Extracto
Varios estudios han sugerido ERBB3 /HER3 puede ser un marcador pronóstico útil para el cáncer colorrectal. Los tumores con una firma de células madre intestinal también se han demostrado ser más agresivo. Aquí, investigamos si ERBB3 se asocia con marcadores de células madre intestinales en el cáncer colorrectal y si las células madre cancerosas dentro de los tumores se caracterizan por la expresión de ERBB3. La expresión de ERBB3 y marcadores de células madre intestinales (LGR5, EphB2, CD44s y CD44v6) se evaluó mediante qRT-PCR en los tumores colorrectales primarios (etapas de 0 a IV) y los tejidos normales emparejados de 53 pacientes. La localización de ERBB3, EPHB2 y KI-67 dentro de los tumores se investigó mediante co-inmunofluorescencia. Expresión de ERBB3 y marcadores de células madre intestinales fueron significativamente elevados en adenomas y tumores colorrectales en comparación con el tejido normal. Se encontraron correlaciones positivas entre ERBB3 y marcadores de células madre intestinales. Sin embargo, el análisis de co-inmunofluorescencia mostró que ERBB3 y EPHB2 marcados poblaciones de células específicas que eran mutuamente excluyentes dentro de los tumores con potenciales proliferativos distintos, la mayoría de ERBB3 + ve células que son no proliferativa. Este patrón se asemeja a la organización celular en el epitelio del colon normal donde EPHB2 marcado células proliferativas residen en la base cripta y ERBB3 + ve células marcan células diferenciadas en la parte superior de las criptas. Nuestros resultados muestran que ErbB3 y marcadores de células madre intestinales se correlacionan en los cánceres colorrectales. ERBB3 localiza a poblaciones de células diferenciadas dentro de los tumores que son no proliferativa y distinta de las células madre de cáncer. Estos datos apoyan el concepto de que los tumores contienen madre discreta, de proliferación y diferenciación compartimientos similar a la presente en las criptas normales
Visto:. Jarde T, L Kass, Staples M, Lescesen H, Carne P, K Oliva, et Alabama. (2015) ERBB3 se correlaciona positivamente con marcadores de células madre intestinales sino que marca una población distinta de célula no proliferativa en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 10 (9): e0138336. doi: 10.1371 /journal.pone.0138336
Editor: Michelina Plateroti, Universidad Claude Bernard Lyon 1, Francia |
Recibido: Diciembre 23, 2014; Aceptado: 28 Agosto 2015; Publicado: 14 Septiembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Jarde et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. los autores reconocen el apoyo a este trabajo desde las subvenciones para proyectos de salud y medicina Consejo Superior de Investigaciones Científicas (Australia) 1010429 de HA y PJM, y 1011187 a HA. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal es uno de los cánceres más comúnmente diagnosticados y letales en todo el mundo, con más de 1,2 millones de nuevos casos y 0,6 millones de muertes estimadas en 2008 [1]. Las estrategias terapéuticas que incluyen la resección quirúrgica junto a la quimioterapia son relativamente eficientes en el tratamiento de toda la masa tumoral. Sin embargo, muchos tipos de cáncer se vuelva a ocurrir dentro de meses o años. recaída de la enfermedad se ha sugerido que es debido a las células madre de cáncer resistentes a la quimioterapia que difunden antes de la resección del tumor. Estas células pluripotentes son capaces de dar lugar a un nuevo tumor, dando lugar a la recurrencia del cáncer y la metástasis. Los recientes avances en el cáncer colorrectal han llevado a la caracterización de los marcadores de células madre intestinales, incluyendo LGR5, EPHB2, y CD44 [2-4]. En epitelio normal del colon, estos marcadores están restringidos a la base de las criptas donde residen las células madre. Más altos niveles de expresión de estos marcadores se encuentran en el cáncer colorrectal en comparación con el tejido normal adyacente y de expresión LGR5 se correlaciona positivamente con el número de metástasis en los ganglios linfáticos [4-7]. Pacientes con cáncer colorrectal con alta expresión de un gen firma intestinal de células madre, incluyendo LGR5 y EPHB2, tienen unas 10 veces mayor riesgo de recaída en comparación con los pacientes con niveles bajos [8]. La comprensión de las vías de señalización y las moléculas que regulan las células madre del cáncer se requiere para desarrollar enfoques de pronóstico robustas y nuevas estrategias terapéuticas.
