Resumen
Los inhibidores de la histona deacetilasa (HDACi) representan una clase prometedora de agentes epigenéticos con propiedades anticancerígenas. En este caso, nos informan de que (S) -2, un HDACi basada en la novela de hidroxamato, previamente demostrado ser eficaz contra las células de leucemia mieloide aguda, era también un potente inductor de la apoptosis /diferenciación en células LNCaP de cáncer de próstata PC3 y humanos. En las células LNCaP (S) -2 era capaz de desencadenar H3 /H4 acetilación de histonas, la fosforilación H2AX como marcador de daño del ADN y la producción de G
0 G detención del ciclo /
1 celular. Consistentemente, (S) -2 llevado a una mayor expresión de la proteína y ARNm de los niveles de p21 en las células LNCaP, pero, al contrario de SAHA, no en las células PNT1A próstata no tumorigénicas normales. Estudios mecanicistas demostraron que (S) apoptosis en células LNCaP desarrolladas a través de la escisión de pro-caspasa 9 y 3 y de poli (ADP-ribosa) -2-inducida polimerasa acompañada por la pérdida dependiente de la dosis del potencial de membrana mitocondrial. De hecho, la adición de la pan-caspasa inhibidor Z-VAD-fmk reduce en gran medida la apoptosis mediada por fármaco, mientras que el antioxidante
N
-acetil-cisteína era prácticamente ineficaz. Es importante destacar que, los datos preliminares con ratones desnudos xenoinjertados con células LNCaP mostraron que -2 (S) provocó una disminución en el volumen del tumor y un aumento en la fosforilación de H2AX dentro de las células cancerosas. Por otra parte, las células PC3 de cáncer de próstata altamente metastáticas también fueron sensibles a (S) -2 que: i) la detención del crecimiento inducida por la apoptosis y moderada; ii) las células hacia la diferenciación y la acumulación de lípidos neutros dirigido; iii) la reducción de potencial de invasión de células por la disminución de la cantidad de actividad de MMP-9 y hasta la regulación de TIMP-1 de expresión; y iv) inhibió la motilidad celular y la migración a través del Matrigel. En general, (S) -2 ha demostrado ser un potente HDACi capaces de inducir la detención del crecimiento, la muerte celular y /o diferenciación de células LNCaP y de cáncer de próstata PC3 y, debido a su baja toxicidad y la eficacia
in vivo
, también puede ser de interés clínico para apoyar la terapia del cáncer de próstata convencional
Visto:. Laurenzana a, M Balliu, Cellai C, Romanelli MN, Paoletti F (2013) Eficacia del inhibidor de histona deacetilasa (S) -2 contra el cáncer de próstata LNCaP y PC3 células Humanas. PLoS ONE 8 (3): e58267. doi: 10.1371 /journal.pone.0058267
Editor: Chunhong Yan, Albany Medical College, Estados Unidos de América
Recibido: 16 de abril, 2012; Aceptado: 5 Febrero 2013; Publicado: 4 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Laurenzana et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de MIUR (Ministerio de Educación, Universidades e Investigación PRIN 2006 para FP,#200606139), la Universidad de Florencia, Italia (ex 60% de 2009 y 2010 para FP y MNR), Ente Caja de Ahorros de Florencia 2007- 9 (Florencia, Italia;#2007,1019 al FP) y la Asociación Italiana de contro le leucémie, Linfomi e Mieloma (AIL) sezione di Firenze en FP. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los cambios epigenéticos son reordenamientos cromatina reversibles capaces de modular la expresión de genes dentro de la célula sin modificar la secuencia de ADN. La acetilación es el más ampliamente estudiado modificación post-traduccional de las proteínas histonas [1] debido a la actividad equilibrada de dos familias de enzimas, a saber, las histona acetiltransferasas (HAT) y desacetilasas de histonas (HDAC) que catalizan la acetilación /desacetilación de las histonas, respectivamente , y modificando de este modo la conformación de la cromatina y la accesibilidad de ADN para la transcripción factores [2], [3], [4]. Por otra parte, los sombreros y las HDAC contribuyen a la modulación de la expresión génica mediante la interacción directa con proteínas reguladoras clave nonhistone [5] como p53, GATA1, GATA2, receptor de ácido retinoico, el NF-kB y proteínas del citoesqueleto como α-tubulina [6], [7], [8]. No es sorprendente, por lo tanto, que las actividades aberrantes de estas enzimas pueden reprimir la transcripción de los genes supresores de onco-específicos y plomo, con el tiempo, a la formación de tumores [9], [10]. Y, en efecto, hypoacetylation histona, debido a la sobre-expresión de las HDAC, tiene un papel reconocido en la tumorigénesis de diferentes tipos de cáncer que afectan el estómago [11], de colon [12], [13], de mama [14] y de próstata [15], [ ,,,0],16], [17].
