Extracto
Antecedentes
El receptor del factor de crecimiento epidérmico ( EGFR) número de copias de genes (GCN) se ha demostrado previamente que se correlaciona con el resultado clínico de cáncer colorrectal (CRC) tratados con anticuerpos monoclonales anti-EGFR (mAb), aunque sigue siendo controvertido. Se realizó una revisión sistemática y meta-análisis para evaluar EGFR GCN como un biomarcador potencial de supervivencia para los pacientes con CCR avanzado que reciben tratamiento con anticuerpos monoclonales anti-EGFR.
Métodos
artículos identificados de forma sistemática la investigación EGFR GCN por técnicas de detección fluorescentes o cromogénicos
In situ
hibridación o de otro tipo en los pacientes con CCR metastásico tratados con panitumumab o cetuximab, (última búsqueda: 10 Agosto 2012). Los estudios elegibles tenían que informar sobre la supervivencia global (SG), la supervivencia libre de progresión (SLP) o el tiempo-toprogression (TTP), estratificado por EGFR GCN. Resumen ratios de riesgo (CR) se calcularon utilizando modelos de efectos aleatorios.
Resultados
Entre los 13 estudios identificados, 10 (776 pacientes, 302 con el aumento de GCN), 8 (893 pacientes, 282 con aumentaron GCN) y 3 (149 pacientes, 66 con un aumento de GCN) fueron elegibles para el sistema operativo, PFS y TTP metanálisis, respectivamente. El aumento de EGFR GCN se asoció con un aumento de la SG (CRI = 0,62; IC del 95% 0,50 hasta 0,77;
P Hotel & lt; 0,001), la SLP (HR = 0,65; IC del 95% 0,47-0,89;
P
= 0,008), pero no TTP (HR = 0,71; IC del 95%: 0,44 a 1,14;
P = 0,157
). También se demostró que el EGFR GCN es independiente de otros factores como el estado KRAS. Entre esas poblaciones recibido de segunda línea o mayor para el tratamiento, el aumento de EGFR GCN está fuertemente asociada con una mejor supervivencia (para el sistema operativo, HR = 0,60; IC del 95% 0,47 a 0,75; P & lt; 0,001; para la SSP, HR = 0,59; IC del 95%: 0,47 -0.75, p. & lt; 0,001), mientras que no influye en la supervivencia en los pacientes que recibieron terapia de primera línea
Conclusión
Entre los pacientes anti-EGFR tratados, el aumento de EGFR parece GCN se asocia con mejores resultados de supervivencia. El efecto sobre la supervivencia parece estar relacionada con los pacientes que recibieron la línea de tratamiento
Visto:. Jiang Z, C Li, Li M, Wang X (2013) Gen EGFR Copy Number como marcador pronóstico en pacientes con cáncer colorrectal tratados con cetuximab o panitumumab: una revisión sistemática y metanálisis. PLoS ONE 8 (2): e56205. doi: 10.1371 /journal.pone.0056205
Editor: Jian-Xin Gao, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, China
Recibido: 18 Septiembre, 2012; Aceptó 7 de enero de 2013; Publicado: 18 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Jiang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por china Science Foundation Postdoctoral (2011M500060) y Heilongjiang Postdoctoral Grant (LRB2010-87864). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el principal determinante pronóstico para los pacientes con cáncer colorrectal metastásico no resecable (CCR) es la respuesta a la terapia sistémica [1]. Durante estos últimos años, las nuevas estrategias que se dirigen al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) han sido evaluadas en el CCR, incluyendo anticuerpos monoclonales (mAb). Estos mAbs que interfieren con el dominio extracelular de EGFR, se han diseñado para ser utilizado cuando otros tratamientos fallaron [2]. Dos de tales anticuerpos monoclonales, panitumumab y cetuximab, están activas en el cáncer colorrectal metastásico, pero la evidencia clínica muestra que aproximadamente el 10% de los pacientes alcanzaron una respuesta objetiva del tumor a mAb anti-EGFR [2] - [4]. La identificación de los pacientes que son propensos a ser beneficiado con mAb EGFR es cada vez más crucial para mejorar las estrategias terapéuticas, así como para reducir la carga financiera de los sistemas de atención de salud [5]. Por lo tanto, los marcadores de pronóstico fiables de tratamiento para los pacientes seleccionados deben ser identificados