La familia erbB de tirosina quinasas receptoras, también conocidos como receptores HER, consta de cuatro miembros-ERBB1 /HER1 , erbB2 /HER2, ERBB3 /HER3 y ERBB4 /HER4. Estos receptores son moduladores clave de crecimiento y desarrollo normal y su desregulación se ha implicado en la iniciación y progresión de cánceres [9, 10]. terapias basadas en anticuerpos dirigidos contra ERBB1 o ErbB2, dirigidas a disminuir su capacidad de transducción de señales, han demostrado beneficios clínicos en el tratamiento de varios tumores [11]. Debido a la ausencia de un dominio activo de la tirosina quinasa intracelular, ERBB3 se tuvo en cuenta durante varios años como un objetivo de cáncer [12]. Sin embargo, ERBB3 se ha propuesto recientemente para estar implicado en la resistencia adquirida a las terapias y ha surgido como una diana terapéutica potencial que conduce al desarrollo de múltiples anticuerpos anti-ErbB3 [13]. Aunque la función precisa de ERBB3 en el cáncer colorrectal no se entiende completamente, varios estudios sugieren que ERBB3 se interrumpe en los tumores. Por ejemplo, ErbB3 mutaciones somáticas se han identificado en 11% de los cánceres de colon y varios estudios han demostrado que ERBB3 se expresa en 36-89% de los cánceres de colon [14-20]. Algunos estudios han sugerido que el aumento de expresión de la proteína ERBB3 en cáncer de colon también se asocia con una disminución de la supervivencia del paciente [20, 21].
In vitro
, desmontables ERBB3 disminución de la proliferación celular, la apoptosis inducida y bloqueó la migración de células de cáncer de colon [21]. Un mecanismo similar se observó
in vivo
donde ERBB3 desmontables retraso del crecimiento tumoral [14]. Aunque estos datos son claramente indicativos de un potencial oncogénico de ERBB3, actualmente se desconoce si ERBB3 regula la piscina de células madre de cáncer colorrectal que se sugiere para impulsar la iniciación del tumor y la recidiva tumoral [8, 22].
Materiales y métodos
El reclutamiento de pacientes y recogida de tejidos
Cincuenta y tres pacientes con adenomas primarios (n = 4) o adenocarcinomas (n = 49) fueron sometidos a una cirugía en 2012/2013 en el hospital Cabrini (Malvern, Victoria) . El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación Humanos Cabrini. Todos los pacientes procuraron su consentimiento escrito. especímenes tumorales y tejidos normales del colon emparejados eran recién almacenados en RNAlater (Qiagen) para la extracción de ARN y se fijaron en paraformaldehído al 4% para el análisis de la expresión tisular.
Cultivo de células
LIM1215, LIM1899, LIM2405, LIM2550 , se utilizaron líneas celulares de cáncer colorrectal humano SW480 y CaCo2 en este estudio (se suministra como un regalo del Instituto Ludwig para la Investigación del cáncer, Parkville, Australia) [23-26]. Las células, excepto células CaCo2, se pasaron rutinariamente en RPMI 1640 que contiene suero de ternera fetal 10% (Gibco), penicilina /estreptomicina (Gibco) y glutamax (Gibco). células Caco2 se mantuvieron en DMEM que contiene 20% de suero de ternera fetal (Gibco), penicilina /estreptomicina (Gibco) y glutamax (Gibco). Las células se cultivaron en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 a 37 ° C.
La extracción de RNA, la preparación de ADNc y RT-PCR cuantitativa
Los tejidos obtenidos a partir de los cánceres colorrectales resecados y el tejido normal correspondiente se homogeneizaron y el ARN total extraído por medio de reactivo TRIzol (Life Technologies) y mini kit RNeasy (Qiagen). ARN total fue extraído de células de cáncer colorrectal a partir de las 6 líneas celulares usando el kit RNeasy mini (Qiagen). El ARN se transcribió de forma inversa usando el kit QuantiTect transcripción inversa (Qiagen). reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (QRT-PCR) se realizó utilizando Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). muestras por triplicado se analizaron en un equipo LightCycler 480 (Roche Diagnostics). los niveles de expresión génica se calcularon utilizando el método 2
-DDCt utilizando la media geométrica de 2 genes de limpieza. ß-actina y β-2-microglobulina como normalisers porque generan la mejor puntuación cuando se comparan con los carcinomas de mucosa normal [27, 28]. Primers se enumeran en la Tabla S1.
inmunofluorescencia
Los tejidos fijados fueron incluidos en parafina y se cortaron en secciones de 4 micras. Los portaobjetos se deparaffinised en xileno, se rehidrataron en alcoholes graduados y se incubó en solución tampón de citrato (pH = 6) durante 10 minutos en una olla a presión.
células de cáncer colorrectal a partir de las 6 líneas diferentes de células se cultivaron durante 4 días en portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina, se lavaron con PBS y se fijaron con acetona enfriada con hielo durante 10 minutos.
