina (EMD Biosciences, Gibbstown, NJ). Western Blot se realizó como se describió anteriormente [25].
Se detectó la liberación de citocromo cy Smac en el citosol después de fraccionamiento subcelular como se describe [20], [26]. En resumen, las células fueron tratadas en matraces T75 para los tiempos indicados y sujeto a centrifugación diferencial para obtener fracciones citoplasmáticas y mitocondriales. Las concentraciones de las fracciones citosólicas obtenidas se normalizaron usando un reactivo de colorante de ensayo de proteínas (Bio-Rad, Hercules, CA). Las fracciones se mezclaron con volúmenes iguales de tampón de muestra 2x Laemmli y se sometieron a análisis de transferencia de Western.
Inmunoprecipitación de cromatina
inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) se realizó utilizando el kit de ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (Millipore, Billerica , MA) con anticuerpo FoxO3a para la precipitación de la cromatina como se describe [18]. Los precipitados se analizaron mediante PCR utilizando cebadores 5-GCGCACAGGTGCCTCGGC-3 y el 5-TGGGTGTGGCCGCCCCT-3 como se describe [22].
Ensayos de luciferasa
Las células fueron transfectadas con los reporteros PUMA que contienen ya sea WT o mutante unión FOXO3A sitios [19], con el pCMVβ reportero de control de transfección β-galactosidasa (Promega) y se trató con 12 mM de sunitinib durante 24 horas. Los lisados celulares se recogieron y actividades de luciferasa se midieron como se describe anteriormente [23]. Todos reportero experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron tres veces.
Las líneas celulares de cáncer de colon indicados (A) fueron tratados con sunitinib 15 mM durante 24 horas. Los niveles de PUMA se analizaron por transferencia Western. (B) El parental HCT 116 (WT) o
p53
células KO fueron tratados como en (A) con dosis crecientes de sunitinib y se analizaron para PUMA, p53 y la expresión de p21. (C) y (D) células HCT 116 fueron tratados con 15 mM sunitinib durante los tiempos indicados.
PUM
un mRNA y los niveles de proteína se analizaron por tiempo real de RT-PCR y Western Blot, respectivamente.
GAPDH
ARNm se utilizó como control para la normalización en RT-PCR, y se utilizó β-actina como control de carga en el Western Blot.
inversa en tiempo real Transcription- PCR
ARN total fue aislado de las células utilizando el kit Mini Aislamiento de ARN II (Zymo Research, Irvine, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARN total (1 g) se utilizó para generar ADNc utilizando transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen). PCR en tiempo real se llevó a cabo para PUMA y GAPDH como se describe [22].
(A) HCT 116 WT y
PUMA
células KO fueron tratados con dosis crecientes de sunitinib durante 48 horas. La apoptosis se analizó por el ensayo de fragmentación nuclear. Los datos se obtuvieron a partir de 3 experimentos independientes. **,
P Hotel & lt; 0,01, KO
vs
WT.. (B) células HCT 116 con los genotipos indicados fueron el tratamiento con 15 mM sunitinib durante 48 horas.
Alta
, los productos de escisión de la caspasa-3 y -9 se analizaron por transferencia Western.
Baja
, la liberación de citocromo c y Smac en el citosol se analizó por transferencia Western. β-actina y COXIV son los controles para la carga, y citosólica y mitocondrial fraccionamientos, respectivamente. (C) La formación de colonias en HCT 116 WT y
PUMA
células KO tratados con sunitinib. Las células se trataron mediante tratamiento sunitinib 12 mM durante 48 horas, después se sembraron a una dilución 1:200 o 1:400 (~600 o 300 células por pocillo) en placas de 12 pocillos y se dejó formar colonias durante 14 días.
Alta, España imágenes representativas de las colonias.
Baja
, las colonias que contienen & gt; 50 células se contaron y la supervivencia relativa se calculó con las células no tratadas fijados en 100%. Los datos se obtuvieron a partir de 3 experimentos independientes. **,
P Hotel & lt; 0,005, KO
vs
WT.. (D) DLD1 WT y
PUMA
células KO eran el tratamiento con sunitinib 30 mM durante 48 horas.
Izquierda
, PUMA y los productos de escisión de la caspasa-3 se analizaron por Western Blot.