Varios estudios clínicos han demostrado que la presencia de una mutación KRAS es un predictor significativo de la resistencia a anti-EGFR mAbs [6] -. [ ,,,0],8]. Sin embargo, la aparición de mutaciones de KRAS sólo representa aproximadamente el 30% y el 40% de los pacientes que no responden, lo que sugiere que puede que no sea el único predictor de la respuesta cetuximab y la identificación de los determinantes genéticos adicionales de los beneficios del tratamiento, todavía tienen que ser definidos. Recientemente, los estudios han demostrado que un número incrementado de copias del gen EGFR (GCN), analizado por la fluorescencia en la técnica de hibridación in situ (FISH), podría ser un predictor prometedora de anti-EGFR terapia mAbs en el cáncer colorrectal metastásico, pacientes con baja GCN son de hecho poco probable que respondan al tratamiento anti-EGFR y tienen menos tiempo libre de progresión de pacientes con aumento de GCN [9] - [12]
Moroni et al.. [9] informó por primera vez una asociación EGFR GCN aumentó con una respuesta favorable a la terapia anti-EGFR entre KRAS de tipo salvaje pacientes con CCR. Sin embargo, estudios posteriores revelaron la conclusión permaneció incompatible [10], [12]. Los estudios sobre el EGFR GCN habían mostrado diferentes tendencias del pronóstico en los CRC, esto podría ser debido a un tamaño relativamente pequeño y diferente población de pacientes. Por lo tanto, es muy necesario realizar un estudio cuantitativo y sistémica con métodos rigurosos. El meta-análisis es un medio poderoso para resolver resultados dispares. Para hacer frente a la asociación entre las variaciones de EGFR GCN y los resultados de supervivencia de los pacientes con CCR metastásico que reciben terapia anti-EGFR, un meta-análisis se realizó a partir de todos los estudios elegibles en este estudio.
Materiales y Métodos
identificación y elegibilidad de los estudios pertinentes
Se realizó una búsqueda sistemática computarizado del MEDLINE (PubMed) de base de datos, EMBASE y The Cochrane Library (última búsqueda: 10 Agosto, 2012) para identificar todos los artículos publicados relacionados con el identificación de mutaciones en EGFR relacionados con CRC, utilizando el algoritmo: (receptor del factor de crecimiento epidérmico o EGFR) Y (mutación o polimorfismo o el número de copias de genes O GCN o amplificación de genes o de estado) Y (cáncer colorrectal o CRC). Estudios adicionales se identificaron mediante una búsqueda manual de las referencias de los estudios originales o artículos de revisión sobre este tema. Los estudios elegibles incluidos en el meta-análisis tenían que cumplir los siguientes criterios: (a) un estudio de cohorte cáncer colorrectal; (B) los cocientes de riesgos (CR) con sus correspondientes intervalos de confianza del 95% (IC) que comparan la supervivencia global (SG), la supervivencia libre de progresión (SLP) o el tiempo hasta la progresión (TTP) estratificada por el número de copias del gen EGFR en pacientes que reciben mono - o terapia de combinación con se informó o se les permite el cálculo cetuximab o panitumumab; y (c) escrito en Inglés.
Extracción de datos
Dos investigadores extrajeron los datos de forma independiente y alcanzó un consenso sobre todos los elementos. La siguiente información se extrajo de cada estudio: primer autor, año de publicación, número de pacientes examinados, el origen étnico de la población de estudio, el género, la proporción de aumento de la GCN, se registraron los métodos específicos de determinación del número de copias de genes, así como los valores de GCN corte, estado de KRAS, anticuerpos monoclonales anti-EGFR, el diseño del estudio y también para los datos que vinculan mutación específica para el resultado del tratamiento. Además, se categorizaron los estudios de línea de tratamiento. Cuando se llevaron a cabo estudios en los entornos de tratamiento mixto, que los estudios en los que al menos el 80% de los pacientes habían recibido quimioterapia previa como estudios de "segunda línea" define operacionalmente. Por último, se extrajeron los CRI y su varianza de los resultados de supervivencia pertinentes que compararon los pacientes con un mayor número de copias del gen EGFR y normal en tratamiento con cetuximab o panitumumab. La AR es la métrica más apropiada para los resultados del tiempo transcurrido hasta el evento [13], [14]. Cuando la AR y /o su varianza no fueron proporcionados por los estudios elegibles, se utilizaron los métodos desarrollados por Parmar
et al.