Ambas secciones de tejido y toboganes de línea celular de cáncer colorrectal se bloquearon con bloque de CAS (Life Technologies) durante 1 hora a la temperatura ambiente antes de la incubación durante la noche a 4 grados con anticuerpos primarios, EPHB2 (amp; I + D, AF467, 1/50), ERBB3 (Abcam, ab93739, 1/200), KI-67 (DAKO, M7248, 1/50), MUC2 (Abcam, ab11197, 1/200) y (señalización celular, 9706S, 1/100) P-H3. Los portaobjetos se lavó y se expone después a Alexa Fluor 488 burro anti-IgG de cabra, Alexa Fluor 568 burro anti-IgG de ratón o Alexa Fluor 637 burro anti-IgG de conejo (Invitrogen, 1/500) durante 1 hora y contratinción con DAPI. Fluorescente imágenes fueron tomadas en un microscopio confocal Nikon C1 (Nikon, Japón). intensidad de la iluminación, la exposición, offset y ajustes de ganancia se mantuvieron entre las muestras. La distribución de EPHB2 y ERBB3 en las células tumorales se cuantificó mediante la adopción de seis imágenes representativas de cada tumor (n = 15 tumores). Alrededor de 3500 células por tumor se contaron manualmente utilizando el software de análisis de imagen contador de células FIJI. La cuantificación de las células P-H3 + y su localización en las poblaciones de células EPHB2 o ErbB3 se llevó a cabo utilizando el escáner de diapositivas de inmunofluorescencia multiplexación Aperio FL. imágenes fluorescentes de las secciones de tejidos enteros (n = 8 tumores) se tomaron y se cuantificaron todas las células P-H3 (alrededor de 100 a 200 P-H3 + células por tumor) y localizada dentro de las diferentes poblaciones de células.
Estadística análisis
Doblar cambios entre muestras tumorales y normales emparejados fueron calculados como la relación de la expresión de genes en el tumor en comparación con normalidad. Debido a que los niveles de expresión de genes absoluta no se distribuyen normalmente, se utilizaron pruebas no paramétricas. Las asociaciones entre la expresión génica se evaluó a través de Wilcoxon de pares emparejados firman el test de rangos. Para probar la importancia de los cambios veces, se realizó una muestra, de dos caras pruebas t de el logaritmo natural de las veces los cambios = 0. Las asociaciones por medio de correlaciones de rangos de Spearman. El modelo de regresión lineal, utilizando el logaritmo de los cambios marcador de plegado como la variable dependiente, se utilizaron para investigar la asociación entre la expresión del marcador y las características del tumor. etapa del tumor, T, N y M fases y el grado tumoral se incluyeron como variables con coeficientes considerados significativos si el valor de p fue inferior a 0,05.
Resultados
Expresión de ERBB3 y de células madre intestinales Los marcadores son elevados en el cáncer colorrectal en comparación con los tejidos normales emparejados
La población del estudio consistió en 53 pacientes (características de los pacientes en la Tabla S2). lesiones intestinales se caracterizaron como pre-cancerosos en 4 pacientes cancerosos y en 49 pacientes. La expresión de todos los marcadores, tal como se evaluó mediante qRT-PCR, se detectó en todos los tejidos normales y tumorales.
