Extracto
El resveratrol Sirt1-dependiente, un compuesto polifenólico de origen natural, se ha informado de ejercer actividad contra el cáncer al afectar diversas dianas moleculares. En este estudio, se examinaron los efectos y los mecanismos subyacentes del resveratrol sobre el cáncer gástrico. Se encontró que el resveratrol inhibe la proliferación de células de cáncer gástrico de una manera dependiente de la dosis. A la concentración de 25 y 50 micras, el resveratrol inhibió la viabilidad celular y disminuye el potencial clonogénico de células de cáncer gástrico. tratamiento Resveratrol detenido células de cáncer gástrico en la fase G1 y condujo a la senescencia en lugar de la apoptosis. Reguladores del ciclo celular y la senescencia vías, incluyendo la ciclina D1, quinasa dependiente de ciclina (CDK4 y 6), p21 y p16, se dysregulated por el tratamiento con resveratrol. Los efectos inhibidores de resveratrol en el cáncer gástrico también se verificaron
in vivo
utilizando un modelo de xenoinjerto en ratones nude. Resveratrol (40 mg /kg /d) ejerce actividades inhibidoras en el desarrollo de cáncer gástrico y redujo significativamente las fracciones de las células Ki67 positivas en las muestras tumorales de los ratones desnudos. Después del tratamiento resveratrol, la inducción de la senescencia y los cambios en la expresión de los reguladores implicados en las vías del ciclo celular y la senescencia fueron similares a lo que hemos observado
in vitro
. Sin embargo, el agotamiento de Sirtuinas (Sirte) 1 revirtió los efectos descritos anteriormente de resveratrol tanto
in vitro
y
in vivo
. Nuestros datos sugieren que el resveratrol inhibe el cáncer gástrico de una manera dependiente de SIRT1, y proporcionan evidencia detallada de la posibilidad de aplicar el resveratrol en la prevención del cáncer gástrico y la terapia
Visto:. Yang Q, Wang B, Zang W, X Wang , Liu Z, Li W, et al. (2013) El resveratrol inhibe el crecimiento de cáncer gástrico mediante la inducción de la fase G1 Detención y senescencia de Manera Sirt1-dependiente. PLoS ONE 8 (11): e70627. doi: 10.1371 /journal.pone.0070627
Editor: Dominique Heymann, Faculté de Médecine de Nantes, Francia |
Recibido: 20 Marzo, 2013; Aceptado 19 de junio de 2013; Publicado: 21 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81101869, 81100103, 81171536 y 81000868), el Programa Nacional de Investigación básica de China (973 Programa, Nº 2012CB911202), y la Fundación para la Innovación de la Universidad de Shandong Independiente (2012TS108) .El proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y el análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico (CG) es el cuarto cáncer más común y la segunda causa principal de muerte por cáncer en el mundo. De acuerdo con una estimación global, con un total de 989,600 nuevos casos fueron diagnosticados GC y un mínimo de 738.000 pacientes murieron a causa de esta enfermedad en 2008, representando el 10% del total de muertes por cáncer [1]. Aunque la incidencia de GC ha ido disminuyendo en todo el mundo, sigue siendo alta en los países en desarrollo, especialmente en China [1], [2]. Estudios anteriores han puesto de manifiesto la íntima relación entre la gastritis crónica causada por
Helicobacter pylori
infección y el desarrollo de GC [3]. Por otra parte, el anfitrión factores genéticos, ambientales, dietéticos y otros se han implicado en el proceso oncogénico gástrica [1]. Ya que todavía es difícil hacer un diagnóstico precoz para GC, la mayoría de los pacientes son diagnosticados en etapas avanzadas. A pesar de la mejora de las terapias convencionales para CG avanzado, incluyendo la cirugía, la quimioterapia y la radioterapia, la longitud o la calidad de vida de los pacientes con cáncer gástrico avanzado, sigue siendo insuficiente [2], [4]. Por lo tanto, se necesita urgentemente la exploración de nuevos fármacos preventivos o dianas terapéuticas de GC.
