Extracto
El cáncer de páncreas tiene una de las peores tasas de mortalidad de todos los cánceres. Poco se sabe sobre su etiología, en particular en relación con riesgo hereditario. El proyecto PanScan, un estudio de asociación de todo el genoma, identificado varios polimorfismos comunes que afectan a la susceptibilidad al cáncer de páncreas. polimorfismos de nucleótido único (SNPs) en
ABO
, sonic hedgehog (
SHH
), la telomerasa transcriptasa inversa (
de TERT), subfamilia de receptores nucleares 5, grupo A, miembro 2 (
NR5A2
) se comprobó que estaban asociados con el riesgo de cáncer de páncreas. Además, la exploración de loci en los cromosomas 13q22.1 y 15q14, identificado a la que se asignan no hay genes conocidos o de otros elementos funcionales. Hemos tratado de replicar estas observaciones en dos poblaciones independientes adicionales (procedentes de Alemania y el Reino Unido), y también evaluar el posible impacto de estos SNP en la supervivencia del paciente. Estamos genotipo 15 SNPs en 690 casos de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) y en 1277 controles sanos. Hemos replicado varias asociaciones entre SNPs y riesgo PDAC. Por otra parte, se encontró que rs8028529 SNP se asoció débilmente con una mejor supervivencia global (SG) en ambas poblaciones. También hemos encontrado que
NR5A2
rs12029406_T alelo se asoció con una menor supervivencia en la población alemana. En conclusión, hemos encontrado que rs8028529 podría ser, si estos resultados se replican, un prometedor marcador para el riesgo y pronóstico de esta enfermedad letal
Visto:. Rizzato C, D Campa, Giese N, J Werner, Rachakonda PS, Kumar R, et al. (2011) El cáncer pancreático loci de susceptibilidad y su papel en la supervivencia. PLoS ONE 6 (11): e27921. doi: 10.1371 /journal.pone.0027921
Editor: Hana Algül, Technische Universität München, Alemania |
Recibido: 27 Junio, 2011; Aceptado: 27 Octubre 2011; Publicado: 18 Noviembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Rizzato et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Unión Europea en el marco del proyecto MolDiagPaCa, así como el Ministerio Federal alemán de Educación, Investigación (BMBF), como parte del proyecto PaCaNet dentro del programa NGFNplus, y el Instituto Nacional de Investigación en Salud de Liverpool, la Unidad de Investigación Biomédica de páncreas y el Liverpool Medicina Experimental del cáncer Centro. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es la quinta causa principal de muerte por cáncer en Europa y el octavo a nivel mundial, con una supervivencia relativa a cinco años de menos del 5% [1]. existe ninguna prueba de detección para esta malignidad y la enfermedad metastásica es comúnmente presentes en el diagnóstico inicial. factores de riesgo establecidos incluyen el tabaquismo, la obesidad o el sobrepeso, un historial médico de la diabetes tipo II, y los antecedentes familiares de cáncer de páncreas [2].
El proyecto PanScan, un estudio de asociación de genoma completo (GWAS), recientemente identificado varios loci de susceptibilidad al cáncer de páncreas. Varios polimorfismos de nucleótido único (SNP) en las regiones de genes de
ABO
, sonic hedgehog (
SHH
), la telomerasa transcriptasa inversa (
de TERT), subfamilia de receptores nucleares 5, grupo a, miembro 2 (
NR5A2
) se encuentra asociado con el riesgo de cáncer de páncreas [3]. Se encontraron asociaciones estadísticamente significativas también con SNPs mapeado a una región en el cromosoma 13q22.1 y una región en el cromosoma 15q14, donde se asignan los genes no conocidos [3].
Los genes a los que varios de los loci fueron GWAS mapeado son biológicamente plausibles candidatos para la participación en el cáncer de páncreas. Varios estudios anteriores reportaron una asociación entre el tipo de sangre ABO y los cánceres gastrointestinales, más fuertes para el cáncer gástrico, pero también destaca por cáncer de páncreas [4], [5]. SHH desempeña un papel fundamental como factor morfogénica y se relaciona con la formación de diversos tumores malignos, incluyendo el cáncer de páncreas [6].