Los niveles de expresión de ERBB3 en tejidos de cáncer en comparación con los tejidos normales emparejados fueron muy variables, que van desde 0,06 a 60.2- doble cambio, respectivamente (figura 1). 38,8% (19/49) de los tumores ha aumentado los niveles de expresión ERBB3 (& gt; 2 veces) en comparación con los tejidos normales emparejados (Figura 1). La mediana del nivel de expresión en adenocarcinomas ERBB3 (0,141) fue significativamente mayor que en los tejidos normales (0,079) (prueba de Wilcoxon de pares emparejados, p & lt; 0,0005) (Fig 1). Resultados similares se obtuvieron en los adenomas en comparación con los tejidos normales, aunque la diferencia no alcanzó significación estadística (prueba t de pareja de Student, p = 0,061), probablemente debido al bajo número de muestras de adenoma en esta cohorte de pacientes (n = 4) (figura 2A ). El valor medio del logaritmo de las veces el cambio (0,587) fue significativamente diferente de 0 (p = 0,009, una muestra de t-test). El modelo de regresión lineal indicó que los niveles de expresión ERBB3 también fueron significativamente mayores en los tumores en estadio IV en comparación con los tumores en estadio I (coeficiente = 1,36, (intervalo de confianza del 95% (IC) 0,07, 2,64), p = 0,039, datos no mostrados). No hubo otras relaciones significativas entre los niveles de expresión de ErbB3 y marcadores clínicos como el estadio de la enfermedad, el grado y estadios TNM. El aumento de expresión de ERBB3 en adenomas y adenocarcinomas en comparación con los tejidos normales fue confirmada por inmunohistoquímica (Fig 2B). ERBB3 se localizó predominantemente a la superficie celular apical y basolateral de las células epiteliales intestinales normales y no se detectó en la superficie celular en la mayoría de los tumores con un poco de tinción citoplásmica difusa aparente en unos pocos casos (S1 FIG).
Quantitative en tiempo real PCR resultados se expresan con respecto al tejido normal correspondiente para cada adenocarcinoma (n = 50). Los insertos muestran diagramas de caja que comparan los valores absolutos de la expresión génica en normal (N) y los tejidos tumorales (T). * Diferencia significativa en comparación con el control de los tejidos (Wilcoxon rank test muestra, p & lt; 0,001) guía empresas
(A):. Los niveles de expresión promedio (2
-ΔΔCt) para cada gen se calculó con relación a beta-2-microglobulina y los niveles de expresión de ß-actina de QRT-PCR en tejidos de colon normales (n = 54), adenomas colorrectales (n = 4) y adenocarcinomas de colon (n = 54) (media ± SEM). No se observaron diferencias significativas (*) en comparación con los tejidos de control (prueba t de Student pareada, p & lt; 0,001). (B): Detección inmunohistoquímica de ERBB3 y EPHB2 en el tejido normal de colon, adenoma y adenocarcinoma. Barra de escala, 50 micras.
La expresión de múltiples marcadores de células madre intestinales se investigó (LGR5, EPHB2, CD44s y CD44v6). CD44s es una isoforma común a todas las variantes de CD44 y se ha utilizado para identificar las células madre putativas en múltiples tipos de tejidos. Un estudio reciente sugiere que CD44v6, que incluye variante exón 6, era un regulador importante de las células madre intestinales y la formación del cáncer por lo que también analizado esto en nuestros estudios [29, 30]. LGR5, EPHB2, CD44s y CD44v6 fueron significativamente hasta reguladas en tejidos de cáncer en comparación con los tejidos normales (aumento medio de 9,4 veces, 3,5 veces, 3,0 veces y 6,4 veces, respectivamente, todos los valores de p & lt; 0,0005; uno t-muestra las pruebas de valores registrados = 1) (figura 1). Se obtuvieron resultados similares en adenomas comparación con los tejidos normales (Fig 2A). Los niveles de expresión de LGR5, EPHB2, CD44s y CD44v6 se incrementaron por lo menos 2 veces en el 70,8% (34/48), 72,0% (36/50), 66,0% (33/50) y 86,0% (43/50) de tumor tejidos en comparación con los tejidos normales emparejados (Figura 1). El aumento de expresión de EPHB2 en adenomas y adenocarcinomas en comparación con los tejidos normales fue confirmada por inmunohistoquímica y fue claramente localizado en el tejido tumoral epitelial (Fig 2B). los niveles de expresión EPHB2 fueron significativamente mayores en el estadio III, pero no la etapa IV, los tumores en comparación con los tumores en estadio I (CI Coeficiente = 1,47 (95% 0,30, 2,64), p = 0,015). No hubo otras relaciones significativas entre la expresión de marcadores de células madre y clínicos.
ERBB3 se correlaciona positivamente con marcadores de células madre intestinales en el cáncer colorrectal y cáncer colorrectal líneas celulares
Las correlaciones entre el ARNm pliegue cambios ( adenocarcinoma
vs
normal) de los marcadores descritos en la Tabla 1 se evaluó mediante la prueba de correlación de rangos de Spearman. marcador de células madre intestinales pliegue cambios (LGR5, EphB2, CD44s y CD44v6) estaban positivamente correlacionadas entre (Tabla 1). Curiosamente, no se encontraron correlaciones positivas entre ERBB3 y marcadores de células LGR5, EPHB2 y CD44v6 (Tabla 1) del tallo. Se obtuvieron resultados similares cuando adenoma y adenocarcinoma se combinaron (S3 Tabla).