El consumo de frutas y verduras frescas contribuye a una disminución en la incidencia de cáncer, incluyendo GC [2], [5]. Las aplicaciones clínicas también sugieren que algunas moléculas bioactivas dietéticos tienen la capacidad de inhibir múltiples pasos oncogénicos [5] - [7]. Resveratrol (Res, 3,5,4-trihidroxiestilbeno) es un compuesto polifenólico natural presente en casi 70 especies de plantas, incluyendo la piel de las uvas rojas, cacahuetes, bayas y otros [6] - [8]. Res se informó por primera vez de ejercer actividades antitumorales en 1997 [8]. Los informes posteriores han demostrado que Res imparte efectos inhibidores sobre varios tipos de cáncer, como el cáncer de colon, cáncer de mama y el linfoma, y afecta a diversas dianas moleculares [9] - [11]. SIRT1 (SIRT1), una clase III nicotinamida adenina nucleótido (NAD
+) - dependiente de la histona deacetilasa /proteína, se ha informado de que un objetivo clave de la Res en varios modelos tumorales [9], [10]. Sin embargo, algunos datos muestran resultados contrarios que indican que Res ejerce efectos quimioprotectores independiente de Sirt1 [11]. Los efectos inhibidores de Res en GC y el mecanismo subyacente no están bien estudiados.
En el presente estudio, mostramos que la Res inhibió la proliferación de células GC
in vitro
. tratamiento Res induce la detención del ciclo celular en la fase G1 y condujo a la senescencia celular. Estos efectos de la Res fueron revertidos por el agotamiento de SIRT1. Las actividades Sirt1 dependiente inhibitorios de Res GC en las células también se verificaron
in vivo
. Tomados en conjunto, nuestros resultados indican que Res ejerce efectos inhibidores en SIRT1 depende de GC y sugiere un papel terapéutico para Res en GC.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Todo los estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina (Nº 001 en 2011 para Aprobación de Ética Animal) Universidad de Shandong y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Líneas celulares, condiciones de cultivo y tratamiento Res
líneas celulares GC humana AGS (obtenidos a partir del Centro de recursos de la célula, Shanghai Instituto de Bioquímica y Biología celular de la Academia de Ciencias de china), BGC-823 y SGC-7901 (adquirido de Centro de china para Type Culture Collection, Wuhan, China) se utilizaron en este estudio. Las células se cultivaron en F12 (AGS) o RPMI 1640 (BGC-823 y SGC-7901) que contiene 10% de FCS, 100 unidades /ml de penicilina y 2 mmol /L de L-glutamina en 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% CO
2. De alta pureza Res se adquirió de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.), se disolvió en DMSO y se añadió al medio de cultivo a la concentración indicada. Todos los experimentos se llevaron a cabo 24 horas después de la administración de suplementos de Res, a menos que se indique lo contrario.
Pequeño Interferencia de ARN transfección
modificado químicamente pequeños ARN de interferencia (siRNA) de orientación y control de siRNA Sirt1 fueron adquiridos de GenePharma (Shanghai , China). La secuencia de la Sirt1 siRNA era 5'-CCAUCUCUCUGUCACAAAUTT-3 '. Las células se incubaron durante la noche y luego se transfectaron con ARNsi utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cuarenta y ocho horas después de siRNA transfección, las células fueron tratadas con 50 micras Res durante 24 h antes de un estudio adicional.
Ensayo de viabilidad celular
La proliferación se evaluó mediante el título de la célula 96 ® Solución acuosa Uno Ensayo de proliferación celular (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Brevemente, 2 × 10
3 Las células se sembraron en una placa de 96 pocillos y se dejaron crecer durante 24 h. Veinticuatro horas más tarde, 20 l de MTS (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboxi-metoxifenil) -2- (4-sulfofenil) 2H-tetrazolio) se añadió a cada bien. Después de la incubación durante 3 horas a 37 ° C, la absorbancia a 490 nm se registró en un lector de flash Multiplate Varioskan (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE.UU.). La viabilidad celular se calculó mediante la siguiente fórmula: viabilidad celular relativa = (absorbancia media de grupo tratado - absorbancia media de blanco) /(absorbancia media de la absorbancia media de control grupo- de blanco). Los ensayos se realizaron por triplicado y se repitieron tres veces.
formación de colonias de ensayo
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos (300 o 500 células por pocillo) y se incubaron durante 10 días hasta que las colonias eran suficientemente grande como para discernir con claridad. Las células se fijaron con metanol y se tiñeron con cristal violeta, y el número de colonias con más de 50 células se contó manualmente. Los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron tres veces.