NR5A2
codifica un receptor nuclear de la subfamilia fushi tarazu (FTZ-F1) que interactúa con β-catenina y se expresa predominantemente en el páncreas exocrino, el hígado, el intestino y los ovarios en los adultos. El
de TERT
gen codifica la subunidad catalítica de la telomerasa, esencial para mantener los telómeros extremos. Mientras que la actividad de la telomerasa no se puede detectar en la mayoría de tejidos normales, se observa en aproximadamente el 90% de los cánceres humanos [7]. La región del cromosoma 5p15.33 donde
TERT
mapas ha sido identificado en estudios de asociación de genoma completo de un número de diferentes tipos de cáncer, incluyendo tumores cerebrales, cáncer de pulmón, carcinoma de células basales y melanoma. Aunque la región en 13q22.1 no contiene ningún gen conocido, con frecuencia se elimina en un espectro de tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de páncreas [8], [9], [10].
El GWAS ha demostrado de manera convincente asociación entre varios de estos loci y el riesgo de cáncer de páncreas. Para otros (SNPs en el
SHH
región y en un desierto de genes en el cromosoma 15q14), también mostraron asociaciones prometedoras, aunque apoyado por menos fuerte evidencia estadística [3]. Por lo tanto, hemos tratado de replicar estas observaciones en una población adicional, independiente de 690 casos de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), y se evaluó el posible impacto de estos SNP en la supervivencia del paciente.
Materiales y Métodos
Declaración
Ética
Todos los participantes firmaron un consentimiento informado por escrito. El estudio fue aprobado por los comités de ética de las instituciones responsables de reclutamiento de sujetos en cada uno de los centros de reclutamiento. Los comités de ética fueron los siguientes: Comité Suroeste de Ética de la Investigación (Temas Liverpool), Ethikkommission der Medizinischen Fakultät, Heidelberg (súbditos alemanes), Ética comité de la Universidad de Oxford (sujetos Oxford), Ética comité de la Universidad de Cambridge (sujetos Cambridge ).
población de estudio
se recogieron muestras de pacientes con cáncer de páncreas durante la cirugía entre diciembre de 1996 y septiembre de 2009, snap-congelado en nitrógeno líquido directamente después de la resección y posteriormente almacenado a -80 ° C.
la información detallada de la población de control se da en otros lugares. En pocas palabras, un total de 1141 donantes de sangre sanos de origen alemán fueron reclutados en 2004 en el Instituto de Medicina de Transfusión, Mannheim, Alemania [11].
136 controles británicos fueron seleccionados de personas reclutadas en dos cohortes de EPIC, una cohorte prospectivo en curso se lleva a cabo en diez países europeos. La cohorte EPIC-Norfolk (http://www.srl.cam.ac.uk/epic/) comprende más de 30.000 personas, entre las edades de 45 a 75 en el reclutamiento, residente en Norfolk, East Anglia, y reclutó a partir de los registros de la práctica general entre 1993 y 1997 [12]. La cohorte EPIC-Oxford comprende 65,429 personas de 20 años o más y que viven en el Reino Unido reclutados entre 1993 y 1999 [13]. Características de los pacientes y los controles se describen en la Tabla 1.
Selección de genes y polimorfismos
Hemos seleccionado 15 polimorfismos que se han encontrado para ser asociado con el riesgo de cáncer de páncreas en desarrollo mediante una reciente GWAS [3]. En cada una de las seis regiones identificadas por el GWAS, seleccionamos los SNPs que muestran las asociaciones más fuertes: se seleccionaron rs12029406, rs10919791, rs3790844 en el
NR5A2
gen; rs4635969 y rs401681 para el
de TERT
/
CLPTM1L
región; rs172310, rs167020 para
SHH
; rs657152, rs505922, rs630014, rs495828 para
ABO
; rs9543325, rs9543325 en 13q22.1; rs8028529 en 15q14. Información más detallada sobre los SNPs seleccionado se da en la Tabla 2.
