Extracto
Los microARN son pequeños ARN no codificantes que modulan la expresión de proteínas fisiológicamente, y regulan numerosos mecanismos celulares. Alteración de la expresión de microARN se ha descrito en el cáncer y está asociada a la iniciación del tumor y la progresión. El microARN 148a (miR-148a) es con frecuencia el regulado en el cáncer. Hemos demostrado anteriormente que su regulación por disminución por hipermetilación del ADN es un evento temprano en la carcinogénesis pancreática adenocarcinoma ductal (PDAC), lo que sugiere una función supresora del tumor. Este sentido, investigar el papel potencial de miR-148a sobre-expresión en PDAC como herramienta terapéutica. Informamos primero de las consecuencias de miR-148a sobre-expresión en líneas celulares PDAC. Se demuestra que el miR-148a sobre-expresión no tiene efecto dramático sobre la proliferación celular y celular quimio-sensibilidad en cuatro líneas celulares PDAC bien descritos. También investigamos la modulación de la expresión de la proteína mediante un enfoque proteómico mundial (2D-DIGE). Se demuestra que a pesar de su enorme sobre-expresión, miR-148a modula débilmente la expresión de proteínas, evitando de este modo la identificación de dianas de proteína en líneas celulares de PDAC. Más importante aún,
in vivo
datos demuestran que la modulación de la expresión de miR-148a, ya sea en las células tumorales epitelios y /o en el microentorno del tumor no impide el crecimiento del tumor. Tomados en conjunto, se demuestra en este documento que el miR-148a no afecta la proliferación tanto PDAC
in vitro
y
in vivo
que sugiere un débil potencial como herramienta terapéutica.
Visto : Delpu Y, Lulka H, F Sicard, Saint-Laurent N, López M, N Hanoun, et al. (2013) El rescate de expresión de miR-148a en el cáncer de páncreas: una herramienta terapéutica inapropiada. PLoS ONE 8 (1): e55513. doi: 10.1371 /journal.pone.0055513
Editor: Guenter Schneider, Technische Universität München, Alemania |
Recibido: 6 Enero, 2012; Aceptado: 2 Enero 2013; Publicado: 31 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Delpu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de Santee et de la Recherche Médicale (INSERM, www.inserm.fr) y la Asociación para la Investigación sobre el cáncer (ARC, www.arc-cancer.net). estudios de proteómica fueron apoyados por la infraestructura de Toulouse Proteómica con el apoyo financiero de la «Asociación para la Investigación sobre el Cáncer» (Programa ARECA ARC). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
pancreático adenocarcinoma ductal (PDAC) es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en los países occidentales, mientras que sólo representa el 3% de los nuevos casos cada año [1]. PDAC pronóstico se explica con frecuencia por la falta de marcadores de diagnóstico específicas tempranas y por la ausencia de tratamientos eficaces. Hasta la fecha, la cirugía representa el único enfoque curativo para la gestión de PDAC, pero se refiere a un pequeño subgrupo de pacientes debido a la agresividad PDAC y el fenotipo invasivo. Para el resto de los pacientes diagnosticados con PDAC localmente avanzado o metastásico, la quimioterapia gemcitabina es el tratamiento paliativo estándar con efecto modesto sobre la supervivencia [2]. En consecuencia, los estudios notables se han realizado para dilucidar los acontecimientos clave que impulsan la carcinogénesis pancreática, para identificar nuevos objetivos y desarrollar tratamientos dirigidos a tumores [3], [4]. Las alteraciones genéticas y epigenéticas se han descrito como un evento temprano en el desarrollo de PDAC [5]. En la última década, importantes obras de relieve el impacto de tales alteraciones moleculares en la expresión de microRNAs en PDAC. Los microARN son pequeños ARN no codificantes que inhiben la traducción de sus ARNm diana. Juegan un papel importante en el desarrollo del cáncer, invasión y la resistencia a la quimioterapia [6].
previamente demostrado que la expresión de microARN-148a (miR-148a) se redujo reguladas durante el desarrollo temprano PDAC por hipermetilación de su ADN genómico secuencia [7]. Otros estudios informaron la baja regulación de la expresión de miR-148a en otros tipos de cáncer (
es decir
:., De esófago, cáncer gástrico y colorrectal metástasis del cáncer) [8], [9], [10], [11]. Varios objetivos de mRNA miR-148a se describen en diferentes tipos de cáncer. Estos objetivos se reagrupan del ciclo celular, la apoptosis o la metilación del ADN efectores.