Derecho
, la apoptosis se analizó mediante el ensayo de fragmentación nuclear. **,
P
. & Lt; 0,01, KO
vs
WT
Apoptosis ensayos
adherente y células flotantes fueron cosechadas, manchado. con Hoechst 33258 (Invitrogen), y se analizaron para la apoptosis mediante el ensayo de tinción nuclear. Un mínimo de 300 células se analizaron para cada tratamiento [25], [27]. Para los ensayos de formación de colonias, el mismo número de células se sometieron a diversos tratamientos y se sembró en placas de 12 pocillos a diferentes diluciones. Las colonias se visualizaron por tinción con violeta cristal 11 a 14 días después de la siembra tal como se describe anteriormente [25], [28]. Cada experimento se realizó por triplicado y se repitieron al menos dos veces.
(A) HCT 116 y HT 29 células fueron tratadas con 15 mM sunitinib durante los tiempos indicados. Los niveles totales de FoxO3a, fosforilada (p) - FOXO3A, Total-Akt y fosforilados (p) -AKT (S473) se analizaron por transferencia Western. (B) HCT 116
p53
células KO y HT 29 células fueron transfectadas ya sea con un vector vacío o una expresión de AKT constitutivamente activa construye durante 16 horas, después se trató con 15 mM sunitinib durante 24 horas. Los niveles de p-AKT y PUMA se analizaron por transferencia Western. (C) HCT 116
p53
células KO fueron transfectadas ya sea con un siRNA revueltos o un
FoxO3a
siRNA específico durante 24 horas, y después se trató con 15 mM sunitinib durante 24 horas. Los niveles de las proteínas indicadas se analizaron por transferencia Western. (D)
FoxO3a
caída estable células (KD) se trataron con 15 mM sunitinib durante 24 horas. Los niveles de las proteínas indicadas se analizaron por transferencia Western. La banda específica del total-FoxO3a se indica mediante una flecha. ß-actina se utilizó como control de carga.
Los tumores de xenoinjerto
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de la Universidad de Pittsburgh. HCT 116 WT y
PUMA
KO se establecieron xenoinjertos y midió como se describe [25]. En breve, 5-6 semanas de edad ratones desnudos atímicos hembra (Harlan, Indianapolis, IN) se inocularon con 5 × 10
6 células por sitio en ambos flancos. Los tumores se dejaron establecer durante 7 días. Los ratones fueron gavaged vía oral durante 10 días consecutivos con sunitinib 80 mg /kg /día diluido en tampón de citrato de sodio (pH 4,7, vehículo), o vehículo [29]. Los volúmenes de los tumores se midieron en dos dimensiones utilizando un pie de rey. Los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en grupos, de manera que el volumen medio del tumor en todos los grupos fue el mismo antes del tratamiento. Para todos los
in vivo
experimentos, los volúmenes tumorales se midieron cada dos días en 2 dimensiones y los volúmenes se determinaron en mm
3 utilizando la fórmula l × b
2 × 0.52 (donde l es la más grande diámetro y b es el diámetro más pequeño del tumor). Los ratones fueron inyectados i.p. 2 h antes del sacrificio con una dosis única de bromodesoxiuridina (BrdU) a 150 mg /kg para etiquetar células en fase S. BrdU se disolvió en PBS a una concentración final de 30 mg /mL. El análisis histológico e inmunofluorescencia para la apoptosis y la proliferación se realizaron en secciones congeladas 5-m, como se describe [25]. Los ratones fueron sacrificados 21 días después del tratamiento, o 24 horas después del tercer tratamiento (día 4). Los tumores se diseccionaron y se congelaron para el Western Blot o fijados en formalina al 10% antes de la inclusión en parafina.
(A) se llevó a cabo la inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP) en HCT 116
p53
células KO después de 15 micras el tratamiento con sunitinib para 8 y 12 horas. IgG se utilizó como un control para el anticuerpo-FoxO3a específico. (B) las células HCT 116 fueron transfectadas con el reportero PUMA que contiene el WT o sitios de unión de mutantes FOXO3A durante 16 horas, y luego tratados con 15 mM sunitinib durante 24 horas. Las actividades reportero se midieron por ensayo de luciferasa como se describe en los métodos. (C)
FoxO3a
caída estable células (KD) se trataron con dosis crecientes de sunitinib durante 48 horas. La apoptosis se analizó por el ensayo de fragmentación nuclear. Los datos se obtuvieron a partir de 3 experimentos independientes. **,
P Hotel & lt; 0,01, KD
vs
WT.. (D) Expresión de MCL-1 suprimido la apoptosis inducida por sunitinib en las células HCT 116. Las células fueron transfectadas con Bandera de etiquetado MCL-1 durante 16 horas después se trató con 15 sunitinib mu M durante 48 horas. La apoptosis se analizó por el ensayo de fragmentación nuclear. Los datos se obtuvieron a partir de 3 experimentos independientes. **,
P Hotel & lt; 0,01, KO
vs
WT..