Extracción de ADN y genotipado
Se extrajo ADN de tejidos pancreáticos congelados o en parafina de 690 pacientes con tumores resecados ( 576 de Heidelberg, 114 de Liverpool) usando el kit de aislamiento de AllPrep (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La genotipificación se realizó a través de un sistema específico de alelo basada en PCR genotipificación de SNP Kaspar (KBiosciences, Hoddesdon, Reino Unido) según lo recomendado por el fabricante. El orden de los ADN de los casos y controles se asignó al azar sobre placas de PCR con el fin de asegurar que un número igual de casos podría analizarse simultáneamente. Los ciclos térmicos se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La detección se realizó utilizando un ABI PRISM 7900 HT sistema de detección de secuencia con el software SDS 2.2 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.).
El genotipado para los controles británicos se llevó a cabo en el contexto de un estudio de asociación del genoma utilizando la matriz humana 660W-Quad BeadChip de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Illumina, San Diego, CA, EE.UU.) en el Imperial College.
el análisis estadístico
Hardy-Weinberg fue probado en los controles por la prueba de chi cuadrado. El análisis de riesgos se realizó en un total de 690 casos PDAC y 1277 controles sanos. Se utilizó la regresión logística para el análisis multivariado para evaluar los efectos principales del polimorfismo genético en el riesgo de cáncer de páncreas utilizando un modelo de herencia co-dominante. El alelo más común en los controles fue asignado como categoría de referencia. Todos los análisis se ajustaron por edad y género.
Para el análisis de la supervivencia, la mediana del tiempo de seguimiento se calculó con observaciones censuradas solamente (20%), mientras que el tiempo medio de supervivencia fue calculado a partir de datos de todos los pacientes. La supervivencia global (OS) se define como el intervalo de tiempo entre el diagnóstico y la muerte (observación sin censura) o la última fecha en la que el paciente seguía vivo (observación censurada, mediana del tiempo de seguimiento 1249 días). OS se evaluó utilizando métodos para el tiempo de supervivencia censurados. En particular, el riesgo de morir fue estimada por los coeficientes de riesgo (HR) y los intervalos de confianza del 95% (IC) en los modelos de riesgo proporcional de Cox. Todos los análisis se realizaron con el software STATA (StataCorp, College Station, TX, EE.UU.). Para el análisis de supervivencia, con el fin de tener en cuenta el número de pruebas realizadas en este proyecto, se calculó para cada gen /región el número de variables independientes eficaces, M
eff, mediante el uso del enfoque SNP descomposición espectral [14 ]. Se obtuvo una H
ef valor de todo el gen para cada gen y también un M
ef valor de todo el estudio, sumando el gen H
de la EFF. Para el análisis de la replicación, ya que las Asociaciones del que ya se había demostrado de manera convincente en un GWAS, una corrección de múltiples ensayos no es necesario, por lo tanto, se utilizó un umbral de 0,05 para confirmar nuestros hallazgos.
Resultados
En este estudio hemos tratado de investigar dos puntos finales diferentes: la replicación de las asociaciones entre el 15 GWAS SNP y el riesgo de desarrollar cáncer de páncreas, y una evaluación de las posibles asociaciones entre los mismos SNPs y la supervivencia del paciente
. genotipo 15 SNPs en 690 casos de PDAC y 1277 controles sanos. El tipo de referencia promedio fue de 97,20% (94,69% -98,79 gama%). Para 27 de los casos, los tejidos normales y tumorales estaban disponibles y se utilizan para determinación del genotipo. No se observaron diferencias (398 comparaciones genotipo informativos). Aproximadamente el 10% de las muestras se analizaron por duplicado, y la tasa de concordancia de los genotipos fue mayor que 99%. Las distribuciones de genotipo en todos los loci estaban en equilibrio de Hardy-Weinberg en los controles, con valores de cuadrados chi no significativas (usando un umbral de p & lt; 0,05, datos no mostrados).