[14] para calcularlos. Cuando los valores de
P
no estaban disponibles, el AR se aproximó por la relación de una mediana de supervivencia [15]. Los datos fueron extraídos por la versión Engauge Digitizer 4.1 (software libre descargado de http://sourceforge.net) a partir de las curvas de supervivencia si no se muestra en los artículos directamente, a continuación, se estimó el registro de recursos humanos y su varianza utilizando los métodos previamente reportados [14 ], [dieciséis]. Dos autores realizaron la extracción de datos de forma independiente y las discrepancias se resolvieron por consenso que incluye un tercer autor.
Análisis estadístico
Se utilizó la HR y la correspondiente IC extraído de cada estudio para evaluar la heterogeneidad entre los estudios mediante el Q estadísticas [17] y la inconsistencia utilizando el
I
2 índice [18] (
I
2 & lt; 25% heterogeneidad;
I
2 = 25-50% heterogeneidad moderada;
I
2 & gt; 50% grande o extrema heterogeneidad). La heterogeneidad se consideró estadísticamente significativa con
P Hotel & lt; 0,10. CR de resumen con sus IC del 95% se calcularon usando un método de la varianza inversa. Hemos montado un modelo de efectos aleatorios ya que la heterogeneidad entre los estudios se preveía [19]. El sesgo de publicación se investigó mediante gráfico de embudo, y una trama asimétrica sugirió un posible sesgo de publicación. La asimetría del gráfico en embudo se evaluó mediante la prueba de regresión lineal de Egger [20]. Se realizó la prueba t para determinar la importancia de la asimetría, y un
P valor Red de. & lt; 0,05 se consideró significativo un sesgo de publicación
Los análisis de subgrupos se realizaron para evaluar el efecto de la etnicidad (Asia oriental frente a blanco), el método de determinación del EGFR GCN (FISH frente cromogénico
In situ
hibridación (CISH)), estado de KRAS (salvaje frente mixta), los anticuerpos monoclonales específicos de EGFR utilizados (cetuximab frente panitumumab) y la línea del tratamiento (≥80% frente a & lt; 80% de segunda línea). sobre el valor pronóstico de EGFR GCN
los análisis estadísticos se realizaron con Stata (versión sE /10; StataCorp, College Station, TX).
Los valores P
para todas las comparaciones fueron de dos colas y la significación estadística se definió como
P
. & Lt; 0,05 para todas las pruebas excepto los de la heterogeneidad
Resultados
Elegibilidad
Nuestra búsqueda inicial produjo 76 estudios sobre el tratamiento dirigido a EGFR en el CCR, que fueron evaluados en texto completo. Como se indica en la búsqueda diagrama de flujo (Figura 1), 13 estudios informaron al menos uno de los resultados de interés y finalmente fueron incluidos en el meta-análisis [10] - [12], [21] - [30]. El diagrama de búsqueda flujo se resume en la figura 1 y las características de los estudios elegibles se resumen en la Tabla 1.
Ocho de los estudios de FISH empleado, uno de CISH empleada y dos empleadas ambos métodos, dos plata empleada
hibridación in situ gratis (SISH) y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), respectivamente (Tabla 1). el número de copias de genes se anotó /evaluó de acuerdo con un valor de corte diferente, que por lo general se deriva de la análisis de la curva receptor características de funcionamiento (ROC). Doce estudios eran retrospectivos y uno fue prospectivo. Todos los estudios elegibles eran pequeños, con tamaños de muestra que van desde 20 a 277 pacientes (mediana de tamaño = 86 pacientes, con una media de tamaño = 92 pacientes, desviación estándar = 67). En general, los estudios elegibles informaron sobre 1174 pacientes, de los cuales 407 (35%) se caracterizan por tener una mayor EGFR número de copias del gen. El número de copias del gen EGFR aumento de la frecuencia varió de 15% a 77%. Once de los estudios se realizaron en Europa (1058, 338 pacientes con un mayor número de copias de genes; 32%), mientras que dos fueron realizados en poblaciones de Asia oriental (116 pacientes, 69 con mayor número de copias de genes; 59%). Entre todos los estudios, sólo tres se realizaron en pacientes con cáncer colorrectal de tipo salvaje, pero dos proporcionaron datos para el resultado en las poblaciones de tipo salvaje.