derecho, MCL-1 de expresión se confirmó mediante transferencia Western. β-actina se utilizó como control de carga.
TUNEL y Inmunoticción
El análisis histológico se realizó mediante tinción con hematoxilina y eosina. Transferasa terminal deoxyribonucleotidyl mediada dUTP nick fin de etiquetado (TUNEL) tinción en secciones congeladas se realizó con transferasa recombinante terminal (Roche) y uUTP-Alexa 594 (Invitrogen) de acuerdo con los fabricantes 'instrucciones, y counterstained con 4', 6-diamidino- 2-fenilindol (DAPI) con una modificación menor introducida para las muestras de parafina [25], [30], [31]. Las células apoptóticas se contaron bajo un microscopio de fluorescencia en campos elegidos al azar, y el índice de apoptosis se calculó como un porcentaje de células TUNEL positivas en al menos 1.000 células analizadas. incorporación de BrdU se visualizó con anti-BrdU Alexa 594 anticuerpo (Invitrogen) y los núcleos se visualizaron con DAPI. El índice de proliferación se calculó contando las células bajo microscopio de fluorescencia en varios campos elegidos al azar. El índice de BrdU se calcula como un porcentaje de las células BrdU positivas en al menos 1.000 células analizadas. Fosfo-AKT, fosfo-FoxO3a y activa la caspasa-3 La inmunohistoquímica se realizó como se describe [19].
La apoptosis se determinó por el ensayo de fragmentación nuclear y la activación de las caspasas. Todos los datos sobre la apoptosis se obtuvieron de 3 experimentos independientes, mientras que se muestran transferencias de Western representativas. células (A) HCT 116 fueron tratados con 10 mM sunitinib, 5 mM HA14-1, 5 mM gosipol, 1 M ABT-737, 20 MOI Ad-PUMA (0,2 l /ml) sola, o su combinación durante 48 horas. *,
P Hotel & lt; 0,05, combinación
vs
agente único..
derecho, caspasa-3 procesada se detectó mediante Western Blot. (B) HCT 116
PUMA
células KO fueron tratados con sunitinib 12 mM, 5 mM HA14-1, 5 M gosipol, 1 M ABT-737, 20 MOI Ad-PUMA (0,2 l /ml) por sí sola, o su combinación durante 48 horas. *,
P Hotel & lt; 0,05, combinación
vs
agente único..
derecho, caspasa-3 procesada se detectó mediante Western Blot. (C) HCT 116 WT y
PUMA
células KO fueron tratados con 10 mM sunitinib, 30 mg /ml 5-FU solo o en combinación durante 48 horas. *,
P Hotel & lt; 0,05, KO
vs
WT..
Derecho
, caspasa-3 procesada se detectó por Western Blot.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad Prism IV. Todos los valores de p se calcularon mediante la prueba t de estudiante, y P & lt; 0,05 se consideró significativo. Medios ± desviación estándar (SD) se visualiza en cifras que en su caso.
Resultados
PUMA es inducido por sunitinib en células de cáncer de colon
La expresión de PUMA es baja en mayoría de las células no estresadas, y es inducida por diversas tensiones genotóxicos y no genotóxicos [23]. Para determinar un posible papel de PUMA en respuesta inducida por sunitinib, se analizaron los niveles de PUMA, p21 y p53 antes y después del tratamiento en líneas celulares de cáncer de colon de cinco. Tres de estas líneas, HCT 116, RKO y SW 48 contienen WT
p53
mientras que dos líneas HT 29 y SW 480 contienen mutante
p53
. PUMA fue inducido por sunitinib en las cinco líneas celulares (Fig. 1A). PUMA inducción era dependiente de la dosis y se produce tanto en las células HCT 116
p53
knockout (KO) y WT (Fig. 1B). Los niveles basales de PUMA fueron más bajos en
p53 knockout células
en comparación con las células WT como se informó anteriormente (fig. 1B) [15]. p53 y p21 también fueron inducidos por el tratamiento con sunitinib.