Ciclo Celular Análisis
Las células se recogieron, se fijaron con pre-enfriada de etanol 70% a 4 ° C durante la noche y después se tiñeron con yoduro de propidio (Beyotime , Jiangsu, china) que contiene RNasa a a 37 ° C durante 30 min en la oscuridad. La distribución del ciclo celular se determinó utilizando un citómetro de flujo (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.) y los datos se analizaron con el software multiciclo (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA, EE.UU.). Los experimentos se realizaron de forma independiente en tres ocasiones.
Ensayo de apóptosis
La detección y cuantificación de la apoptosis se realizaron mediante el etiquetado de roturas de cadena de ADN utilizando un kit de detección de la Muerte En situ Cell, TMR rojo (Roche Applied Science, Basilea, Suiza). Las células o secciones de parafina de xenoinjertos se marcaron con TUNEL de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para las células, el tratamiento con 0,2 mM de H
2O
2 de 12 h sirvió como control positivo. Para secciones de parafina, los controles positivos se adquirieron de Millipore (Billerica, MA, EE.UU.). Los núcleos se counterstained con DAPI (Beyotime) y las diapositivas o secciones fueron fotografiadas por un microscopio de fluorescencia (Olympus, Tokio, Japón) usando el software cellSens Dimensión. Los experimentos se realizaron de forma independiente en tres ocasiones.
β-galactosidasa de tinción
La senescencia se evaluó mediante una senescencia β-galactosidasa kit de tinción (Beyotime). Brevemente, las células o secciones congeladas de xenoinjertos se fijaron y se incubaron después con recién preparada β-galactosidasa (β-Gal) solución de tinción a 37 ° C durante la noche. Los experimentos se realizaron de forma independiente en tres ocasiones.
Estable horquilla RNA (shRNA) Las células GC-lentiviral corta
Los vectores lentivirales que contienen control o Sirt1 shRNA fueron construidos por GenePharma y utilizados para transfectar células BGC-823. desmontables eficiente de Sirt1 se verificó mediante western blot. Para la transducción estable, infectado de control-lentivirus-o Sirt1 shRNA infectados por lentivirus-células BGC-823 se cultivaron en medio completo suministrado con 2 g puromicina /ml durante cuatro semanas y considerado como LV-C y BT-S, respectivamente.
ratones desnudos modelo de xenoinjerto
hembra Balb /c ratones desnudos atímicos (6~8 semanas) fueron adquiridos de la Universidad de Pekín (Beijing, china) y se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos en el Key laboratorio de Investigación Cardiovascular y Remodelación de funciones, hospital Qilu, la Universidad de Shandong. Los ratones se dividieron al azar en cuatro grupos (8 ratones para cada grupo): Grupo I y, BGC-823 células II (1 × 10
6 células por inyección en 0,1 ml de PBS) se inyectaron por vía subcutánea en la región de flanco de la ratones desnudos; grupo III, se inyectó LV-C (células BGC-823); y se inyectó el grupo IV, LV-S (BGC-823 células). Después de la implantación, los ratones desnudos de los grupos II, III y IV fueron tratados con Res (40 mg kg
-1 en 0,1 ml de aceite vegetal, administrado por sonda esofágica, una vez al día). El tamaño del tumor subcutáneo se midió con un calibre, y los volúmenes tumorales se calcularon por la fórmula (longitud) x (anchura
2) /2. Los ratones fueron sacrificados cuatro semanas más tarde. Los tumores se recogieron y se procesaron para los estudios de Western Blot y inmunoquímicos.
Time-cuantitativa real PCR (RT-qPCR)
ARN total en las células fue aislado utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen) y se convierten en ADNc utilizando el kit de reactivos PrimeScript ™ RT (Takara, Tokio, Japón). RT-QPCR se realizó para los genes, incluyendo la ciclina D1, quinasa dependiente de ciclina 4 (CDK4), p21 y β-actina como se describe anteriormente [12]. Las secuencias de los cebadores de amplificación se enumeran en la Tabla S1. La expresión de mRNA de la ciclina D1, CDK4 y p21 se normalizó a ß-actina en relación con el control utilizando el 2
-ΔΔCt método. Cada experimento se repitió por triplicado.