Las frecuencias y distribución de los genotipos y la odds ratio para la asociación de cada polimorfismo con PDAC se describen en la Tabla S1. Hemos sido capaces de replicar varias asociaciones significativas entre el riesgo y SNPs PDAC. Tabla 3 muestra los SNPs asociados con el riesgo de cáncer de páncreas en este estudio. La asociación más fuerte con un mayor riesgo de PDAC que observamos fue con el alelo C del SNP rs9543325 9q34 (O
Het 1,23; IC del 95%: 0,98 a 1,55, O
hom 1,60, IC del 95% 1.14 a 2.25, P
tendencia = 0,0023). Durante dos SNPs en
NR5A2 gratis (rs12029406, rs10919791), uno en
SHH gratis (rs167020) y el SNP 15q14 región (rs rs8028529) estadísticamente no se detectó asociación significativa. Figura S1 muestra un resumen de las repeticiones en el estudio. Tabla S1 muestra la distribución de cada SNP genotipo en el estudio y las RUP relativas en las dos poblaciones por separado y juntos.
Hemos investigado una posible asociación entre los SNPs seleccionados y la supervivencia del paciente. La mediana de supervivencia de los casos era diferente en los pacientes de Liverpool (305 días) y Heidelberg (387 días; prueba de regresión de Cox, p = 10
-5), por lo tanto, nos llevó a cabo este análisis por separado para las dos poblaciones. Los resultados de este análisis se presentan en la Tabla 4 y la Tabla S2.
Hemos encontrado que rs8028529 SNP (localizado en el cromosoma 15q14) se asoció débilmente con un mejor sistema operativo en ambas poblaciones. En la población alemana, se encontró que los portadores heterocigotos presentan una mejor supervivencia (HR = 0,73; IC del 95%: 0,59-0,91, valor de p = 0,01, la supervivencia media de los heterocigotos = 440 días, la supervivencia media de los homocigotos para el alelo común = 346 días ), mientras que en la población británica se observó una supervivencia mejor en los portadores homocigotos del alelo variante (HR = 0,40, CI 0,16 a 1,01 95%, P = 0,05, la supervivencia media de homocigotos para el alelo variante = 421 días, la supervivencia media de los homocigotos para el alelo común = 287 días). El análisis de todas las muestras juntas, ajustando por edad, sexo y centro de reclutamiento, se observó que el genotipo combinado (C /T + C /C) tuvo una asociación estadísticamente significativa con una mejor supervivencia del PDAC: HR = 0,76 IC (95% 0,64-0,92 ) p = 0,004.
en la población alemana los portadores de al menos un alelo T del SNP rs12029406, que pertenece a la
NR5A2
gen, mostraron una supervivencia más corta (HR = 1,23 , IC 95% 1,01 a 1,49; p = 0,04, la supervivencia media de los portadores del alelo = 359 días). La tabla 4 muestra los resultados para estos dos SNPs mientras que el cuadro S2 muestra los resultados para todos los SNPs.
calculada M
valores FEP para cada gen candidato /región por separado y para todo el estudio (añadiendo el gen individual H
valores FEP;). El H
ef en todo el estudio fue de 9,8. Por ello, utilizó una significación de p umbral de estudio a escala de 0,05 /9,8 = 0,0051. El uso de este umbral, no se observaron asociaciones significativas entre ninguno de los polimorfismos genotipo y la supervivencia pacientes, con la excepción de que el alelo T de rs8028529, en la población total combinada, con mejores pacientes supervivencia.