Estudios anteriores evocados un efecto consecuente supresor tumoral a un exceso de expresión de miR-148a en colorrectal y líneas celulares de cáncer derivado gástricas [8], [10 ]. En consecuencia, el presente estudio tuvo como objetivo determinar si la restauración de miR-148a impactos de expresión proliferación PDAC tanto
in vitro
y
in vivo
y por lo tanto podría ser propuesto como una herramienta terapéutica.
Materiales y Métodos
cultivo celular
PDAC líneas de células Capan-2 y IMIM-PC2 humanos se cultivaron en medio RPMI suplementado con 100 mL /L de suero de ternera fetal, L-glutamina (2 mM ) (Life Technologies), cóctel de antibióticos y antimicótica (Life Technologies) y Plasmocin® (5 mg /ml) (InvivoGen). Células de riñón HEK-293FT PANC-1 células PDAC MIA PACA-2 y y embrionarias humanas fueron cultivadas en DMEM que contenía 4,5 g /l de glucosa (Life Technologies), suero de ternera fetal 100 ml /l, L-glutamina, antibióticos, y Fungizone® Plasmocin® (InvivoGen). Las células humanas derivadas de PDAC BxPC-3 se cultivaron en DMEM que contiene 1 g /l de glucosa (Life Technologies), 100 mL /L de suero de ternera fetal, L-glutamina, cócteles de antibióticos y antimicóticos. De páncreas humano Nestin células epiteliales positivas (HPNE) se cultivaron en DMEM 75% 4,5 g /l de glucosa (Life Technologies), 25% Medio M3 Base (Incell Corp.), suero bovino fetal 5%, 10 ng /ml de EGF humano recombinante ( Sigma-Aldrich) y 750 ng /ml de gentamicina (Life Technologies). Todas las líneas celulares se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC) exceptuado de las células y las células HPDE HPNE que son regalos de tipo Dr. M. S. Tsao (Universidad de Toronto, Canadá) y el Dr. M. Ouellette (Universidad de Nebraska Medical Center, Omaha, EE.UU.), respectivamente [12], [13]. Se obtuvieron células IMIM-PC2 del Dr. FX real (Centro de Investigación del Cáncer Nacional española, Madrid, España).
transfección celular
Para todos los
in vitro
experimentos, miR 148a precursores ™ miARN-MIR pre (Ambion) a 25 nM y 50 nM fueron transfectadas utilizando SIPORT ™ NeoFX agente de transfección ™ (Ambion) según las instrucciones del fabricante. Cy ™ 3 marcada con colorante pre-MIR se utilizó como control negativo y se transfectó usando las mismas condiciones.
Análisis del ciclo celular por citometría de flujo
transfectadas Capan-2 células se recogieron, se aclara de una vez en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se fijaron en helado de etanol al 70% durante la noche a 4 ° C. Las células se recogieron por centrifugación a 1.000 g y se enjuagaron con PBS. Las células se marcaron con yoduro de propidio (Life Technologies) siguiendo las recomendaciones del fabricante. la distribución del ciclo celular se evaluó utilizando un aparato de BD FACS Calibur (Beckton Dickinson) y Cell Quest Pro Software (Beckton Dickinson) como se describe por Hanoun
et al.
[14].