con respecto en particular al cáncer de próstata, este es el tumor maligno no cutáneo más frecuentemente diagnosticado y la tercera causa principal de muerte por cáncer en los hombres en el mundo occidental. A pesar de que están disponibles para el cáncer de próstata temprano un número de opciones terapéuticas, en pacientes con recaída de tratamiento primario con cirugía y /o radioterapia, o la presentación de enfermedad metastásica, la privación de andrógenos sigue siendo el pilar del tratamiento. Sin embargo, a pesar de la ablación de andrógenos, prácticamente todos los tumores progresan con el tiempo enfermedades resistentes a la castración [18], [19], [20], que necesitan ser tratados con citotóxicos convencionales o agentes epigenéticos tales como los inhibidores de HDAC (HDACI). Estos últimos han emergido como una nueva clase de agentes contra el cáncer potentes capaces de inducir la detención del crecimiento celular tumoral, la diferenciación y /o apoptosis [16], [17]
in vitro
y actuando como sensibilizadores a la radiación en células de cáncer por abajo -regulating la actividad de reparación del ADN [21], [22], [23]. Algunos de estos HDACi mostraron sin embargo varias limitaciones
in vivo
debido a su alta toxicidad, baja solubilidad, y una vida media corta [24], [25]. Por lo tanto, el desarrollo de novedosos HDACi con propiedades anticancerígenas y perfiles de baja toxicidad es un objetivo fundamental de la investigación traslacional.
Hemos informado anteriormente de un nuevo conjunto de HDACi a base de hidroxamato potente que se caracteriza por un anillo de 1,4-benzodiazepina ( BDZ) utilizado como la tapa y vinculado, a través de una unidad de conexión triple enlace, a una cadena de alquilo lineal que lleva una función hidroxámico como el Zn
++ - grupo [26] quelante. Entre estos híbridos, uno en particular, MC133 (S) -2 [
en adelante (S) - página 2] demostró ser un agente pro-apoptótica muy eficaz hacia diferentes leucemia mieloide aguda cultivadas y células primarias (AML)
in vitro
y
ex vivo, y era prácticamente seguro que los ratones
in vivo
hasta 150 mg /kg /semana [27].
en el presente estudio se analizó el potencial antitumoral de (S) -2 en dos de las líneas más ampliamente investigados humanos de células epiteliales de cáncer de próstata LNCaP, a saber, el andrógeno-sensibles, y el PC3 andrógeno-insensible y altamente metastásico, mediante el uso de los recursos humanos PNT1A próstata no tumoral células epiteliales como el control. (S) -2 proliferación de las células del cáncer de próstata inhibido, indujo una mayor respuesta de apoptosis en comparación con SAHA (o vorinostat, uno de los de mejor rendimiento HDACi aprobado por la FDA para el tratamiento del linfoma cutáneo de células T) [28], [29] en células LNCaP y en menor medida también en células PC3 altamente metastásicos cuya migración y la invasividad propiedades se redujeron drásticamente por la droga. En contraste, las células de la próstata PNT1A epiteliales normales eran prácticamente insensible fármaco. Es importante destacar que la apoptosis, (S) -2-inducida en las células LNCaP desarrolla a través de un mecanismo dependiente de caspasas.
Materiales y Métodos
Cultivo celular y tratamientos
no metastásico LNCaP y metastásico las células de cáncer de próstata PC3, y las células epiteliales de próstata PNT1A nontumorigenic humanos eran una especie de regalo de P. Chiarugi (Dept. Ciencias bioquímicas, Universidad de Florencia) que obtuvo las líneas celulares de la Colección Europea de cultivos celulares [30]. células de próstata humano se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS). Las células se mantuvieron a 37ºC en 5 °% de CO
2 atmósfera humidificada. (S) -2 y SAHA (o vorinostat; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) [28], [29] se disolvieron en dimetil sulfóxido (DMSO; Sigma-Aldrich) a una concentración de 0,1 M y se almacenan en la oscuridad a temperatura ambiente (TA). De trabajo soluciones de fármacos se obtuvieron por dilución apropiada de la solución madre con el medio de cultivo. DMSO se empleó como el vehículo en una dosis final de ≤0.1% (v /v) en cultivo durante tanto (S) -2 y SAHA. En la caspasa experimentos de inhibición Z-VAD-FMK (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.) y el antioxidante N-acetil cisteína (NAC; Sigma-Aldrich) se añadieron en cultivo 2 h antes de la (S) -2 Además.