PUMA
mRNA fue inducida rápidamente por sunitinib, anterior a la inducción de proteínas (Fig. 1C y 1D). Estos datos sugieren que PUMA es inducido transcripcionalmente por sunitinib independiente de p53 en células de cáncer de colon.
(A)
izquierda, curva de crecimiento de HCT 116 WT y
PUMA
KO tumores tratados con sunitinib (Suni, sonda oral, 80 mg /kg /ratón, al día durante 10 días) o vehículo (vE, pH4.7 tampón de citrato) durante 21 días. El volumen del tumor se midió cada dos días. N = 7 por grupo. **,
P Hotel & lt; 0,01, WT + ve
vs
WT + Suni: *,
P Hotel & lt; 0,05, WT + Suni
vs.. PUMA
KO + Suni.
Rig
t, una imagen representativa de WT y PUMA
PUMA
tumores KO tratados como se indica en el día 21. (B) Sunitinib inducida en xenoinjertos de tumores. Los niveles de proteínas se indica en cuatro tumores WT KO seleccionados al azar se detectaron por transferencia de Western. (C) Los niveles de p-AKT y p-FoxO3a en WT tumores 24 horas después de la tercera dosis se analizaron por IHC. se muestran imágenes representativas. (D)
PUMA
deficiencia inhibe la apoptosis y el crecimiento de la supresión inducida por sunitinib en xenoinjertos de tumores. Las secciones en parafina de los tumores HCT 116 24 horas después de la tercera inyección se sometieron a TUNEL y tinción con BrdU para cuantificar la apoptosis y la proliferación, respectivamente. Se calculó el índice de células TUNEL-positivas o BrdU marcado. **,
P Hotel & lt; 0,01, WT + ve
vs
WT + Suni: *,
P Hotel & lt; 0,05, WT + Suni
vs.. PUMA
KO + Suni.
PUMA media la apoptosis inducida por Sunitinib
Para examinar el papel potencial de PUMA en la apoptosis inducida por sunitinib, se compararon las respuestas de las células HCT 116 con isogénica
PUMA
knockout (KO) células [15]. apoptosis
PUMA
células KO eran altamente resistentes a sunibinib inducida por (Fig. 2A). Como era de esperar, la activación de la caspasa-3 y -9, o la liberación citosólica de citocromo c o Smac fue afectada en las células
PUMA
KO, pero no en
p53
células KO (Fig. 2B) . En los ensayos de formación de colonias a largo plazo,
PUMA
células KO generado más de 4 veces más colonias que las células WT (Fig. 2C). PUMA también fue significativamente inducida por sunitinib en
p53 mutante
células DLD 1 mientras que
PUMA
deficiencia significativamente bloqueado sunitinib inducida por la apoptosis y la activación de caspasas en estas células (Fig. 2D). También se examinaron los niveles de varias proteínas BH3-sólo y miembros de la familia Bcl-2 anti-apoptóticas después del tratamiento con sunitinib. Ningún cambio constante se observó en la mayoría de ellos, a excepción de una rápida regulación a la baja MCL-1 y un retraso en la inducción de Bim después de 24 horas, en células HCT 116 (Fig. S1 A). Sin embargo, se observó poca o ninguna MCL-1 downregulation o inducción Bim en células DLD1 (Fig. S1B). Curiosamente, los niveles de varios miembros de la familia Bcl-2 aumentó en
PUMA
células KO en comparación con las células WT, quizás reflejando su degradación por proteasas activadas durante el tratamiento y la apoptosis (Fig. S1B). Estos resultados sugieren que PUMA juega un papel clave en las respuestas apoptóticas a sunitinib en células de cáncer de colon.