2D-DIGE electroforesis
La lisis celular se realizó en urea 8M, tiourea 2 M, CHAPS al 4%, pH 8,5. Después de la precipitación de limpieza (Kit de Limpieza 2D, GE Healthcare), las proteínas se resuspendieron en tampón 2D-DIGE muestra (urea 8M, tiourea 2 M, CHAPS al 4%, pH 8,5). La concentración de proteína se determinó con el kit 2D Quant (GE Healthcare). Cincuenta microgramos de proteínas se marcaron con 400 pmol de CyDye DIGE Fluor Dyes mínimo (GE Healthcare) y se incubaron en hielo en la oscuridad durante 30 min según las instrucciones del fabricante. La reacción se detuvo por la adición de 1 l de lisina 10 mM y se incubó en hielo durante 10 min. muestras marcadas diferencialmente Cy-3 y Cy-5 se mezclaron con el patrón interno de Cy-2 etiquetado (muestra compuesta de partes alícuotas iguales de cada muestra del experimento) y el isoelectroenfoque tampón (IEF) de re-hidratación (urea 8M, tiourea 2M , CHAPS al 2%, DTT 10 mM, tampón 1,2% IPG (gradiente de pH inmovilizado), pH 4-7, GE Healthcare) se añadió hasta 350 l. Para el análisis 2D-DIGE, IEF se realizó utilizando un aparato IPGphor 2 (GE Healthcare) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante con gradiente de pH inmovilizado (IPG) pH 4-7, 18 cm. Las tiras se incubaron primero en tampón de equilibrio (urea 6 M, SDS 2%, Tris-HCl 50 mM pH 8,6, glicerol 30%, azul de bromofenol rastro) que contiene 1% de DTT durante 15 minutos y después en el mismo tampón con 4,5% yodoacetamida, durante 15 minutos, en la oscuridad. Las tiras se cargan en la parte superior de un 12,5% de acrilamida geles y corrieron a 1 W /h durante 1,5 h y a 15 W /h hasta que el azul de bromofenol alcanza el extremo inferior del gel. Los geles fueron escaneados utilizando un generador de imágenes Typhoon trío (GE Healthcare) a 100 micras resolución con? Ex /em de 488/520, 532/580, 633/670 y nm para Cy-2, Cy-3 y Cy-5, respectivamente. Análisis de imágenes se realizó utilizando el software DeCyder 6.5 (GE Healthcare).
Los plásmidos
El plásmido pLVMND-SLUC que codifica la luciferasa Gaussia secretada (gluc) fue proporcionado amablemente por Cayla-Invivogen (Toulouse, Francia ). Lentiviral vector de expresión que codifica el miR-148a y el copGFP (pMIRNA1-miR148a) o copGFP solo (pMIRNA1-GFP) se obtuvieron a partir Biovalley (Marne-la-Vallée, Francia). PLenti6-TR, que codifica el represor TET, se obtuvo de Life Technologies. Para la expresión inducible de miR-148, dos oligonucleótidos parcialmente complementarios correspondientes a maduran miR-148a o un control mezclado MIR (miR-CT) se hibridaron y se clonó en pcDNA6.2-GW /emGFP-MIR vector (Life Technologies) antes de la recombinación en pLenti4 /a /V5 vector DEST (Life Technologies) utilizando la estrategia de Gateway. Para la producción lentivectores, plásmidos de embalaje pHCMV-G, que codifica la proteína VSV-G, y pCMVΔ8.91, codificación de las proteínas del VIH-1 accesorias, fueron amablemente donadas por el Dr. A. Dubart-Kupperschmitt (París, Francia).
Lentiviral vector de producción
Todos los defectuosos de replicación, vectores de lentivirus libre inactivar fueron generados en una instalación BSL-3 (plataforma vectorology, Centro INSERM U1037 de Investigación del cáncer de Toulouse, Toulouse, Francia) como se ha descrito anteriormente por Torrisani
et al.
[15]. En resumen, la transfección transitoria de células HEK-293FT con el empaquetado y plásmidos de vector lentiviral se llevaron a cabo utilizando la precipitación con fosfato de calcio. pLenti4 /A /GFP-miR-148a, pLenti4 /A /GFP miR-CT se utilizaron para obtener partículas lentivirales que codifican inducible miR-148a o miR-CT (es decir, LV-A-miR-148a o LV-A-miR CT, respectivamente). Por otro lado, pMIRNA1-miR148a y pMIRNA1-GFP se utilizaron para obtener partículas lentivirales que codifican constitutivamente miR-148a o miR-CT (LV-miR-148a o LV-GFP, respectivamente). PLenti6-TR y pLVMND-SLUC plásmidos se utilizaron para obtener partículas lentivirales que codifican el represor Tet o la luciferasa secretada (LV-TR o LV-Gluc, respectivamente). Todos los lotes fueron verificados libre de virus replicativo. Los títulos virales se determinaron en células HT-1080 y se expresan en la transducción de la unidad /ml (TU /ml) como se describe en otro lugar. Además, las concentraciones de vectores se cuantificaron por ELISA de p24 (Innotest, Ingen, París).