Meta-análisis de bases de datos
En cuanto a sistema operativo, 10 estudios que incluyeron 776 pacientes (302 con un mayor número de copias del gen, 39%) contribuyeron con datos para el metanálisis. No hubo heterogeneidad entre los estudios (
P = 0,886
;
Me
2
= 0,0%) y el aumento de GCN se asoció significativamente con la mejora de la SG entre los pacientes tratados con anticuerpos monoclonales anti-EGFR (HR = 0,62; IC del 95%: 0,50-0,77;
P Hotel & lt; 0,001) (Figura 2). Para la SSP, 8 estudios que incluyeron 893 pacientes (282 con un mayor número de copias de genes; 32%) contribuyeron con datos para el metanálisis. Se apreció una gran heterogeneidad entre los estudios (
P = 0,004
;
Me
2
= 66,0%) y el aumento de EGFR GCN se asoció significativamente con la mejora de la SSA (HR = 0,65; 95% IC 0,47 a 0,89;
P
= 0,008). Por último, para la TTP, sólo tres estudios (149 pacientes, 66 con mayor número de copias de genes, 44%) proporcionaron información que debe incluirse en el metanálisis. Ya no había heterogeneidad entre estudios (
P = 0,331
;
Me
2
= 9,6%) y no encontramos un beneficio significativo TTP para los pacientes con aumento de la GCN EGFR (HR = 0,71; IC del 95%: 0,44 a 1,14;
P = 0,157
): perfil
Las razones de riesgo (HR) que compararon pacientes con un elevado en relación con no mayor número de copias del gen EGFR se presentan.. Cada estudio se muestra por la estimación puntual de la HR (plaza proporcional al peso de cada estudio) y el intervalo de confianza del 95% para la HR (líneas que se extienden); HR resumen y sus intervalos de confianza del 95% de los cálculos de efectos aleatorios se muestran con diamantes. Valor inferior a uno indica que los pacientes con mayor número de copias del gen EGFR han mejorado la supervivencia en comparación con los pacientes sin aumento en el número de copias del gen EGFR.
Análisis de subgrupos
Los resultados del análisis de subgrupos son presentado en la Tabla 2. el aumento de EGFR GCN, fue estadísticamente significativa con el aumento de SG y SLP en los estudios de poblaciones mayores de 80% recibió de segunda línea o más alto, pero no & lt; 80%, y la asociación positiva también se mostró en aquellas poblaciones con KRAS mixta estatus o de tipo salvaje, lo que sugiere GCN EGFR podría ser un factor pronóstico independiente. Por otra parte, las correlaciones positivas de aumento de GCN con el sistema operativo y la SSP se muestran en los diferentes grupos étnicos, anticuerpos monoclonales y métodos de detección anti-EGFR, y no hubo diferencia significativa entre estos subgrupos.
prueba de heterogeneidad
Hubo una heterogeneidad extrema entre los 8 estudios incluidos PFS (
me
2
= 66,
P
= 0,004). Por lo tanto, se realizó un análisis de meta-regresión para evaluar la fuente de heterogeneidad por origen étnico, estado de KRAS, anticuerpos monoclonales anti-EGFR, método de detección y la línea de tratamiento. Sin embargo, cuando se categorizaron la heterogeneidad de estos factores, ninguno de ellos ha contribuido de manera significativa a la heterogeneidad observada.
Análisis de sensibilidad Análisis FODA
de sensibilidad se realizó tanto por Quitar secuencial de los estudios individuales y las estadísticas acumuladas de todas las comparaciones de todos los temas y subgrupos. Se demostró que con el paso del tiempo y el aumento del tamaño de la muestra, los resultados de OS y PFS ser más estable. Los CRI agrupados no fueron influenciados por ningún estudio individual.