Análisis de Ciclo celular
Las células prostáticas fueron tratados durante 24 h sin /con 2,5 M de drogas, y luego se volvió a suspender en una solución de yoduro de propidio /RNasa (BD PharMingen, San Diego, CA) y se incubó a RT en la oscuridad durante 15 a 30 min. Los porcentajes de células en relación con G
0 /G
1, G
2 /M, y la fase S se determinaron con la ayuda del sistema de citómetro Becton Dickinson.
transferencia Western
Las células recogidas se resuspendieron en tampón 20 RIPA mM (pH 7,4) que contiene un cóctel de inhibidores de proteinasa (Calbiochem, Merck, Darmstadt, Alemania) y se trataron por ultrasonidos (Microson XL-2000, Minisonix, Farmingdale, NY, EE.UU.) . Las proteínas se analizaron por el ensayo de proteína BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL, EE.UU.), se analizaron por SDS-PAGE y Western Blot como se informa en otro lugar [31]. Las membranas se sondearon con anticuerpos primarios contra: acetil-H3, la acetil-H4, y H4 (Upstate Biotechnology, Millipore, Bilerica, MA, EE.UU.); PARP, γ-H2AX, H2AX, H3 y caspasa 9 (Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA, EE.UU.); α-tubulina acetilada y α-tubulina (Sigma-Aldrich), caspasa 3 y p21 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.). preparaciones de IgG conjugados con peroxidasa adecuados (Sigma-Aldrich) se han utilizado como anticuerpos secundarios; se empleó el procedimiento de ECL para el desarrollo.
La cuantificación de la membrana mitocondrial potencial
Para determinar los cambios en la membrana mitocondrial transmembrana inducida por el fármaco potencial (Δψm), las células se han teñido con JC-1 (Invitrogen , Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.), un colorante catiónico que presenta una acumulación dependiente del potencial en las mitocondrias, indicado por un cambio de la emisión de fluorescencia de verde (525 ± 10 nm) a rojo (610 ± 10 nm). células LNCaP (0,5 x 10
6) fueron tratados sin /con 2,5 y 5 M (S) -2 durante 72 h y después se resuspendió en RPMI 1640 que contienen 15 mg /ml de JC-1 de colorante durante 30 min a RT en la oscuridad; después de que las células se lavaron y se midió la fluorescencia por citometría de flujo. despolarización Las mitocondrias se indica específicamente por una disminución en el rojo a la proporción de intensidad de fluorescencia verde [32].
caspasa 3 Ensayo de Activación
células de cáncer de próstata (10
5 células /ml) fueron se incubaron con 2,5 M (S) -2 durante 48 h y después se somete al ensayo de carboxifluoresceína FLICA Kit de detección de apoptosis de la caspasa (caspasa 3 FLICA, Tecnología inmunoquímica, Bloomington, MN, EE.UU.). Las células se tiñeron con reactivo FAM-DEVD-FMK FLICA disuelto en PBS durante 1 h a 37 ° C, y se lavaron dos veces en PBS antes de realizar el ensayo citofluorimétrico.
Gel Zymography
Análisis de gelatinasa se llevó a cabo (MMP-9) la actividad como se describe anteriormente [33]. Brevemente, las células PC3 se sembraron en placas de 6 pocillos y se trataron con el aumento de cantidad de (S) -2 en medio libre de suero durante 24 h. Partes alícuotas de medio condicionado (CM) se mezclaron con 4 x (v /v) de tampón de muestra (0,25 mol /l de Tris-HCl, pH 6,8, 0,4% SDS, 40% de glicerol y azul de bromofenol), y luego cargados en un 10% SDS gel que contiene 1 mg /ml de gelatina (Sigma-Aldrich) y ejecutarse bajo condiciones no reductoras en el voltaje constante de 125 V. Después de la electroforesis, el gel se incubó en tampón de renaturalización (2,5% Triton X-100) a TA durante 30 min , se lavó dos veces con agua destilada (10 min cada vez), y después se incubaron con el tampón de desarrollo (50 mmol /l de Tris pH 8,0, 5 mmol /l CaCl
2, 0,2 mol /l de NaCl y 0,02% de Brij-35 ) a 37ºC ° durante la noche, se tiñeron en solución de azul de Coomassie al 0,5% durante 2 h y se destiñeron con una solución de [ácido acético al 5%, 10% de metanol (v /v) en agua destilada] hasta que las bandas de actividad gelatinolítica se visualizaron y luego midieron por análisis densitométrico con la imagen J Software.