Generación de PACA-2 línea celular estable miR-148a
MIA células Paca-2 sobre-expresión de MIA se incubaron con las partículas lentivirales LV-TR (multiplicidad de infección = 5) durante 24 h y, posteriormente, seleccionado con blasticidina (Invivogen, Toulouse, Francia) a 100 g /ml durante 2 semanas y se clonaron por dilución en serie para obtener MIA PaCa-2 células Tr. MIA PaCa-2 TR células se transducido aún más por LV-Gluc (multiplicidad de infección = 5) y se clonó por dilución en serie para dar células MIA PAC-2 TR-Gluc. Las últimas células se incubaron con LV-A-miR-148a o LV-A-miR-CT (multiplicidad de infección = 5) durante 24 h y se seleccionaron con zeocina (Invivogen) a 100 mg /ml durante 3 semanas y se clonaron por serie dilución para generar MIA Paca-2 TR-gluc Paca-2 TR-Gluc líneas celulares de miR-CT MIA miR-148a y, respectivamente. Se determinó una concentración de doxiciclina óptima de 1 mg /ml para inducir una máxima expresión de miR-148a. Las diferentes líneas celulares estables se cultivaron después constantemente en la presencia o la ausencia de doxiciclina.
Medición de la expresión de miR-148a de QRT-PCR
Las células se transfectaron primero transitoria o estable transducido como se describe encima. ARN total fue aislado de las líneas celulares con el reactivo Trizol (Life Technologies) según las instrucciones del proveedor. La concentración de ARN se midió con un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific). El sistema de PCR miScript (Qiagen) fue utilizado según las instrucciones del fabricante para cuantificar microRNAs maduros de 1 g de ARN total. U6 y 5S ARN se utilizaron como controles internos. cDNA muestras se diluyeron 1 en 100 para la detección o U6 microARN y 1 en 10.000 para la detección de ARN 5S. Los ensayos por duplicado QRT-PCR se llevaron a cabo en un StepOnePlus ™ sistema de PCR en tiempo real (Applied Biosystems) con SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen). Las cantidades relativas de los genes miARN se calcularon por el método comparativa ciclo umbral (CT) como 2-Ct, donde Ct = CTmiRNA -. CT media geométrica de U6 y 5S
Ensayo de proliferación
miR-148a 3 células precursoras transfectadas control negativo marcados con colorante precursoras o Cy ™ se sembraron a 6 x 10
3 células por pocillo de una placa de 96 pocillos y se cultivaron en medio completo. Número de células viables se determinó por el método colorimétrico usando celular CellTiter 96® acuosa no radiactivo Proliferación de ensayo (Promega) según las instrucciones del fabricante en el día 4. Para la medición de proliferación, las células se sembraron a 5 x 10
4 células por pocillo de unas placas de 35 mm. Las células fueron cultivadas en medio completo suplementado con 1 mg /ml de doxiciclina. Se añadieron quinientos nanogramos de doxiciclina a las 48 h para evitar su descomposición en medio de cultivo. Las células se contaron con un contador Coulter modelo ZM (Beckman Coulter) después de 24 h, 48 h, 72 hy 96 h de cultivo.
sensibilidad Gemcitabina ensayo
Veinte y cinco mil crecimiento exponencial MIA Paca -2 células que expresan de forma estable el miR-148a o controlar microARN crecido con o sin doxiciclina se sembraron en placas de 35 mm. Veinticuatro horas más tarde, las células se trataron con gemcitabina (Eli Lilly) en diferentes dosis que van de 1 × 10
-9 M a 1 × 10
-4 M. Después de 72 h de tratamiento, se contaron las células utilizando Coulter modelo de contador ZM (Beckman Coulter). Gemcitabina "concentración letal 50" (LC
50) es la concentración de gemcitabina para el que 50% de las células tratadas murió comparativamente a las células no tratadas a las 96 horas. Para la medición de la sensibilidad gemcitabina en forma transitoria células que sobreexpresan el miR-148a, 1000 de células en crecimiento exponencial PDAC transitoriamente sobre-expresión de miR-148a o un microARN control (miR-CT) se sembraron en placas de 96 pocillos. Las células se trataron con diferentes dosis de gemcitabina que van desde 1 × 10
-9 M a 1 × 10
-4 M durante 72 h. Para cada línea celular, la viabilidad celular se evaluó mediante el método colorimétrico, en comparación con la viabilidad medido en 1 × 10
-9 M tratados pozos y representa como un porcentaje de células supervivientes.