Un QRT-PCR análisis de los niveles de expresión y EphB2 ERBB3 también se llevó a cabo utilizando líneas celulares de carcinoma colorrectal 6. Tanto ERBB3 y EPHB2 se detectaron en los distintos niveles de expresión en estas líneas celulares (Fig 3A). Lo más importante, y como se observa en los tumores primarios, la expresión de ERBB3 y EPHB2 se correlacionó positivamente (Figura 3B, Pearson prueba de correlación, rho = 0,999, p & lt; 0,0001)
(A):. El promedio de expresión niveles (2
-ΔΔCt) de ERBB3 y EPHB2 se calcularon en relación a la beta-2-microglobulina y los niveles de expresión de ß-actina de QRT-PCR en 6 líneas celulares de cáncer colorrectal diferentes (n = 3, media ± SEM). (B):. La correlación positiva lineal entre ErbB3 y EphB2 niveles de expresión (prueba de correlación de Pearson, rho = 0,999, p & lt; 0,0001) guía empresas
El cáncer colorrectal se asemeja tejido normal del colon
El positiva correlaciones encontradas a nivel de ARN entre ERBB3 y marcadores de células madre intestinales nos llevó a investigar el potencial de co-localización de ERBB3 y marcadores de células madre intestinales en los tumores. Múltiples anticuerpos dirigidos contra LGR5 (Sigma-Aldrich, HPA012530; Abgent, AP2745; Abcam, ab75850), CD44 (Abcam, ab41478) y EPHB2 (R & amp; D, AF467) fueron probados en colon humano normal y tejidos de cáncer colorrectal. Sólo el anticuerpo anti-EPHB2 policlonal robustamente detecta células EPHB2-positiva en la parte inferior de las criptas colónicas humanas normales (n = 5, la figura 4A) en la que las células madre putativas residen [3]. Por el contrario, se detectaron células positivas ErbB3 dentro del compartimiento de célula diferenciada en la parte superior de las criptas (Fig 4A). Los patrones de expresión de ERBB3 y EPHB2 eran mutuamente excluyentes en el tejido normal de colon. Este patrón también se observó en adenocarcinomas donde ERBB3 y EPHB2 marcaron las poblaciones de células distintas (n = 10) (Fig 4B).
Detección de EPHB2 (verde) y ERBB3 (rojo, A y B) por co-inmunofluorescencia en el colon normal (a) y el cáncer colorrectal (B) (DAPI, azul). Barra de escala, 50 micras.
Estos resultados sugieren que aunque la expresión de marcadores de células madre y ErbB3 intestinal se correlacionan entre sí a nivel de ARN que no marcan las mismas células dentro de los tumores.
ERBB3 y EPHB2 marcan distintas poblaciones de células en el cáncer colorrectal
Hemos tratado de investigar si el patrón de expresión de contraste de ERBB3 y EPHB2 se conserva en varios tumores o si algunos tumores contenían células que co-expresan ambos marcadores. Después de co-inmunofluorescencia y análisis de imágenes, el número de EPHB2 + y células ErbB3 + se cuantificó en 15 cánceres colorrectales (3500 células por tumor). Se identificaron tres tipos diferentes de tumores en función de sus perfiles de expresión. 33,3% (5/15) de los tumores fueron enriquecidos para EPHB2 + células y carecía de células ErbB3 + (Fig 5A, tumores 1-5; figura 5B). 60% (9/15) de los tumores tenía expresión recíproca de EPHB2 y ERBB3 (Fig 5A, los tumores 6-14; Fig 5C y 5D). Un tumor se caracterizó por la ausencia de células EPHB2 + y la presencia de una gran población de células dobles negativas (EPHB2- /ERBB3-, 85,1% de las células cancerosas) (Fig 5A y 5E). Es de destacar que todos los tumores estudiados contenían células dobles negativas (26,4%) de las células tumorales, que van del 6,8% al 85,1% de las células por tumor. La presencia de células que expresan co-EPHB2 y ERBB3 fue rara (células tumorales 2,1%). La expresión de ERBB3 también se investigó en líneas celulares de cáncer colorrectal 6 por inmunofluorescencia (Fig S2A). De acuerdo con los datos de QRT-PCR, ERBB3 se detectó en LIM1215, LIM1899, CaCo2 y células de cáncer de SW480. Es importante destacar que la expresión de ERBB3 fue heterogénea en estas líneas celulares como marcado por la presencia de células ERBB3 + y ERBB3-. Además, en las líneas celulares que contenían una población de células ERBB3 detectable y robusto (LIM1215 y LIM1899), EPHB2 y ERBB3 marcados poblaciones de células distintas (S2B FIG), como se observa en nuestro estudio en los tumores colorrectales humanos. Estos resultados sugieren que las poblaciones de células diferenciadas se encuentran en estas líneas celulares
(A):. Frecuencia de EPHB2 + y células ErbB3 + en el cáncer colorrectal (n = 15). (B, C, D, E): detección de Co-inmunofluorescencia de EPHB2 (verde) y ERBB3 (rojo) en muestras de cáncer colorrectal representativos contrastados con DAPI (azul). Cabe destacar la presencia de una EPHB2- /ERBB3 + células (flecha blanca) en un tumor enriquecido para EPHB2 + /células ERBB3- (B). Obsérvese la presencia de células dobles negativas (flecha blanca) en un tumor que contiene tanto EPHB2 + /ERBB3- y poblaciones EPHB2- /ErbB3 + de células (D). Barra de escala, 50 micras.