Ensayo
células PC3 de curación de heridas se cultivaron en placas de 6 cm hasta confluencia y luego la monocapa se rayó con una punta de pipeta estéril fino para producir una estrecha de la herida en el sustrato. El medio y los residuos se aspiraron de distancia y se reemplazaron con medio fresco en presencia de diferentes concentraciones de (S) -2. Fotos fueron tomadas antes y 24 horas después de la herida con la ayuda de un photocamera Nikon E 4500 (Nikon) en una Nikon TMS-F-microscopio de contraste de fase (Nikon Instruments, Florencia, Italia).
invasividad Ensayo
Para estos experimentos se utilizaron Boyden cámaras en las que los pocillos superiores e inferiores se separaron por filtros porus de policarbonato recubiertas con Matrigel (50 mg /filtro) (Becton Dickinson, BD, New Jersey, EE.UU.). Los cultivos se trataron previamente con /sin (S) -2 (2,5-5 M) durante 24 h y luego alícuotas de células PC3 (20 × 10
3) se transfirieron en el compartimiento superior de la cámara. capacidad invasiva de las células se evaluó después de 6 h y se expresó como el número absoluto ± SD de células presentes en los filtros; cinco campos microscópicos diferentes para cada condición se han examinado.
Oil Red O tinción de lípidos neutros
Se detectaron los lípidos neutros (i) histoquımicamente [34] en monocapas celulares que se fijaron rápidamente con? -? 0 ° C metanol, se tiñeron con Oil Red O (ORO) (Sigma-Aldrich), y (ii) espectrofotométricamente (Cary 50 Scan, Varian, Victoria, Australia) a 510 nm mediante el registro de la absorbancia de ORO después de la extracción unido a la célula con isopropanol [35], [36]. acumulación ORO se expresó como unidades de absorbancia relativa /mg de proteína celular.
Quantitative Real-Time PCR Análisis
QRT-PCR se realizó con marcha atrás transcritos de ADNc de células sin tratar y tratados mediante la 7500HT de Applied Biosystems Sistema de acuerdo con protocolos estándar. Pliegue de p21, MMP-9 y TIMP-1 inducción se calcularon los cambios en los valores de TIMP-1 Ct p21 o MMP-9 o en
frente
células tratadas y no tratadas se normalizaron a la 18S rRNA amplificación se Ct realizado con el ajuste de la PCR por defecto: 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y de 60 ° C durante 60 segundos utilizando una detección basada en SYBR Green (Master mix SYBR Green; Applied Biosystems) y los siguientes cebadores: para p21, delantero 5 ' -CTGCCCAAGCTCTACCTTCC-3 '? y revertir 5'-CAGGTCCA CATGGTCTTCCT-3'; para la MMP-9 hacia adelante 5'-GCTACCACCTCGAA CTTTGAC-3 'y revertir 5'-TGCCGGATGCCATTCAC-3'; de TIMP-1, adelante 5'-CCAACAG TGTAGGTCTTGGTGAAG-3 'y revertir 5'-CTGTGGCTCCCTGGAACA-3'; y de 18S rRNA, delantero 5'CGGCTACCACATCCAAGGAA-3 '? y revertir 5'-GCTGGAATTACCGCGGCT-3'.
Preliminar
in vivo
Experimentos con un modelo de xenoinjerto murino
el protocolo y los resultados con respecto a esta primera aproximación al
in vivo
experimento ha sido reportado en la sección de información de apoyo (Figura S1).
Análisis estadístico
el Student
t-test o
solo sentido el análisis de varianza se utilizó para evaluar la significación estadística de los resultados. La diferencia entre los valores se consideró significativo a
P ≤ 0,05
.