Migración y ensayos de invasión
cien mil células de crecimiento exponencial sobre-expresión de miR-148a o la proteína indicadora GFP se mantuvieron en ayunas de suero durante 24 h y se sembraron en 24 insertos de tamaño bien de placa (8 micras porosos 24 inserciones formato bien para los ensayos de migración y Biocat cámaras de invasión de Matrigel para ensayos de invasión, BD Falcon) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 15 h, las células migradas se tiñeron con un cristal violeta al 1% en solución de metanol 20%, se lisaron y la densidad celular se determinó por medida de la densidad óptica de los lisados celulares a 560 nm. Los resultados se expresan como porcentaje de la migración o invasión de miR-148a sobre-expresión de las células en comparación con las células que expresan GFP.
injerto de células ortotópico
Ocho semanas de edad SCID /amarillento CB 17 ratones con fugas ( TAKONIC) se utilizaron para los experimentos de injerto celular. Cada ratón recibió 12 × 10
6 de células en crecimiento exponencial MIA Paca-2 de forma estable sobreexpresión de miR-148a en 100 l de PBS inyectado en la cola del páncreas. Las inyecciones se realizaron con un catéter de calibre 29 linfografıa conjunto con una aguja de calibre 29 a la insulina. Los ratones injertados con células miR-148a que expresan recibió agua
ad libitum
suplementado con sacarosa (25 g /L) y doxiciclina (2 g /L). Los ratones de control recibieron agua
ad libitum
suplementado con sacarosa solamente (25 g /L). Treinta días después de xenoinjerto, los ratones fueron sacrificados y se extrajeron los tumores, se pesaron y se midieron. El volumen del tumor se determinó por la fórmula ((Tumor longitud) × (Tumor Anchura
2)) /2. Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las instrucciones de la carta para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del INSERM. Toda la cirugía se realizó bajo anestesia con isoflurano y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Todos los protocolos incluidos los animales fueron aprobados por el comité de ética de ANEXPLO. observación macroscópica de los tumores fue realizada por un patólogo experto.
En vivo
transducción de tumores de MIA Paca-2 tumores
ortotópico tumores se establecieron en el páncreas de ratones SCID mediante inyección CB17 de 12 × 10
6 de crecimiento exponencial MIA PaCa-2-Gluc (como se describe más arriba). Los tumores se dejaron crecer durante 15 días antes de la inyección de 250 ng de p24 del LV-miR148a lentivirus usando un catéter de calibre 29 linfografıa conjunto con una aguja de calibre 29 a la insulina. LV-GFP se inyectó en los ratones de control. La progresión tumoral antes y después de la transducción se controló por measurment de nivel Gluc en el suero de ratones (como se describe a continuación) y mediante palpación abdominal.
La actividad de luciferasa en ratones suero
La actividad de luciferasa se midió a partir de suero de ratones . Se recogió sangre de muestreo retro-orbital con una pipeta capilar Pasteur (VWR) precargado con 10 l de una solución de EDTA al 20%. Las muestras de sangre se mantuvieron en hielo hasta la centrifugación. Las muestras se centrifugaron 3.000 g durante 15 min a 4 ° C y se recogieron y se almacenaron -20 ° C hasta su uso suero. La actividad de luciferasa se determinó a partir 5 l de suero y 45 l de una solución de coelenterazina 50 mM (Fluka analítica) en un dispositivo de ascenso Luminoskan (Thermo Scientific).