Western Blot
La proteína total de las células o las muestras de tumor se extrajo con RIPA lisis Buffer (Beyotime) como se describe [12]. La concentración de proteína se determinó utilizando el kit de ensayo de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). La membrana se sondeó con anticuerpos contra Sirt1 (Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.), bcl-2, bax, caspasa-3, ciclina D1, CDK4 y 6 (Señalización Celular, Danvers, MA, EE.UU.), p16 y p21 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.). El anticuerpo secundario utilizado fue una peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado con anti-conejo o anticuerpo de ratón. Las bandas de proteínas se visualizaron utilizando un sistema ECL (Pierce). β-actina (Señalización Celular) sirvieron como control de carga.
La inmunohistoquímica
se deparaffinized Las muestras tumorales de los ratones desnudos, rehidratada y el antígeno recuperados. Las secciones se incubaron con un anticuerpo contra Ki67 (1:500, Abcam) durante la noche a 4 ° C. HRP-conjugado anti-IgG de conejo y tinción DAB se emplearon para visualizar el anticuerpo Ki67. Las diapositivas fueron finalmente de contraste con hematoxilina. Las diapositivas fueron fotografiadas por una luz microscopio Olympus (Tokio, Japón) usando el software cellSens Dimensión. Las células Ki67 positivas se contaron manualmente y el porcentaje de las células Ki67 positivas se evaluaron por campos. Cinco campos separados fueron contados para cada sección.
Análisis estadísticos
Los datos se expresaron como la media ± desviación estándar. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el paquete estadístico para las Ciencias Sociales (SPSS, versión 16.0, Chicago, IL, EE.UU.) mediante un modelo lineal con la prueba post-hoc de Tukey. Los valores de p inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
Resultados
Res inhibe la viabilidad de las células de GC en una forma dependiente de SIRT1
Tres líneas de células GC (AGS, BGC-823 y SGC-7901) se examinaron en nuestros experimentos. El cultivo de las células en el vehículo (0,1% DMSO) no afectó la viabilidad celular (datos no presentados). Sin embargo, cuando se trataron con diferentes concentraciones de Res durante 24 h, la proliferación celular se inhibió dependiendo de la dosis en 25, 50, 100 y 200 micras Res (Figura 1A). Es de destacar que la proliferación de AGS fue obviamente inhibida cuando fueron tratados con 10 mM Res, que no se observó en las otras dos líneas celulares (Figura 1A). En todas las tres líneas celulares, la presencia de 100 mM Res era suficiente para inducir la inhibición de más de 50% de crecimiento (56,78% de AGS, 54,87% para BGC-823 y 52,16% para SGC-7901, respectivamente). Por lo tanto, se utilizaron 25 y 50 micras Res para experimentos posteriores. Para determinar el papel funcional de SIRT1 en el tratamiento Res, derribaron la expresión Sirt1 utilizando un siRNA. La inhibición eficaz de la expresión Sirt1 se verificó por transferencia de Western (Figura 1B). Los resultados del ensayo de MTS mostraron que en las células agotadas-Sirt1, Res no inhibió la proliferación de las células (Figura 1C). Estos datos indican que Res es capaz de inhibir la proliferación de células de GC y que el efecto inhibidor puede ser rescatado por el agotamiento Sirt1.