Resultados
(S) -2 provoca que las células LNCaP a G
0 /G
1 del ciclo celular detención y cambios en la morfología
células LNCaP, cultivadas sin /con el aumento de (S) -2 concentraciones (1, 2,5 y 5 M) hasta las 72 h, se sometieron a una dosis-y tiempo-dependiente detención del crecimiento para alcanzar el 50% de inhibición después de dos días de incubación con 1-2.5 M (S) -2; mientras que en los cultivos tratados con 5 M el número de células viables disminuyó significativamente a niveles muy por debajo de la densidad de placas de partida (Figura 1A). El efecto de la (S) -2 sobre la progresión del ciclo celular LNCaP tal como se mide por citometría de flujo mostró que un 24 h-exposición a 2,5 M de drogas aumentó significativamente el porcentaje de células en G
0 /G
1 (de 59 a 93%) y la disminución de la población de células en fase S (29-2%) (Figura 1B, parte superior). En addittion, tras el tratamiento, la morfología típica de las células LNCaP cambió a un fenotipo en forma de huso, bastante ampliada para producir monocapas que se caracterizaron por una pérdida parcial de las células y la reducción de los contactos entre las células residuales (Figura 1B, medio). Consistentemente, la proteína p21 inhibidor del ciclo celular - informado de que hasta modulada por HDACi [37] - aumentada de una manera dependiente del tiempo en respuesta a 2,5 M (S) -2; Se detectó la proteína a partir de 6 h de tratamiento, el aumento después de 15 horas y alcanzó su punto máximo a las 24 h (Figura 1B, parte inferior)
(A) -. Las células (10
5) se sembraron en 6- pocillos y se dejó durante la noche. adjuntar Al día siguiente (S) -2 se añadió a las concentraciones indicadas (0-5 m) y las células viables (tripano blu-negativo) se contó con la ayuda de una cámara de Bürker a lo largo de los siguientes tres días. (B, arriba) - G (S) -2 inducida
0 G
1 la detención del ciclo celular y el aumento de la expresión /p21. células LNCaP (2 × 10
5) fueron tratados con 2,5 mM de drogas durante 24 h, a continuación se separaron y partes alícuotas de suspensiones de células se incubaron con un yoduro de propidio (PI) solución durante 30 minutos y posteriormente se analizaron por citometría de flujo (DNA cantidad, el eje X; eventos totales, eje Y). El porcentaje de células en las diferentes fases del ciclo celular se calculó por el programa ModFit y se muestra en cada panel. (B, centro) - Fase imágenes de contraste de culturas de compañía indicó que (S) -2 indujo cambios morfológicos y una marcada disminución en la densidad celular. (B, parte inferior) - Las células se trataron con 2,5 mM de drogas para los puntos de tiempo indicados y los niveles de proteína p21 fueron monitorizados por inmunotransferencia; También se examinó GAPDH para garantizar la igualdad de carga de muestras en cada carril. (C) - la detención del crecimiento de células LNCaP no era estrictamente dependiente de la presencia continua de drogas. Las células han sido sembradas en placas de 6 pocillos (10
5 células /pocillo) y se dejó que se unieran durante la noche. El día después se añadieron culturas sin /con 2,5-5 M (S) -2 para 3d y luego se reemplaza con medio libre de drogas para 3d adicional y en comparación con las culturas donde la droga se mantuvo constante hasta 6d cuando se contaron las células viables. Cada barra representa la media obtenida de los pocillos por triplicado ± SD.
Además, la detención del crecimiento de LNCaP expuesto a (S) -2 no era estrictamente dependiente de la presencia continua de la droga. Esta hipótesis derivada de la vigilancia del número de células en los cultivos tratados y sin /con 2,5 o 5 M (S) -2 para 3d y luego se reemplaza con medio libre de drogas para 3d adicional, mientras que en las culturas del compañero del fármaco se mantuvo constante durante 6d. Las células se mantuvieron prácticamente detenidos, incluso después de la sustitución medio libre de drogas valores que eran similares a las de las culturas continuamente expuestos a la droga (Figura 1C).