El análisis estadístico
Los resultados se expresan como la media ± error estándar. La significación estadística de las diferencias se midió con la prueba no paramétrica de Mann-Whitney, con a
p
valor & lt; 0,05 considerado estadísticamente significativo. El símbolo * indica un
p
valor & lt; 0,05, ** indica un
p
valor & lt; 0,01 y *** indica un
p
valor. & Lt; 0,005
resultados
Efecto de la transitoria miR-148a sobre-expresión de PDAC crecimiento de la línea celular
ya se ha informado de que la expresión de miR-148a es reprimida por la hipermetilación del ADN de su secuencia genómica en la celda PDAC líneas y tumores [7]. Uno podría especular que la pérdida de la expresión de miR-148a es crucial para el desarrollo del PDAC. Para evaluar tumorales efectos supresores de miR-148a en PDAC, Capan-2, PANC-1, MIA Paca-2 y BxPC-3 líneas celulares PDAC fueron transfectadas por un precursor de miR-148a oligonucleótido (miR-148a) o un precursor de control ( miR-CT). células HPNE que son células pancreáticas humanas que exhiben un fenotipo normal se utilizaron como células de control "no cancerosas". La proliferación celular se midió por el método colorimétrico 4 días después de la transfección. células transfectadas Mir-CT se utilizaron como referencia interna para cada línea celular (Figura 1A). La eficacia de transfección se evaluó para cada línea celular mediante la medición de fluorescencia Cy3 y alcanzó 90 a 100% (datos no presentados). Dando como resultado la expresión de miR-148a se midió mediante qRT-PCR (Figura S1 A). MiR-148a sobre-expresión en células pancreáticas normales HPNE no indujo cambios significativos en la proliferación celular. Del mismo modo, no se observó ningún cambio significativo en la proliferación celular en las cuatro líneas celulares PDAC en comparación con células de control transfectadas Cy3. En paralelo, la distribución del ciclo celular en Capan-2 células se determinó mediante análisis FACS (Figura 1B). De acuerdo con la ausencia de efecto en relación con la proliferación celular, no se observó alteración en la distribución del ciclo celular en las células transfectadas miR-148a comparación con las células miR-CT. Estos resultados indican que transitoria miR-148a sobre-expresión no tiene ningún efecto particular sobre la proliferación de células de cuatro líneas celulares PDAC
.
(A) Capan-2, PANC-1, MIA PaCa-2 y BxPC-3 PDAC -derivado líneas celulares y línea celular HPNE no cancerosos fueron transfectadas transitoriamente con precursores de miR-148a miR-TC o. Cuatro días después de la transfección, la viabilidad celular se evaluó por métodos colorimétricos. Para cada línea celular, la viabilidad de las células-148a MIR se comparó con la viabilidad celular miR-TC (100%). Los resultados son la media de tres experimentos independientes (± SEM) y se expresan como porcentaje de la viabilidad celular de las células control. (B), la distribución del ciclo celular se midió mediante tinción con yoduro de propidio seguido por análisis FACS 72 horas después de la transfección de las células Capan-2 con precursores de miR-148a miR-TC o.
Efecto de miR estables 148a sobre-expresión de PDAC línea celular comportamiento
Además de los experimentos de transfección transitoria, que genera partículas de lentivirus basados en Tet-on para la expresión estable de miR-148a para prevenir la caries oligonucleótido rápida y para permitir un seguimiento a largo plazo -up de eventos celulares en líneas celulares PDAC. Nos transducido células MIA Paca-2 debido a su bajo nivel de expresión de miR-148a endógena [7]. En estas células, el tratamiento doxiciclina conduce a un aumento de cinco veces en la expresión de miR-148a, en comparación con el miR-CT sobre-expresión de las células (Figura S1B). Sin embargo, la expresión estable de miR-148a no conduce a cambios significativos en la proliferación celular en estas células, en comparación con las células control (Figura 2). Además, se midió la migración y el potencial de invasión de las células que sobre-expresan el miR-148a y se compararon con las células control (Figura S2). A continuación, se observó que el miR-148a sobre-expresión no modifica estas dos funciones celulares en nuestro modelo de línea celular MIA Paca-2. Tomados en conjunto, se demuestra que de manera similar a transitorios sobreexpresión, expresión de miR-148a de larga duración no es efectiva para la inhibición de la proliferación celular PDAC y no tiene impacto en el comportamiento celular
in vitro
.
células MIA Paca-2 se incubaron con inducible vectores lentiviral que codifica para el despegue en tiempo mínimo de microARN (miR-TC) o miR-148a (miR-148a). MIA Paca-2 miR-TC o la tasa de proliferación de miR-148a se evaluó en la presencia o ausencia de doxiciclina en el medio de cultivo. Para cada condición, el recuento celular se realizó cada 24 h y se compara con el número de células adherentes en el día 1. Los resultados son la media de tres experimentos independientes (± SEM).