células GC (A) se trataron con o sin Res a la concentración indicada por 24 h . A continuación, la viabilidad celular se midió por ensayos de MTS. (B) La expresión de SIRT1 a las 72 h después de la transfección de control o siRNA se determinó por Western blot. "Ci 'representa el control de siRNA, y' Si 'representa el Sirt1 siRNA. (C) Cuarenta y ocho horas después de siRNA transfección, las células fueron tratadas con GC 50 micras Res para 24 h. A continuación, se llevaron a cabo los ensayos de MTS. Los datos representan la media ± SD, * representa P & lt; 0,05, ** representa P & lt; 0,01 y *** representan P. & Lt; 0,001
Res disminuye el potencial clonogénico de células de GC en un Sirt1- de manera dependiente
para las células tumorales, la formación de colonias se ha encontrado para ser un parámetro más sensible que la viabilidad para evaluar el efecto de un fármaco. Por lo tanto, se llevaron a cabo a continuación, los esfuerzos para determinar el efecto de la Resolución sobre el potencial clonogénico de células GC. Res, a la concentración de 25 mM, condujeron a una reducción significativa en el número de focos, así como los tamaños en las células de GC. Después del tratamiento con 50 micras Res, el potencial clonogénico redujo aún más. Sin embargo, desmontables de SIRT1 antes del tratamiento Res aumentó el número de focos a un nivel comparable con el grupo de vehículo (Figura 2).
La colonia experimentos de formación se realizaron por triplicado y se repitió tres veces. Los gráficos representativos se muestran en (A). El análisis cuantitativo se demuestra como un histograma en (B). "Ci 'representa el control de siRNA, y' Si 'representa el Sirt1 siRNA. Los datos representan la media ± desviación estándar, los resultados estadísticos se indican con asteriscos y representa *** P & lt;. 0.001
Res induce la acumulación de células de GC en la fase G1 de Manera Sirt1 dependiente
Para examinar el efecto inhibitorio de Res en las células de GC, se realizó un análisis del ciclo celular. Hemos observado que los 25 y 50 micras Res aumentó la proporción de células en la fase G1, tanto en BGC-823 y las células SGC-7901 (Figuras 3A y 3B). La inducción de la detención en la fase G1 por Res también fue dosis-dependiente. Res a una concentración de 50 mM mostraron un efecto más fuerte que lo hizo en 25 mM. El aumento del número de células en la fase G1 fue acompañado por una disminución de las poblaciones de células principalmente en las fases S. El agotamiento de Sirt1 antes del tratamiento Res disminuyó la inducción de fase G1 del Res (Figuras 3A y 3B). Para corroborar los resultados anteriores, se analizó la expresión de los reguladores del ciclo celular de la fase G1, incluyendo ciclina D1, CDK4, CDK6, p21 y p16 en células BGC-823. Como se muestra en la Figura 3C, en Res-células tratadas BGC-823, los niveles de proteína de activadores de la transición G1 /S (ciclina D1, CDK4 y CDK6) disminuyó, mientras que los niveles de proteína de los inhibidores de las CDK (CDKIs) (p21 y p16) aumentó. Por el contrario, no se encontró que estos cambios en las células BGC-823-agotado Sirt1 cuando fueron tratados con 50 micras Res. Resultados similares se obtuvieron de la RT-qPCR de la ciclina D1, CDK4 y p21 (Figura 3D).
La distribución del ciclo celular de las células se analizó por citometría de flujo. Los gráficos representativos se muestran en (A). El análisis cuantitativo se demuestra como histogramas en (B). (C) Los niveles de proteína de los reguladores de ciclo celular se detectaron mediante transferencia de Western. (D) Los niveles de mRNA de los reguladores del ciclo celular fueron detectados por RT-qPCR. 'Con' representa el tratamiento con vehículo, 'R' representa el resveratrol, 'Ci' representa el control de siRNA, y 'Si' representa el Sirt1 siRNA. Los datos representan la media ± SD, * representa P & lt; 0,05 y *** representan P. & Lt; 0,001
La falta de células sub-G1 indicó que el tratamiento Res no provocó apoptosis en las células GC (Figura 3A), que fue consistente con los resultados de experimentos de marcaje TUNEL de BGC-823 células (Figura S1A). Los niveles de proteína de moléculas relacionadas con la apoptosis, tales como bcl-2, bax y la caspasa-3, de cada grupo fueron comparables (Figura S1B). Tomados en conjunto, nuestros resultados muestran que induce la detención del Res fase G1 en las células de GC de una manera dependiente de SIRT1 y no induce la apoptosis.