Rendimiento
(S) -2-indujo apoptosis en células LNCaP Depende la activación de la cascada de caspasas e interrupción de la integridad mitocondrial
Entre los primeros eventos inducidos por HDACi a nivel de ADN hubo la formación de doble filamento se rompe (OSD) y la fosforilación de H2AX para producir γ-H2AX que ayuda en daño en el DNA de reparación [38]. La respuesta de las células LNCaP a (S) -2 como se determina por inmunotinción mostró que 2,5 M de drogas aumentó significativamente la señal de γ-H2AX dentro de 6 h y estos niveles eran bastante sostenida hasta 24 h siguiendo un patrón similar a la de las drogas acetil-H4 inducida (Figura 2, arriba). Por otra parte, la aparición de la apoptosis, como marcado por la escisión de la poli sustrato de caspasa (ADP-ribosa) polimerasa (PARP), se detectó a partir de 15 h de tratamiento y aumentó de manera constante hasta 48 h (Figura 2A, parte inferior) cuando alrededor de 80% de células LNCaP mostraron la: (i) mediada por fármacos de activación de la caspasa 3 (Figura 2B) y (ii) cambio dependiente de la dosis en la proporción de fluorescencia JC-1 rojo /verde para indicar una disipación progresiva del potencial transmembrana mitocondrial (ΔΨm ) (Figura 2C)
(a) -. las células se incubaron con el fármaco (2,5, 5 M) para los puntos de tiempo indicados. extractos de células enteras fueron analizados por Western inmunoblot para detectar: fosfo-H2AX, que se activa después de daño en el ADN; PARP y su fragmento escindido para denotan ActivAction apoptosis; y acetil-H4 debido a la inhibición de la actividad HDAC. GAPDH y α-tubulina se utilizaron como controles de carga. (B) - Las células no tratadas o tratadas con el fármaco (2,5 M durante 48 h) se incubaron durante el último 60 min con FAM-DEVD-FMK carboxyfluoresceine, luego se enjuaga dos veces con PBS y su fluorescencia verde se midió por citometría de flujo. El histograma de frecuencias del número de eventos (eje Y)
frente
fluoresceína intensidad (eje X) mostró dos picos: células de caspasa-negativo (células no marcadas) estaban en la izquierda de la región P2; mientras que las células de caspasa-positivas que hayan sido etiquetados con Flica se produjo dentro de la región P2. (C) - El tratamiento con (S) -2 llevado a una disipación dependiente de la dosis potencial transmembrana mitocondrial (ΔΨ). Este efecto se evaluó con la ayuda de JC-1 tinte, que agrega en las mitocondrias normales y emite fluorescencia roja pero no se puede acumular en las mitocondrias, que han perdido su potencial transmembrana, y, por lo tanto, emite una señal verde citoplasmática difusa en las células muertas. despolarización mitocondrial está indicada por una disminución en el rojo /verde relación de intensidad de fluorescencia (/G R) [32]. Los valores han sido normalizados mediante el uso de la señal de control (sólo vehículo) como un valor arbitrario de 100%. Cada barra es la media de dos experimentos independientes realizados por triplicado. (D) - las células LNCaP se trataron con (S) -2 (2,5-5 M) o con (S) -2 (5 mM) más 15 mM de N-acetil cisteína (NAC) se aplica 2 h antes de la adición del fármaco. La activación de la apoptosis fue revelado por la escisión de PARP y la fosforilación de H2AX y estos eventos, así como la acetilación de α-tubulina mediada por fármaco no fueron contrastadas por NAC. GAPDH se usó como la proteína de referencia. (E) - Z-VAD-FMK impidió la disociación inducida por fármacos de la PARP y la fosforilación de H2AX. células LNCaP se trataron como anteriormente, pero, en lugar de NAC, los cultivos se incubaron previamente con 30 mM Z-VAD-fmk durante 2 h antes de ser tratadas durante 24 h con la droga. Los lisados celulares se analizaron para la escisión de PARP, la activación de la caspasa 3 y 9, la fosforilación de H2AX así como la acetilación de H4 y α-tubulina; α-tubulina se utilizó como control de carga.
Además, para investigar el mecanismo de (S) -2 apoptosis inducida en células LNCaP, los efectos de la anti-oxidante N-acetil-cisteína ( NAC) y del inhibidor de pan-caspasa Z-VAD-fmk se examinaron por separado. A diferencia de la informada para las células de AML [27], la presencia de NAC 15 mM en el medio de cultivo no fue capaz de disminuir inducida por fármacos escisión de PARP descartando así un papel importante de especies reactivas de oxígeno (ROS) en la apoptosis mediada por fármacos (Figura 2D). En lugar de ello, los experimentos realizados sin /con 30 M pan-caspasa inhibidor Z-VAD-fmk reveló que este compuesto era capaz de prevenir la activación mediada por fármaco de la caspasa 9 y 3, así como de la escisión de PARP y el aumento de γ-H2AX [ ,,,0],39], lo que sugiere que (S) -2 apoptosis inducida en células LNCaP desarrolladas a través de un mecanismo dependiente de caspasa (Figura 2E). Vale la pena señalar que la acetilación inducida por fármacos de H4 y α-tubulina no se vio obstaculizado por la Z-VAD-FMK.