sensibilidad de gemcitabina de PDAC líneas de células que sobre-expresan el miR-148a
se ha propuesto previamente que los microARNs pueden afectar quimiosensibilidad por la orientación transportadores de fármacos o alterar la ruta celular crucial para el metabolismo de los fármacos o la supervivencia celular [16]. Como se describió anteriormente, gemcitabina es la quimioterapia de referencia para PDAC. Se evaluó si el miR-148a participa en PDAC sensibilidad de las células frente a esta droga. primero que notamos ninguna correlación significativa entre el nivel de miR-148a endógena (Figura 3A) y la sensibilidad gemcitabina en varias líneas celulares PDAC (Figura 3B). En paralelo, se evaluó la sensibilidad gemcitabina en células MIA Paca-2 de forma estable sobre-expresión de miR-148a o una miR-CT (Figura 3C). Los resultados obtenidos a partir de tres ensayos independientes indican una disminución no significativa en el valor de concentración letal 50 (CL50) de gemcitabina en presencia de miR-148a, en comparación con las células control. Se obtuvieron resultados similares después de la transfección transitoria de miR-148a en varias líneas celulares PDAC (Figura S3). En conjunto, estos resultados indican que el miR-148a no influye drásticamente la sensibilidad PDAC líneas celulares contra la gemcitabina.
(A) miR-148a nivel de expresión endógena se midió mediante QRT-PCR en varias líneas celulares y en PDAC y hPDE hPNE líneas de células pancreáticas normales. (B) la sensibilidad de la célula a la gemcitabina se midió después de un tratamiento h-72 en varias líneas celulares PDAC y en células pancreáticas hPNE normales. Sobrevivir fracción de células representa el número de células tratadas durante 72 h en comparación con el número de células no tratadas (representado como 100%). La concentración letal 50 (CL50) representa la dosis de gemcitabina suficiente para obtener 50% de células supervivientes en comparación con las células no tratadas. Los resultados son la media de tres experimentos independientes (± SEM). (C) la sensibilidad de la célula a la gemcitabina se midió en las células MIA Paca-2 de forma estable sobre-expresión de miR-148a (LV-A-miR-148a) o un control de MIR (LV-A-miR-CT) a la gemcitabina en presencia de doxiciclina después de un tratamiento de 72 h-. Sobrevivir fracción de células representa el número de células tratadas durante 72 h en comparación con el número de células no tratadas (representado como 100%). Los resultados son la media de tres experimentos independientes (± SEM).
El análisis de proteínas perfil de expresión transitoria después de miR-148a sobreexpresión
Cada micro ARN puede afectar potencialmente la traducción de decenas de mRNA objetivos de acuerdo con la conservación de su secuencia diana [6]. La ausencia de efectos celulares después de miR-148a sobre-expresión podría explicarse tanto por un cambio débil en el perfil de expresión de la proteína, insuficiente para producir un efecto celular, o por la sobre regulación de una vía molecular rescatar, como consecuencia de objetivo miR-148a decaer. En consecuencia, se realizó un análisis a gran escala de perfiles de expresión de proteínas por 2D-DIGE después transitoria miR-148a sobre-expresión en células Capan-2. células Capan-2 transfectadas con miR-CT se utilizaron como control. el análisis de fluorescencia de geles 2D-reveló que el miR-148a sobre-expresión sólo se traduce en una débil modulación de la expresión de la proteína, aproximadamente 2.200, en comparación con las células control (Figura S4). Ninguna de estas variaciones alcanza el valor de corte (1,5 veces el cambio en comparación con el control de las células transfectadas) a pesar de una expresión excesiva masiva de miR-148a (Figura S1 A). En consecuencia, no hay especies de proteínas se identificaron mediante espectrometría de masas.
Estos resultados indican que el miR-148a no afecta drásticamente los perfiles de expresión de proteínas en células Capan-2 que pueden explicar la ausencia de efectos biológicos como consecuencia de su excesiva -expresión.
en vivo
efectos de miR-148a sobreexpresión
Para determinar si miR-148a puede influir en el crecimiento del tumor
in vivo
, generamos tumores PDAC ortotópico en ratones SCID CB17 utilizando MIA Paca-2 células que expresan de forma estable sobre el miR-148a por 5 veces (Figura S1B). Estas células expresan constitutivamente Gaussia luciferasa (Gluc) para el seguimiento no invasivo de crecimiento del tumor. Según lo descrito por Chung y colaboradores, Gluc cuantificación en suero refleja con precisión la cantidad de células cancerosas viables en xenoinjertos de tumores [17]. Para
in vivo
estudios, gluc se tomaron muestras cada 5 días y los ratones fueron sacrificados después de 33 días, de acuerdo con el tamaño del tumor estimado por palpación abdominal. La correlación entre el peso del tumor y la señal de Gluc (R
2 = 0,79) se confirmó después de la resección del tumor y la comparación con la dosis Gluc en el suero probado el día de la cirugía (Figura S5).