Res induce la senescencia de las células GC de Manera Sirt1 dependiente
en nuestras manos, Res da lugar a la detención del crecimiento en lugar de aumento de la apoptosis. Por lo tanto, hemos hecho esfuerzos adicionales para explorar si Res podrían inducir la senescencia en células GC. tinción de ß-Gal, un marcador específico de las células senescentes de mamíferos, se utilizó. Después del tratamiento Res, se halló una mayor fracción de las células se tiñeron con β-Gal. Sin embargo, el tratamiento previo con Sirt1 siRNA bloqueó la senescencia celular inducida por Res (Figura 4). Resultados similares se obtuvieron de dos BGC-823 y las células SGC-7901, lo que sugiere que los dependientes Res sobre Sirt1 para inducir la senescencia celular en las células de GC. tinción
β-Gal se realizó para detectar células senescentes. Los gráficos representativos se muestran en (A). Ampliación: x 200, Pub en 100 micras. El análisis cuantitativo se demuestra como un histograma en (B). "Ci 'representa el control de siRNA y' Si 'representa el Sirt1 siRNA. Los datos representan la media ± desviación estándar, los resultados estadísticos se indican con asteriscos y representa *** P & lt;. 0.001
Res inhibe el crecimiento tumoral in vivo en un Manner Sirt1 dependiente
a continuación, se llevaron a cabo estudios adicionales para determinar los efectos de la cosa en BGC-823 crecimiento de xenoinjertos en ratones desnudos. Para el
in vivo
estudio, se utilizaron células lentiviral shRNA-BGC-823 transducidas estables. De los cuatro Sirt1 shRNA-lentivirus, LV-1 y LV-4 ejerció efectos de silenciamiento obvias sobre la expresión de SIRT1 (Figura S2). Después de cuatro semanas de proyección, la expresión de SIRT1 se mantuvo en los niveles disminuidos en las células lentiviral shRNA-BGC-823 estables (Figura S2). Se han usado LV-1-lentiviral shRNA células estables BGC-823 en los estudios de xenoinjertos posteriores debido a los efectos inhibitorios más fuertes en la expresión Sirt1 en comparación con el LV-4. Todos los animales sobrevivieron hasta el final de nuestros experimentos, y no se encontró ninguna diferencia obvia en su peso corporal (datos no mostrados). Cuatro semanas después de la implantación, las mediciones de los volúmenes de los tumores indican que el tratamiento Res redujo significativamente el crecimiento de BGC-823 xenoinjertos (Res vs control: 0.5728 ± 0.2276 cm
3 vs 1.4288 ± 0.1741 cm
3, P & lt; 0,001) . transducción estable del control de shRNA-lentivirus no afectó significativamente el volumen del tumor (Res Res vs + Ci: 0.5728 ± 0.2276 cm
3 vs 0,68 ± 0,0672 cm
3, P = 0,603). Sin embargo, en los xenoinjertos-agotado Sirt1, los efectos inhibitorios de Res en el crecimiento del tumor fueron rescatados (Res + Si vs Res + Ci: 1.2313 ± 0.1777 cm
3 vs 0,68 ± 0,0672 cm
3, P & lt; 0,001, Res + Si versus control: 1.2313 ± 0.1777 cm
3 vs 1.4288 ± 0.1741 cm
3, P = 0,123) (Figura 5). En los xenoinjertos tratados con Res, el marcador de proliferación, Ki67, disminuyó significativamente (Figura 5B) (% de las células Ki67 positivas, Res vs control: 3 ± 1,8 vs 44,67 ± 3,79, P & lt; 0,001). La senescencia se observó en xenoinjertos de ratones tratados-Res indicados por β-Gal tinción (Figura 5B). Sin embargo, no obvia la apoptosis fue inducida por Res en los xenoinjertos (Figura S1D) y no se observaron cambios en los reguladores de la apoptosis, tales como Bcl-2, Bax y la caspasa-3 (Figura S1C). Estos resultados fueron consistentes con los
in vitro
experimentos. Por otra parte, los cambios en la expresión de los reguladores del ciclo celular, incluyendo la ciclina D1, CDK4, CDK6, p21 y p16 fueron similares a lo que hemos observado
in vitro
(Figura 5C). Todos los cambios observados en Ki67, β-Gal y los reguladores del ciclo celular fueron contrarrestados por Sirt1 agotamiento (figuras 5B y C) (% de células Ki67 positivas, Res + Si vs Res + Ci: 46.32 ± 6.03 vs 2.65 ± 1.53, P & lt; 0,001, Res + Si vs control: 46,32 ± 6,03 vs 44,67 ± 3,79, P = 0,946)
(a) Los ratones desnudos se dividieron al azar en cuatro grupos y había 8 ratones para cada grupo.. BGC-823 células (1 × 10
6) con diferentes tratamientos se inyectaron por vía subcutánea en cada grupo. Después de la implantación, el tamaño del tumor se midió semanalmente. Los volúmenes tumorales se calcularon por la fórmula (longitud) x (anchura
2) /2. (B) Las células en proliferación en las muestras de tumor de los diferentes grupos fueron detectados por Ki67 inmunoquímica. La senescencia se indica mediante la tinción de β-Gal. Se muestran las gráficas representativas. Ampliación: × 400, bar para 20 micras. se extrajo (C) La proteína total de las muestras de tumor, y la expresión de los reguladores del ciclo celular se detectaron mediante transferencia de Western. 'C' representa el control, 'R' representa el resveratrol, 'Ci' representa el control estable lentiviral shRNA-BGC-823 células, y 'Si' representa las BGC-823 células Sirt1 lentiviral shRNA estables.