(S) -2 dirige a las células LNCaP, pero no las células normales de la próstata PNT1A
El valor de la traducción potencial de (S) -2 se evaluó mediante la comparación de las actividades tanto de (S) -2 y SAHA con respecto a la inducción de la apoptosis y la acetilación de la histona en las células LNCaP y las células epiteliales de próstata PNT1A inmortalizadas normales. (S) -2 se le solicite un marcado aumento en los niveles de fragmento de PARP escindida, γ-H2AX y acetil-H3 en las células LNCaP con mucha mayor eficacia que SAHA (Figura 3A, izquierda). Por otra parte, (S) -2 parecía ser relativamente seguro para las células normales PNT1A que, en cambio, eran un objetivo sensible de SAHA como lo revela la división de PARP tras el tratamiento con drogas 5 M (Figura 3A, derecha), mientras que los niveles de acetil-H3 en PNT1A células se mantuvieron relativamente constante independientemente de cualquiera de los inductores
(a) -. se incubaron las células LNCaP y PNT1A durante 24 h con cantidades cada vez mayores de cualquiera de (S) -2 y SAHA. Los extractos celulares se sometieron a inmunotransferencia para detectar fosfo-H2AX, PARP y su fragmento escindido y acetil-H3; a-tubulina se utilizó como control de carga. (B) - los niveles de ARNm de p21 a partir de células LNCaP y PNT1A incubadas con /sin (S) -2 o SAHA por 24 h se midieron por cuantitativa en tiempo real PCR. células PNT1A normales fueron aparentemente menos sensible a la (S) -2, en comparación con SAHA. Columnas, promedio de tres muestras independientes: bares ± SD; diferencia significativa (
P
≤0.05). (C) -. PARP división y los niveles de γ-H2AX inducida en células LNCaP y PNT1A por una h-tratamiento 24 con /sin (S) -2, se compararon en el mismo blot
Además, el crecimiento arresto en (S) -2 tratados con células LNCaP se asoció con un marcado incremento dependiente de la dosis (7-13 veces) en los niveles de ARNm de p21 que también se ve reforzada por SAHA aunque con una progresión menos dependiente de la dosis (Figura 3B, izquierda) . Cabe señalar que la expresión de p21 en las células no se vio afectada por PNT1A (S) -2, mientras que sorprendentemente hasta reguladas por 5 M SAHA (Figura 3B, a la derecha). Por otra parte, los resultados obtenidos mediante la comparación en el mismo blot los efectos de (S) -2 en las células LNCaP y PNT1A han demostrado claramente que LNCaP fueron definitivamente más sensibilidad que células normales PNT1A en términos de la escisión de PARP y los niveles de γ-H2AX (Figura 3C) .
(S) -2 induce la detención del ciclo celular, la apoptosis y la diferenciación de las células PC3
El efecto de (S) -2 sobre la proliferación de las células PC3 de cáncer de próstata altamente metastáticas también ha sido evaluado. Las células cultivadas durante tres días sin /con cantidades crecientes de (S) -2 sometió a una inhibición dependiente de la dosis de la proliferación (Figura 4A) de acuerdo con el aumento significativo de la proporción de células detenidas en G
0 /G
1 fase (46-75%) y la disminución (de 40 a 15%) de células en fase S (Figura 4B). Consistentemente, p21 fue significativamente hasta reguladas a las 15 y 24 h de tratamiento (Figura 4C). De interés, (S) -2-indujeron niveles de acetil-H3 ya se han mejorado a las 24 h, y se elevaron aún más a las 48 h, justo cuando el efecto de SAHA comenzó a declinar (Figura 4D).
(A) - Las células (10
5) se sembraron en placas de 6 pocillos y se dejó que se unieran durante la noche. El día después (S) -2 se añadió a las concentraciones indicadas y número de células se determinó a lo largo de los próximos tres días. (B) - Las células se incubaron durante 24 h con 2,5 M (S) -2 para determinar el% de células PI-manchado en diferentes fases del ciclo celular tal como se determina por citometría de flujo. Imágenes de culturas o bien no tratados y tratados fueron tomadas con la ayuda de un microscopio de contraste de fase. (C) - los niveles de ARNm de p21 en células PC3 de cultivos tratados con /sin (S) -2 se midieron por cuantitativa en tiempo real PCR. (D) - análisis de transferencia Western comparativo de los niveles de acetil-H3 en extractos de células de PC3 tratadas con cualquiera de (S) -2 o SAHA; α-tubulina se utilizó como control de carga.