Publicación Bias
Se realizaron gráficos de embudo y la prueba de Egger para evaluar el sesgo de publicación. Los datos sugirieron que no había evidencia de sesgo de publicación para el resultado primario del estudio, OS (prueba de Begg
P
= 0,53; prueba de Egger
P
= 0,46), la SLP (prueba de Begg
P
= 0,32; prueba de Egger
P
= 0,13), TTP (prueba de Begg
P
= 0,60;. la prueba de Egger
P
= 0,85)
Discusión
En el presente estudio, se recogieron todos los estudios disponibles y llevó a cabo un meta-análisis para examinar la asociación de las variaciones de EGFR GCN con el pronóstico de los pacientes con CCR avanzado. Diez estudios que incluyeron 776 pacientes en el sistema operativo, se revisaron críticamente ocho estudios que incluyeron 893 pacientes en la SLP y tres estudios sobre el TTP. Nos dividieron en subgrupos los artículos en cinco grupos (origen étnico, estado de KRAS, mAb anti-EGFR, método de detección y la línea de tratamiento). El metanálisis mostró un aumento de EGFR GCN se asoció significativamente con la mejora de la SG y la SSP, pero no TTP. La mediana de SG de pacientes portadores aumentó GCN mostró aumento de 1,61 veces, la mediana de la SLP mostró un aumento de 1,54 veces. Un meta-análisis de estos estudios confirman que el aumento de EGFR GCN está de hecho asociado con un sistema operativo y el beneficio moderado PFS, de un tratamiento anti-EGFR de pacientes con CCR metastásico. Del mismo modo, el EGFR número de copias del gen también se ha evaluado como un potencial predictor de la respuesta de los inhibidores de la tirosina quinasa (TKIs) en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas, y un meta-análisis ha demostrado una asociación entre el aumento del número de copias de EGFR, y mejora de la supervivencia los resultados [31]. Recientemente, Yang
et al.
Realizó un meta-análisis para diferenciar la tasa de respuesta objetiva (ORR) entre los pacientes con aumento de EGFR GCN y los que no tienen aumento de EGFR GCN [32]. Ellos sugirieron una tendencia general hacia una mayor TRG en pacientes con aumento GCN EGFR. Sin embargo, los factores de pronóstico importantes como la SLP y la SG, ya que los datos era relativamente incompleta, sólo descriptivamente revisaron los artículos publicados y no realizaron síntesis cuantitativa de los estudios. En este estudio, se utilizaron varios métodos de extracción de recursos humanos excelentes para calcular el CRI agrupado cuantitativamente. El resultado mostró una mayor asociación EGFR GCN con la mejora de los resultados de supervivencia entre los pacientes anti-EGFR tratados. Estos resultados implican la GCN EGFR podría ser no sólo un medio eficaz de predicción, sino también un valioso marcador pronóstico.
El anticuerpo monoclonal anti-EGFR es efectiva para prolongar la supervivencia en pacientes con cáncer colorrectal metastásico tras el fracaso de la quimioterapia convencional [33 ], [34]. En nuestro análisis estratificado, el aumento de EGFR GCN se asoció significativamente con la mejora de la SG y la SSP en aquellas poblaciones que recibieron de segunda línea o más alto, pero no de primera línea, que coincidió con las estrategias en la práctica clínica de la quimioterapia. Desde un punto de vista clínico, no sólo en los EE.UU. y Europa, pero también en China, anticuerpos monoclonales anti-EGFR se utilizan generalmente en pacientes de tipo salvaje KRAS CCRm. Por lo tanto, la evaluación del papel de EGFR GCN en pacientes con KRAS no mutado puede ser más significativo. En este estudio, se encontró que el valor pronóstico de EGFR GCN en la supervivencia no parece estar relacionada con el estado de KRAS, lo que sugiere GCN EGFR podría ser un biomarcador pronóstico independiente. La asociación significativa entre la supervivencia con EGFR GCN, reveló el crecimiento del tumor es, probablemente, impulsado principalmente por la vía EGFR y esta característica biológica es evocado por un aumento en el número de copias EGFR.