Discusión
el cáncer de páncreas es uno de los más mortíferos de los cánceres, con tasas de mortalidad que se acercan las tasas de incidencia [1], [15]. No hay ningún tratamiento curativo eficaz aún para el cáncer de páncreas. La cirugía ofrece la única opción de tratamiento que mejora significativamente la supervivencia. Por lo tanto, la búsqueda de variantes genéticas asociadas con el riesgo de enfermedad, la progresión y la supervivencia es de la mayor importancia. Dado que hay pocos factores conocidos de riesgo, diagnóstico mejorado y una mejor comprensión de la patogénesis molecular de esta enfermedad se necesitan con urgencia.
Se presenta la reevaluación de los 15 SNPs que se encuentran asociados con el riesgo de cáncer de páncreas como PanScan reportado en [3] y su posible implicación en la supervivencia del paciente. En este estudio, hemos sido capaces de replicar seis SNPs en un
valor de p de al menos 0,05 (desde 0,0449 hasta 0,0023). No hemos podido replicar las otras asociaciones reportadas, aunque las frecuencias alélicas en nuestros sujetos de estudio fueron comparables a los obtenidos en PanScan, y las tendencias de riesgo fuimos en la misma dirección según lo informado por PanScan. Una posible explicación de nuestro fracaso en la reproducción de las asociaciones puede ser debido a la insuficiente potencia estadística.
El hallazgo más importante y novedoso de este manuscrito es el hecho de que el alelo C de rs8028529 SNP, que se encuentra en un desierto gen de el cromosoma 15q14 se asocia con una mejor supervivencia. Esta asociación alcanzó significación estadística, en el umbral convencional 0.05, en las dos poblaciones estudiadas, aunque para los casos alemanes significado sólo se observó para el heterocigoto (C /T) portadores, mientras que para los casos británicos se observó para los portadores homocigotos de el alelo variante (C /C) solamente. Un análisis de todas las muestras combinadas, ajustando por edad, sexo y centro de reclutamiento, reveló que el genotipo combinado (C /T + C /C) tuvo una asociación estadísticamente significativa con una mejor supervivencia del PDAC: HR = 0,76 (IC del 95%: 0.64- 0,92) p = 0,004. En PanScan, se encontró que la asociación entre el alelo C y un aumento del riesgo de cáncer de páncreas. Es muy difícil de entender el mecanismo biológico que podría explicar estas asociaciones ya que el SNP se encuentra en un desierto gen. El gen más cercana (que se encuentra a una distancia de aproximadamente 500 kb) es la inserción ecotropic mieloide sitio homeobox 2 (
MEIS2
), que se sabe que se expresa en altos niveles en el páncreas y en el cáncer pancreático (datos de la en la base de datos silico transcriptómica) [16]. Este gen codifica una proteína homeobox que pertenece al cuento ( "tres amino ácidos bucle de extensión ') la familia de proteínas que contienen homeodominio. proteínas homeobox CUENTO están muy conservadas reguladores de la transcripción, y varios miembros han demostrado ser factores esenciales que contribuyen a los programas de desarrollo. Estudios recientes han demostrado que las proteínas MEIS también pueden estar implicados en la tumorigénesis, aunque el mecanismo subyacente no está claro [17], [18]. Los autores especulan que el SNP se puede ubicar en una región reguladora de la
MEIS2
gen que puede modificar su expresión y de esta manera alterar el riesgo de cáncer y el pronóstico. Un mecanismo similar parece estar en su lugar en el locus en el cromosoma 8q24, donde se encuentran los SNPs asociados con el riesgo de varios tipos de cáncer en un desierto gen. Los datos recientes sugieren que uno de los SNPs pueden afectar a la unión de un factor de transcripción que regula la vía WNT y, posiblemente, el
MYC
oncogén, que asigna aproximadamente 1 Mb aguas abajo [19].