Sin embargo, las células PC3, a pesar de su sensibilidad a la (S) -2-mediada citostasis, parecía ser más resistentes que las células LNCaP a la apoptosis inducida por fármacos como se muestra por el hecho de que un patrón similar de PARP escindida, γ-H2AX y acetil-α-tubulina en las dos líneas celulares se podría obtener solamente mediante el tratamiento de las células PC3 con el doble de la dosis empleada para las células LNCaP (Figura 5A). Además, el ensayo fluorescente para la activación de la caspasa 3 en 2,5 M (S) -2 indica que alrededor del 23% de las células PC3 se sometió a la apoptosis después de un tratamiento de h-48 (Figura 5B)
es decir
menos de un tercio con respecto a las células LNCaP tratadas. Además, las células PC3 restantes en el plato después de la incubación durante 72 h con cantidades crecientes de fármaco se hicieron más grandes de tamaño respecto a los controles y se acumulan en el citoplasma neutral gotitas de lípidos, la tinción positiva con Oil-Red O (ORO) como resultado de la droga inducida por la diferenciación adipogénica (Figura 5C) que ya se ha observado que ocurra en estas células [40]
(a) -. las muestras de PC3 y las células LNCaP tratadas con /sin (S) -2 (2,5 y 5 M) durante 24 h se analizaron por Western blot y immunodetected para: PARP y su fragmento escindido, γ-H2AX y acetil-α-tubulina, mientras que α-tubulina se utilizó como control de carga. (B) - células sin tratar o tratadas con 2,5 M (S) -2 durante 48 h se incubaron solo 1 h antes de ser cosechadas con FAM-DEVD-FMK carboxyfluoresceine y luego se enjuagó dos veces con PBS y su fluorescencia verde se midió por el flujo de citometría (véase la observación del punto B en la figura 2). (C) - La evaluación microscópica de los efectos de (S) -2 en la acumulación de gotitas de lípidos neutros dentro de las células PC3 tratadas durante tres días. Después de la fijación, las células se tiñeron con una solución ORO; la cuantificación de la tinción ORO se llevó a cabo como se describe en Materiales y Métodos.
(S) -2 Reduce la capacidad invasora, migración y movilidad de las células PC3
Las metaloproteinasas de matriz (MMP) liberado por las células tumorales en el medio ambiente extracelular son cruciales para la degradación del tejido de cáncer y la invasión promovida junto con el proceso metastásico [41], [42], [43]. MMP-9 desde el medio de las culturas PC3 acondicionado fue sometido a zimografía de gelatina y mostró una disminución dependiente de la dosis de MMP-9 actividad (Figura 6A) que fue acompañado por un ligero, aunque no significativa, disminución de la MMP-9 expresión (Figura 6B, izquierda). En cambio, la expresión del inhibidor tisular de la metaloproteinasa-1 (TIMP-1) - conocido por ejercer efectos anti-metastáticos mediante el contraste de la actividad de MMP-9 y otras MMPs [44], [45] - fue sorprendentemente mejorada después de 24 h de tratamiento (Figura 6B, derecha)
(a) -. alícuotas de medio acondicionado a partir de cultivos PC3 se incubaron con /sin (S) -2 en ausencia de FCS fueron sometidos a zimografía de gelatina y el análisis densitométrico de MMP actividad -9 (porcentaje de control). (B) - los niveles de MMP-9 y TIMP-1 mRNA a partir de células PC3 tratadas con /sin (S) -2 durante 24 h se determinaron por cuantitativa en tiempo real PCR. (C) - (S) -2 inhibe la motilidad celular PC3
in vitro
. Los cultivos confluentes fueron "heridas" con la ayuda de una punta de plástico estéril y se mantienen sin /con cantidades crecientes de la droga durante 24 h. Un microscopio de contraste de fase se utiliza para tomar imágenes de las monocapas. (D) - (S) -2 disminución de la invasividad de PC3. Los cultivos se trataron previamente con /sin (S) -2 (2,5-5 M) durante 24 h y luego alícuotas de células PC3 (20 × 10
3) se transfirieron en el compartimiento superior de la cámara. Las células migradas a través de la Matrigel en los filtros de cámaras de Boyden se contaron después de 6 h y se expresaron como el número de celda absoluta ± SD; cinco campos microscópicos diferentes (ampliación: x200) para cada condición fueron examinados y diferencias significativas entre las muestras se estableció a
P
≤0.05
Por otra parte, los resultados de la "curación de heridas".