EGFR es un receptor transmembrana tirosina quinasa que, en de unión a ligando, desencadena dos vías principales de señalización, el eje RAS-RAF-MAPK, que está implicado principalmente en la proliferación celular, y la vía PI3K-PTEN-AKT, que es principalmente implicada en la supervivencia celular y la motilidad [35]. Los mAbs anti-EGFR se han demostrado ser eficaz en el cáncer colorrectal metastásico. Los mecanismos moleculares que subyacen a la respuesta clínica a este medicamento siguen siendo desconocidos. alteraciones genéticas en las vías de señalización relacionadas con EGFR pueden tener un efecto sobre la respuesta a esta terapia dirigida, que puede ser debido a la activación constitutiva de los genes aguas abajo de la vía de señalización de EGFR tales como KRAS, BRAF, o PIK3C2A, o a la pérdida de un gen supresor de tumor tal como PTEN. Hasta ahora, el marcador más aceptable, como un factor predictivo y pronóstico, era el estado de KRAS. Sin embargo, KRAS no fue el único predictor de la respuesta cetuximab. El presente estudio tuvo como objetivo evaluar el papel pronóstico de EGFR GCN, en términos de resultado clínico, en pacientes tratados con anticuerpos monoclonales anti-EGFR. EGFR detección de GCN también parece ser relevante para identificar positivamente respondedores. Las variaciones de GCN, reflejan las diferentes rutas tomadas por los tumores individuales para interrumpir /escapar de los mecanismos que rigen el comportamiento celular normal. En la mayoría de tumores sólidos, incluyendo CRC, los mejores mecanismos subyacentes caracterizados aumento de EGFR GCN son la amplificación de genes y cromosomas 7 polysomy [9], [10], [12], [36].
obstáculos actuales para un futuro aplicación clínica de EGFR GCN se concentran principalmente en los siguientes dos aspectos: los métodos de detección y reproducibilidad técnica difícil. técnica de FISH se ha utilizado en la mayoría de los estudios previos, pero los resultados de FISH son difíciles de interpretar y la falta de estandarización de métodos analíticos y sistemas de puntuación puede explicar en parte por qué la evaluación de EGFR GCN no se ha incorporado a la práctica clínica aún [37]. Al mirar los diferentes valores de corte en la literatura, encontramos reproducibilidad sigue siendo un gran obstáculo para su utilidad práctica y se necesita un consenso internacional sobre la definición de los puntos de corte. Sartore-Bianchi
et al.
También encontró que el diagnóstico molécula de EGFR por FISH GCN entre los cinco centros de patología altamente experimentados varió en gran medida, un sistema de puntuación detallada y amplios programas de formación son necesarios [38]. Aunque se han aplicado diferentes puntos de corte, IC del 95% alrededor de sensibilidad y especificidad cedido por cada punto de corte eran similares, lo que indica que los resultados de estos estudios son consistentes. En el presente estudio, hemos analizado la influencia del método de detección de GCN en la supervivencia y no encontramos ninguna discrepancia.
Existen varias limitaciones guardados en consideración en este meta-análisis. Primero, la mayoría de los estudios no fueron concluyentes debido a que evalúan series de pacientes que fueron tratados limitada nonhomogeneously. En segundo lugar, relativamente pequeños tamaños de las muestras incluidas en los asiáticos orientales pueden también influir en los resultados, y más estudios son necesarios para detectar el posible papel de GCN. En tercer lugar, principalmente la falta de disponibilidad de datos de pacientes individuales que permitiría a la corrección de los posibles factores de confusión tales como la edad, el sexo o las aberraciones genéticas adicionales. Por último, los métodos de detección diferentes que se utilizan en los estudios incluidos en el análisis pueden tener diferentes problemas de control de calidad.
En conclusión, nuestro meta-análisis proporciona evidencia de que el número de copias del gen EGFR es un marcador pronóstico de supervivencia entre los pacientes que reciben anti mAbs -EGFR para el cáncer colorrectal avanzado. Por otra parte, de acuerdo con nuestros resultados, la capacidad de pronóstico del número de copias del gen EGFR parece ser significativamente más fuerte entre las poblaciones que recibieron segunda línea de tratamiento o superior.