Discusión
Res, un polifenol natural, está actualmente siendo evaluado como un agente contra el cáncer prometedor. Aunque se ha demostrado para impartir efectos antiproliferativos contra varios tipos de cáncer, tanto en cultivo de células y modelos de xenoinjerto [9] - [11], sus efectos de quimioprevención en GC y el mecanismo subyacente no han sido bien estudiados. En este estudio, hemos demostrado que inhibe la proliferación Res de líneas de células GC (AGS, BGC-823 y SGC-7901). Se observó que la actividad anti-crecimiento después las células se trataron con 25 mu M Res durante 24 h, y el efecto inhibidor era dependiente de la dosis. A una concentración de 50 micras Res, las relaciones de inhibición para estas tres líneas celulares fueron 41%, 34% y 32%, respectivamente. Cuando la concentración de Res aumentó aún más, se reforzaron los efectos inhibitorios. Ambas 100 y 200 micras Res inhibieron el crecimiento en más de un 50% en comparación con el grupo de vehículo. Además, la dosis más alta de Res es demasiado grande para lograr
in vivo
y por lo tanto no tiene sentido en un entorno clínico [13], [14]. Por lo tanto, se utilizaron los dos concentraciones eficaces inferiores de 25 y 50 micras Res en los estudios posteriores. La actividad de inhibición de crecimiento de Res parece ser específico de células, como el IC50 difiere según el tipo de célula y varía de 27 mM a 180 mM [9], [10], [15], [16]. Algunos de estos estudios también han demostrado que ejerce Res los efectos inhibitorios de una manera dependiente del tiempo [15], [16]. La concentración y la duración del tratamiento Res utilizado en nuestro estudio fueron consistentes con la mayoría de los informes de otros grupos [8], [9], [16]. Para el
in vivo
estudio, el método de administración que utilizamos es gavage porque este es el método que se utiliza comúnmente en los ratones como una alternativa a la inyección intraperitoneal [15], [17]. Además, los estudios en ratones han revelado que Res se absorbe de manera eficiente después de la administración oral y se puede encontrar en todo el cuerpo [17], [18]. Cuando se usa
in vivo
, Res disminuido significativamente la proliferación de las células que se caracteriza por la expresión de Ki67, lo cual es consistente con los resultados de nuestro
in vitro
experimentos.