Durante el curso de este experimento, se encontró que los niveles Gluc no fueron alterados por la expresión de miR-148a que indica que el miR-148a no inhibe la progresión del tumor PDAC
in vivo gratis (Figura 4A). De acuerdo con estos resultados, el análisis de los tumores después de la cirugía no pudo revelar el miR-148a efectos inhibitorios sobre el peso del tumor (Dox: 0,368 g ± 0,16 g
vs
no tratada: 0,348 g ± 0,22 g) (Figura 4B). Además, el estudio histológico de los tumores indica que no hay diferencia en la organización del tejido entre los diferentes grupos (Figura S6). Estas observaciones revelan ningún efecto dramático de la expresión de miR-148a en el crecimiento del tumor o el desarrollo de tejido tumoral
in vivo
(A)
En vivo
seguimiento de la progresión tumoral de xenoinjertos.: se inyectaron PaCa-2 células que expresan MIA miR-148a y secretada de la luciferasa Gaussia (Gluc) en el páncreas de ratones SCID. Los ratones recibieron agua normal (sin tratamiento, n = 10) o agua complementado con doxiciclina (doxiciclina, n = 12) para la inducción de la expresión de miR-148a hasta el sacrificio. niveles Gluc se midieron en el suero de ratones. Los resultados son la media de las actividades de Gluc (± SEM) y se expresan como Unidad de Luz arbitraria (A.L.U.). (B) Los tumores fueron retirados y se pondera el día de la cirugía. Los resultados son la media (± SEM) de peso del tumor en el grupo no tratado (n = 10) y el grupo tratado doxiciclina (n = 12) (C)
In vivo
seguimiento de la progresión del tumor de xenoinjerto: MIA PaCa-2 se inyectaron las células que expresan la luciferasa Gaussia secretada en el páncreas de ratones SCID (n = 10). Quince días más tarde, los vectores lentivirales que codifican miR-148a (miR-148a, n = 7) o GFP solamente (GFP, n = 3) fueron inyectados en los tumores (la flecha indica la inyección de partículas lentivirales). La cantidad de Gluc se midió en el suero de ratones y se comparó con la cantidad Gluc medido el día de la inyección de lentivirus (Día 0). Los resultados son la media de la relación de nivel Gluc en cada grupo (± SEM) y se expresan como proporción de la unidad de luz arbitraria. Los tumores (D) que reciben el miR-148 (miR-148a, n = 7) o GFP (GFP, n = 3) fueron retirados 10 días después de la inyección y lentiviral fueron ponderados. El gráfico representa la comparación de peso del tumor que expresa miR-148a (n = 7) o GFP (n = 3). Los resultados son la media de peso del tumor en cada grupo (± SEM).
En vivo
medición de miR-148a terapéutico potencial
Para evaluar un anti el tumor potencial de un miR-148a aguda sobreexpresión tanto en las células tumorales y el microambiente, que inyecta partículas lentivirales que codifican miR-148a (LV-miR-148a) en tumores-Gluc Paca-2 MIA preestablecidos injertadas en el páncreas de los ratones SCID CB17. partículas lentivirales que codifican proteínas reportero GFP (LV-GFP) se utilizaron como control. MiR-148a sobre-expresión en tumores inyectados-miR-148a-LV se verificó mediante QRT-PCR (Figura S7). La progresión tumoral se monitorizó por toma de muestras en suero Gluc ratones. Se observó una disminución de la señal Gluc dentro de los 5 días después de la transducción tumor tanto para partículas (Figura 4C). A partir del día 5 al día 10, los niveles Gluc eran estrictamente similar en miR-148a y los tumores de control-transducido, que indican que no hay diferencia en la viabilidad tumoral después de la inyección vectores lentiviral. De acuerdo con la dosis gluc, pesos de los tumores resecados en el día 10 son similares en LV-miR-148a y grupos-GFP-transducido LV (LV-miR-148a: 1,77 g ± 0,30 g
vs
LV-GFP: 1,97 g ± 0,63 g) (Figura 4D). Estos resultados indican que la transferencia de genes miR-148a, tanto en el tejido tumoral y el microambiente no afectan la viabilidad tumoral y revela ningún potencial terapéutico particular.
Discusión
expresión de miR-148a se altera en varios tipos de cáncer y su baja regulación está bien descrito en diversos tumores sólidos tales como colorrectal, de ovario, de próstata y el cáncer gástrico [8], [11], [18], [19].