En conclusión, nuestros datos sugieren que EPHB2 y ERBB3 identificar diferentes subtipos de cáncer colorrectal, incluyendo tumores de células madre enriquecidas (EPHB2 + /ERBB3-), tumores que contienen mutuamente excluyentes compartimientos (EPHB2 + /ERBB3 +) o tumores que carecen de un compartimento de células madre EPHB2 (EPHB2-).
células
ErbB3 + cancerosas son predominantemente no proliferativa y diferenciada en contraste con las células cancerosas EphB2 +
para definir el proliferativa estado de células ErbB3 + cáncer en cáncer colorrectal primario, los tejidos se tiñeron triple para KI-67, un conocido marcador de proliferación celular, ERBB3 y EPHB2. Sorprendentemente, las células de cáncer rara vez ErbB3 + co-localizada con KI-67 tinción nuclear (Figura 6A y la figura S3). En contraste, en el mismo tumor, las células EPHB2 + eran principalmente positivo para KI-67 (Fig 6A). células negativas dobles (EPHB2- /ERBB3-) también fueron KI-67 positivo. Observaciones similares se encontraron en múltiples tumores (Figura 6B y S4 FIG). Curiosamente, estas observaciones eran una reminiscencia de la condición proliferativa de colon normal ya que los KI-67 + células proliferativas sólo se encontraron en la parte inferior de la cripta donde se localizan las células EPHB2 + (S5 Fig).
(A y B): Detección de EPHB2 (verde), ERBB3 (rojo) y KI-67 (gris) por co-inmunofluorescencia en dos muestras representativas de cáncer colorrectal (DAPI, azul). (C): Distribución de células proliferativas P-H3 + dentro de las 4 poblaciones celulares distintas en muestras de cáncer colorrectal 8. (D y E) detección de EPHB2 (verde), ERBB3 (rojo) y P-H3 (gris) por co-inmunofluorescencia en dos muestras representativas de cáncer colorrectal (DAPI, azul). Barra de escala, 50 micras.
Para confirmar la naturaleza no proliferativa de las células /ErbB3 + EPHB2-, un segundo marcador de proliferación (P-H3), que detecta las células mitóticas, fue utilizada en muestras de cáncer colorrectal 8 que contenía una fuerte población ERBB3 + celular (basado en la figura 4A). Después de co-inmunofluorescencia y análisis de imágenes, el número de células P-H3 + en las cuatro poblaciones de células diferentes (EPHB2 + /+ ERBB3; EPHB2 + /ERBB3-; EPHB2- /ERBB3 +; EPHB2- /ERBB3-) se cuantificó (entre 100-200 P -H3 + células por tumor). 70,0% (del 57,5% al 81,8%) de las células P-H3 + fueron localizados en el EPHB2 + /población ERBB3-, mientras que por el contrario sólo el 8,8% (2,5 a 14,0%) de las células P-H3 + se encuentra en la EPHB2- /ERBB3 + población de células (Fig 6C). -P H3 + células eran raramente doble positivo para EPHB2 y ERBB3 (5,6%) (figura 6C). Imágenes representativas que muestran la localización de P-H3 + células en la población EPHB2 + /ERBB3- celular en 2 tumores diferentes se presentan en la figura 6D y 6E.