El mecanismo de la inducción por PUMA Sunitinib
La vía PI3K /AKT es un efector común corriente abajo de múltiples quinasas blanco de sunitinib. tanto, nuestro estudio activación de AKT en un tiempo experimento después del tratamiento con sunitinib, y encontramos AKT de-fosforilación en cuestión de minutos (Fig. 3A). FoxO3a es un factor de transcripción y de destino bien establecido de AKT, y su fosforilación por AKT conduce a la inactivación y la exclusión nuclear. El tratamiento con sunitinib llevado a una rápida fosforilación de de-FoxO3a, sin embargo, no tuvo ningún efecto evidente en los niveles de FOXO3A totales (Fig. 3A). Se observa que los cambios en FoxO3a y la fosforilación de AKT, o
PUMA
mRNA son dinámicos y transitoria; mientras que la inducción de la proteína PUMA es persistente y uniforme a través de diferentes líneas celulares (Fig. 1 y 3A). exógenos expresión de AKT activa suprime la inducción de PUMA por sunitinib (Fig. 3B). La inducción de PUMA se inhibió significativamente por
FoxO3a
desmontables ya sea por expresión transitoria de siARN o expresión estable de ARNhc en ambos WT y
p53
KO células HCT 116 (Fig. 3C y 3D).
se utilizaron células p53
KO para reducir p53 depedent PUMA inducción mediante transfección.
A continuación se determinó si FoxO3a activa directamente
PUMA
la transcripción de ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (CHIP). Dos sitios de unión FOXO3A se encuentran en el primer intrón de
PUMA
[19]. El reclutamiento de FoxO3a a la
PUMA promotor
contener estos sitios se incrementó a las 8 horas después del tratamiento con sunitinib (Fig. 4A). El uso de ensayos de indicador, se encontró que las mutaciones en los sitios de unión FOXO3A redujeron significativamente la actividad de reportero PUMA después del tratamiento sunitinib (Fig. 4B). Además,
se encontraron FOXO3A
desmontables células estables para ser resistentes a la apoptosis inducida por sunitinib (Fig. 4C). niveles MCL-1 fueron restaurados por
FoxO3a
siARN en las células tratados con sunitinib (Fig. 1D y 3C, S1), lo que sugiere su degradación podría ser un mecanismo adicional de la apoptosis inducida por sunitinib en las células HCT 116. apoptosis inducida por sunitinib se produjo en otras líneas de CRC incluyendo HT29, y fue suprimida por la sobreexpresión de MCL-1 o Bcl-2 (Fig. 4D y S2). Estos datos indican que FoxO3a regula la inducción de PUMA y la vía mitocondrial de la apoptosis inducida por sunitinib.
BH3 miméticos o PUMA niveles elevados de sensibilizar a las células del cáncer de colon con sunitinib
Las observaciones anteriores predicen altos niveles de PUMA , BH3-sólo las proteínas o moléculas pequeñas miméticos BH3 sensibilizar a las células cancerosas a la apoptosis inducida por sunitinib. Varios miméticos BH3 incluyendo HA14-1, gosipol y ABT-737, y PUMA adenovirus (Ad-PUMA [15]), fueron capaces de sensibilizar a las células HCT 116 al sunitinib. Estos agentes solo indujo poca o limitada apoptosis (Fig. 5A). Curiosamente, miméticos BH3 indujeron apoptosis significativa y activación de la caspasa en las células
PUMA
KO cuando se combina con sunitinib (Fig. 5A y 5B). Agentes dañinos del ADN, tales como 5-FU induce PUMA y Noxa en las células p53 WT [14], [32], [33], [34]. 5-FU también sinérgicos con sunitinib para inducir la apoptosis en células HCT 116 (Fig. 5C), que se asocia con una mejora de la inducción PUMA (Fig. S3). Esta sinergia se atenuó pero no bloqueada en
PUMA
células KO (Fig. 5C) tal vez debido a las modulaciones de otros miembros de la familia Bcl-2 a través de dos mecanismos de p53-dependiente e independiente. Estos datos demuestran que los niveles elevados de puma o BH3 miméticos pueden mejorar las respuestas apoptóticas a sunitinib, incluso en las células resistentes a la apoptosis.