este informe también hemos señalado que el
NR5A2
rs12029406_T alelo se asocia con una supervivencia más corta, aunque sólo en la población alemana. En una revisión reciente Li y Abruzzese [20] señalan por qué este receptor puede desempeñar un papel en el cáncer de páncreas. Los autores informan que se ha especulado que
NR5A2
contribuye a las enfermedades relacionadas con la disfunción pancreática, como la diabetes. Por ejemplo NR5A2 juega un papel importante en la activación transcripcional del gen de la adiponectina [21], una hormona de los adipocitos-secretado, que se ha propuesto para ser un vínculo biológico entre la obesidad y el aumento de riesgo de cáncer de páncreas [22]. Es interesante observar que a
NR5A2
variante del gen se ha asociado con el exceso de IMC en un estudio de asociación del genoma [23]. SNPs en
NR5A2
, como rs12029406, podrían modular la actividad del receptor que a su vez puede modificar el riesgo de enfermedad y la supervivencia.
La aplicación de la corrección en función de múltiples pruebas de la única asociación que es inferior a la umbral de estudiar-racional de 0,0051 se demostró por el análisis combinado de las dos poblaciones para el alelo T del rs8028529 y una mejor supervivencia. Los resultados de las dos poblaciones no son idénticos, sin embargo todos los HRs van en la misma dirección en ambas poblaciones, es decir, un efecto protector del alelo variante, a pesar de que alcanzó significación estadística sólo en los heterocigotos en la población de Heidelberg y sólo en el los homocigotos en la población de Liverpool. En efecto, al poner en común las dos poblaciones el efecto del alelo sigue siendo similar en términos de recursos humanos, pero la significación estadística aumenta, ya que se espera que al aumentar el número de los sujetos en estudio. No es inmediata para explicar esta discrepancia: puede ser que los factores de confusión residuales enmascaran las asociaciones de los heterocigotos en los británicos y en los homocigotos en los alemanes, o la diferencia en la supervivencia entre las dos poblaciones pueden contribuir a enmascarar la verdadera asociación . Por último, puede ser que estas asociaciones se deben al azar
.
Estos resultados tienen que ser tomadas con precaución y más repeticiones y estudios funcionales se justifica. El hecho de que el polimorfismo se encuentra en una región del gen desierto enormemente inexplorado hace que sea difícil evaluar realmente un impacto clínico inmediato para el hallazgo reportado en este estudio. Estos resultados si se confirma pueden impulsar la investigación en la biología molecular del mecanismo y esto en última instancia, pueden mejorar nuestra comprensión de la enfermedad. Un buen ejemplo son los 8q24 hits, donde después de una observación epidemiológica original, muchos estudios han contribuido a descubrir la relación entre los SNPs de la región y la activación de la
MYC
de genes [19]. Desde este punto de vista nuestro estudio puede considerarse como un primer paso preliminar que podría contribuir a una mejor comprensión de la enfermedad y, en el largo plazo, a la creación de herramientas de diagnóstico y pronóstico.
En conclusión, presentamos aquí la replicación de los seis SNPs previamente asociados con el riesgo de cáncer de páncreas y la primera evidencia de una posible participación de rs8028529 en el pronóstico PDAC.
Apoyo a la Información
Figura S1.
replicación de las asociaciones entre SNPs PanScan y el riesgo de PDAC.
doi: 10.1371 /journal.pone.0027921.s001 gratis (TIF)
Tabla S1. Federaciones de SNPs de cromosoma 1q32.1 en, 5p15.33, 7q36, 9q34, 13q22.1, 15q14 con riesgo de PDAC.
doi: 10.1371 /journal.pone.0027921.s002 gratis (DOC) sobre Table S2. El análisis de regresión de Cox para
SNPs genotipo en los casos PDAC y supervivencia.
doi: 10.1371 /journal.pone.0027921.s003 gratis (DOC)
Reconocimientos
Agradecemos al Prof. Bugert en el Instituto de Medicina de Transfusión e Inmunología, Cruz Roja Alemana Servicio de sangre de Baden-Württemberg - Hessen para proporcionar muestras de ADN de control
.