Para investigar el estado diferenciado de células /ErbB3 + EPHB2- en el cáncer colorrectal, los tejidos se tiñeron triple para MUC2, un marcador de células caliciformes diferenciadas, ERBB3 y EPHB2. Curiosamente, la mayoría de las células de cáncer colorrectal MUC2 + eran también EPHB2- /ERBB3 + (Fig 7A). Observaciones similares se encontraron en múltiples tumores (figura 7B y S6 FIG). Sin embargo, un sub-grupo de células /ErbB3 + cáncer EPHB2- no fueron positivos para MUC2 en estos tumores (Fig 7A y 7B, flechas blancas). Además, los tumores colorrectales que no contenían ninguna célula MUC2 + todavía tenían una población EPHB2- /ERBB3 + de células (datos no presentados).
Detección de EPHB2 (verde), ERBB3 (rojo) y MUC2 (gris) por co-inmunofluorescencia en dos muestras representativas de cáncer colorrectal (DAPI, azul). Cabe destacar la presencia de células /ErbB3 + EPHB2- (flecha blanca) que son MUC2-. Barra de escala, 50 micras.
En conjunto, estos datos demuestran que las células de cáncer colorrectal ERBB3 + son predominantemente no proliferativa y diferenciada, en contraste con las células EphB2 +.
Discusión
con el fin de definir si la señalización ERBB3 juega un papel en la regulación de las células madre del cáncer colorrectal, la expresión de ERBB3 y marcadores de células madre intestinales fueron investigados en varios tumores colorrectales, incluyendo adenomas y carcinomas en etapa temprana (etapa I-IV). Encontramos una elevación significativa de los niveles de mRNA en ERBB3 adenomas colorrectales y cáncer en comparación con los tejidos normales. Se obtuvieron resultados similares para LGR5, EPHB2, CD44s y CD44v6, de acuerdo con estudios anteriores. [4, 5, 8] En conjunto, estos datos sugieren que la expresión de ERBB3 y el vástago marcadores de células se elevan a lo largo de las etapas progresivas de la carcinogénesis. Lo más interesante, se determinó que ERBB3 y varias moléculas que marcan las poblaciones de células madre se correlacionan positivamente en el nivel de ARN en el cáncer colorrectal.
Este hallazgo nos llevó a investigar si ERBB3 estaba presente en la población de células madre dentro de los tumores. Se analizó si EPHB2, un marcador de células madre definido, co-localizado con la expresión ERBB3 en tejidos de cáncer colorrectal. Esto reveló tres subconjuntos diferentes de cáncer en base a i) el enriquecimiento de células EPHB2 + y la falta de ERBB3 + células, ii) la ausencia de células EPHB2 + o iii) la presencia de tanto ERBB3 + y poblaciones EPHB2 + celulares de cáncer. En el subgrupo más tarde, ERBB3 y EPHB2 marcados diferentes poblaciones de células que se excluyen mutuamente con potenciales proliferativos distintos, la mayoría de las células ErbB3 + ser no proliferativa. Sorprendentemente, estos resultados revelaron que aunque hubo una correlación positiva entre la expresión de ERBB3 y EPHB2 a nivel del ARN, estos dos marcadores no estaban presentes en las mismas células. Curiosamente, se detectó expresión de ERBB3 y EPHB2 en dominios distintos en el epitelio del colon normal donde EPHB2 marcado células madre y progenitores proliferantes en la parte inferior cripta y ERBB3 marcaron el compartimiento de célula diferenciada no proliferativa en la parte superior de las criptas intestinales. Nuestros resultados muestran que la mayoría de los cánceres colorrectales que examinamos se asemejan a tejido normal con compartimentos celulares distintos y la condición proliferativa y que un EPHB2 firma dual /ERBB3 podría identificar tumores con esta morfología. Un patrón similar de expresión se ha observado en los cánceres colorrectales utilizando EPHB2 y citoqueratina 20 como un marcador de la diferenciación [8, 31]. Curiosamente, los niveles de expresión de citoqueratina 20 se redujeron reguladas en tejidos de cáncer colorrectal en comparación con los tejidos normales, en contraste con ERBB3 en nuestros estudios, lo que sugiere un papel más complejo para ERBB3 [8]. En consonancia con el perfil de expresión de ERBB3, los niveles de expresión de PMEPA1, que es un marcador de las células diferenciadas terminalmente que se encuentran exclusivamente en la superficie de las criptas epiteliales del colon, se incrementan en los tumores de colon en comparación con tejidos normales [32], lo que sugiere que las moléculas que marcan población de células diferenciadas puede también ser elevado en algunos casos, durante la carcinogénesis colorrectal.