PUMA media las respuestas terapéuticas a sunitinib en modelos de xenoinjertos
Para evaluar si PUMA modula las respuestas terapéuticas
in vivo
, WT y
se inyectaron PUMA
KO HCT 116 células por vía subcutánea en los flancos de ratones BALB /c (nu /nu) desnuda para establecer xenoinjertos. En comparación con el vehículo, el tratamiento con sunitinib resultó en 62% y la inhibición del crecimiento% 38 en HCT 116 WT y
PUMA
tumores KO, respectivamente (Fig. 6A). Las diferencias entre los
PUMA
genotipos fueron estadísticamente significativas en el grupo de sunitinib (P & lt; 0,01)., Pero no en el brazo del vehículo con respecto a la eficiencia o la tasa de crecimiento en el establecimiento del tumor (Fig. 6A)
PUMA fue inducida significativamente en los tumores de los ratones WT tratados con sunitinib (Fig. 6B). Modulaciones de MCL-1, fosforilada FoxO3a y AKT, también se observaron (Fig. 6B y 6C). El análisis de secciones de tumores de los ratones un día después de la tercera administración de sunitinib (día 4), se encontró una tasa significativamente menor de la apoptosis y la mayor tasa de proliferación celular en
PUMA
tumores KO en comparación con los tumores WT (Fig. 6D y S4A). Activa la caspasa-3 tinción confirmada redujo significativamente la apoptosis en los tumores
PUMA
KO (~ 80%), en comparación con los tumores tratados idénticamente WT (Fig. S4B). Estos resultados demuestran que la respuesta terapéutica a sunitinib
in vivo
está mediada por apoptosis dependiente de PUMA.
Discusión
pruebas
emergente sugiere que la inducción de la apoptosis es un mecanismo importante de una amplia variedad de agentes contra el cáncer [2], [10], [35]. La evasión de la muerte celular es una característica del cáncer y un importante contribuyente a la resistencia terapéutica [2], [3]. Además de los efectos bien documentados de sunitinib en la inhibición de la angiogénesis del tumor [6], [7], [36], [37], nuestro trabajo demuestra que sunitinib exhibe una fuerte actividad pro-apoptótica en células de cáncer de colon a través de la inducción de PUMA través de la transcripción factor de FoxO3a, pero no p53, p65 NF-kB o p53 homólogo p73 y p63. la apoptosis inducida por sunitinib se asocia con la inducción de Bim o regulación a la baja de MCL-l en algunas líneas celulares de cáncer de colon que probamos. Un trabajo anterior demostró la participación de Bim y STAT3 durante la apoptosis inducida por sunitinib en otros tipos de células [38], [39], [40]. En conjunto, estos datos sugieren que la inducción de BH3-sólo las proteínas podría ser un mecanismo común subyacente a la muerte de células de cáncer sunitinib inducida que podrían ser afectada por el estado de varias quinasas, y diferentes BH3-sólo las proteínas pueden ser importantes en diferentes tipos de células.
también se encontró un número de inhibidores de VEGFR más selectivos para inducir PUMA y la apoptosis en células de cáncer de colon (datos no mostrados), apoyando un papel no angiogénica de las terapias anti-VEGFR. Será importante para determinar si la apoptosis inducida por sunitinib está mediada por PUMA u otras proteínas BH3-solamente en otros tumores sólidos tales como cáncer y GIST renal, y su papel potencial en las respuestas apoptóticas a otros inhibidores de VEGFR y PDGFR. Se sugirió la sensibilidad reducida a sunitinib estar relacionado con mutaciones en
KIT
o
VEGFR /FDGFR
o en otras RTK, así como la disminución de la expresión de receptores de VEGF solubles (sVEGFs) [6], [7], que puede suprimir la muerte celular o promover la supervivencia [2], [5]. Además, la inhibición de la angiogénesis del tumor o de otros componentes en el microambiente podría activar indirectamente las vías de muerte celular [2]. El uso de líneas celulares isogénicas como lo hicimos aquí podría ser particularmente útil en la comprensión de los objetivos y mecanismos de drogas [41]
.
A pesar de la emoción en el desarrollo de fármacos dirigidos a quinasas oncogénicas, los datos clínicos demuestran que la mayoría de estos agentes son generalmente eficaces sólo en una pequeña fracción de los pacientes [4], [5]. Un cambio importante es identificar biomarcadores para ayudar a la selección de pacientes y la estratificación. Nuestros datos muestran que persiste PUMA 24-48 horas después del tratamiento con sunitinib. En contraste, la inhibición de AKT /FoxO3a es más transitoria y se recupera en horas, probablemente refleja intentos secundarios y la supervivencia en las células tumorales después de la activación de la señalización de apoptosis. Estos resultados explican por qué potencialmente moléculas de señalización aguas arriba son menos adecuados como biomarcadores, y sugieren la modulación de la vía de la muerte mitocondrial podría ser una lectura más útiles para la actividad terapéutica general de agentes contra el cáncer.