Nuestros resultados indican que la orientación ERBB3 en el cáncer colorrectal utilizando anticuerpos monoclonales, que se encuentran actualmente en fase de desarrollo [13], puede dirigirse a las células diferenciadas y contribuir a la eliminación de la mayor parte del tumor, pero no puede afectar a la población de células madre-como el cáncer proliferativa. Esto aún no se ha probado experimentalmente. La destrucción de células de cáncer colorrectal diferenciadas puede ser beneficioso ya que estas células han sido recientemente descrito como importante mediador de la resistencia a la terapia [33] y pueden proteger a las células iniciadoras de tumores del agente de quimioterapia irinotecán debido a sus capacidades-expulsión de drogas [33]. Sería interesante para definir si la población de células diferenciadas descrito por Emmink
et al
. se superpone con la ERBB3 + población diferenciada. Además, estas células ErbB3 no proliferativa + todavía pueden tener un papel que desempeñar en la recurrencia del tumor, ya que se ha informado que las células intestinales post-mitótico puede de-diferenciable, la adquisición de células madre como las propiedades e iniciar la génesis tumoral en algunos casos [34]. niveles
elevados de expresión ERBB3 se han asociado con una disminución de la supervivencia del paciente en el cáncer colorrectal [20, 21]. Parece crucial definir si estas células ErbB3 + son importantes motores de la carcinogénesis y si actúan mediante el apoyo a la población de células madre o directamente asociado contribuir a una disminución en la supervivencia del paciente.
En resumen, nuestros resultados muestran que la expresión elevada de ERBB3 y marcadores de células madre intestinales son características comunes de los cánceres colorrectales y identificar tumores que contienen diferencian las poblaciones de células no proliferativas distintas de las regiones proliferativas donde las células madre de cáncer residen. Basado en la expresión de marcador de células madre EPHB2 y el marcador de diferenciación ERBB3, tentativamente proponemos que los cánceres colorrectales se organizan en i) de tallo como tumores de células enriquecida, ii) los tumores diferenciados con un compartimiento de células madre similares a o iii) que carecen de un EPHB2 madre compartimento celular.
Apoyo a la Información
S1 Fig. ERBB3 se encuentra predominantemente en la membrana en los adenocarcinomas.
La detección inmunohistoquímica de ERBB3 en muestras de cáncer colorrectal 7 muestra una tinción de membrana fuerte predominante (A-D) o ambos tinción citoplasmática y la membrana (E-G) difusa. Barra de escala, 50 micras
doi:. 10.1371 /journal.pone.0138336.s001 gratis (TIF)
S2 Fig. ERBB3 se expresa de forma heterogénea en líneas celulares de cáncer colorrectal gratis (A):. Detección de inmunofluorescencia de ERBB3 (rojo) en 6 líneas celulares de cáncer diferentes, contrastados con DAPI (azul). (B): Expresión de ERBB3 (verde) y EPHB2 (rojo) en líneas celulares de cáncer de LIM1215 y LIM1899 a contratinción con DAPI (azul). Barra de escala, 50 micras
doi:. 10.1371 /journal.pone.0138336.s002 gratis (TIF)
S3 Fig. células de cáncer colorrectal positivas ErbB3 son predominantemente no proliferativa.
detección de Co-inmunofluorescencia de KI-67 (verde) y ERBB3 (rojo) en dos diferentes muestras de cáncer colorrectal contrastados con DAPI (azul). Barra de escala, 50 micras
doi:. 10.1371 /journal.pone.0138336.s003 gratis (TIF)
S4 Fig. células de cáncer colorrectal positivas ErbB3 son predominantemente no proliferativa en contraste con las células EPHB2 positivos.
detección Co-inmunofluorescencia de KI-67 (verde), ERBB3 (rojo, A, C, E) y EPHB2 (rojo, B, D, F) en tres diferentes muestras de cáncer colorrectal, DAPI (azul). Barra de escala, 50 micras
doi:. 10.1371 /journal.pone.0138336.s004 gratis (TIF)
S5 Fig. células positivas EphB2 son KI-67 positivo en el colon humano normal.
detección de Co-inmunofluorescencia de EPHB2 (verde) y KI-67 (rojo) en el tejido normal del colon (DAPI, azul). Nótese la ausencia de 67 Ki-células positivas en el compartimiento diferenciada (flecha blanca). Barra de escala, 50 micras
doi:. 10.1371 /journal.pone.0138336.s005 gratis (TIF)
S6 Fig.