Res puede frenar la proliferación de las células cancerosas a través de diversos mecanismos, entre los cuales, la regulación del ciclo celular es una muy importante [9], [15], [19]. Nuestro
in vitro
datos demostró que el tratamiento de las células con GC Res induce la detención fase G1. La fase G1 es la primera de las cuatro fases del ciclo celular que tiene lugar en la división celular eucariótica. G1 es una fase especialmente importante del ciclo celular, ya que es el punto en el cual una célula se compromete en una ronda de división. La progresión a través fase G1 requiere la formación y la acción de la ciclina D-CDK4 o -CDK6 complejos. Estos complejos fosforilan luego retinoblastoma, que conduce a la liberación de los factores de transcripción E2F y la transcripción de genes aguas abajo que participan en la fase S progresión. Las actividades de los complejos CDK-ciclina D están regulados por los inhibidores de aguas arriba, incluidos los miembros de la tinta (p15, p16 y p18) y las familias CIP (p21, p27 y p57) [20], [21]. En la misma línea, acompañado con la detención fase G1, se observó la regulación a la baja de la ciclina D1, CDK4 y CDK6 y la regulación al alza de p21 y p16 en las células tratadas GC-Res. Nuestro
in vivo
resultados de los niveles de expresión de estos reguladores del ciclo celular en las muestras de tumor son consistentes con los
in vitro
resultados. Nuestros resultados también son consistentes con los de estudios anteriores [15], aunque algunos otros han informado de que la detención de la fase S es inducida por Res [9], [19]. La persistencia de la detención del crecimiento puede conducir a la apoptosis o senescencia de las células. Debido a que ambas vías de señalización de p21 y p16 participan en la progresión de la senescencia mediada por diversos tipos de estrés [22], [23], se realizó la tinción β-Gal. tratamiento Res aumentó significativamente la frecuencia de células senescentes GC de una manera dependiente de la dosis. El programa de senescencia celular representa una barrera importante contra el cáncer de iniciación y el desarrollo [24], [25]. Aunque estudios previos muestran que, a través de la atenuación del estrés oxidativo y la mejora del metabolismo, Res ejerce efectos anti-envejecimiento, tanto
in vitro
y
in vivo
[26] - [28], los efectos opuestos han demostrado en el cáncer. Res se ha encontrado para inducir la senescencia inhibición del crecimiento similar en varios tipos de cáncer [29], [30]. El doble papel de Res en la senescencia celular, retardando el envejecimiento en los tejidos normales y la aceleración de la senescencia en tumores, lo convierte en un candidato ideal para la prevención y el tratamiento del cáncer.
La apoptosis es otro efecto común que generalmente se observa en tratados Res las células del cáncer [9], [11], [15], [16]. La evidencia experimental indica que la apoptosis puede ser mediada por varias vías diferentes y numerosas moléculas reguladoras. Entre estos reguladores, las proteínas que comprenden la familia bcl-2 son importantes. Hay dos proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2, Bcl-XL) y las proteínas pro-apoptóticos (Bax, malo, bak y Bcl-xs) en esta familia. Un aumento de la relación de bax pro-apoptótica /anti-apoptótica de Bcl-2 aumenta la permeabilidad de la membrana mitocondrial, provoca la liberación de citocromo c de la mitocondria al citosol y, a su vez, da como resultado la activación de la caspasa-9 y la de aguas abajo orientar la caspasa-3 [31]. A pesar de esta vía apoptótica intrínseca, los ligandos pro-apoptóticos, tales como FasL, mediante la unión a sus receptores, provocan la activación de la caspasa-8 y efectores aguas abajo, tales como la caspasa-3. La activación de las caspasas efectoras induce la escisión de diversos sustratos celulares y causa directamente la apoptosis [31] - [33]. A pesar de numerosos informes anteriores indicaron que la apoptosis es responsable de la inhibición del crecimiento inducida por Res, no observamos la apoptosis en las células obvia GC-Res tratados. Esta ausencia de apoptosis puede ser debido a la concentración y la duración del tratamiento Res adaptado en nuestro experimento, porque los estudios de diferentes grupos muestran que Res ejerce efectos de dosificación y de duración y dependiente de [34], [35]. Además, como los efectos de Res son también específico de células [36] - [38], las células GC utilizados en nuestro estudio pueden ser resistentes a la apoptosis inducida por Res
Res tiene varios objetivos.; entre las cuales, la clase III NAD
+ - deacetilasa dependiente de SIRT1 es la estudió con mayor frecuencia. Aunque un estudio bioquímico indicó que Res no era un activador directo de Sirt1 [39], Res todavía ha sido considerado como un agonista clásico de Sirt1. Numerosos estudios demuestran que Res ejerce diversos efectos en diferentes modelos de una manera dependiente de SIRT1 [40], [41]. En nuestro experimento, Sirt1-agotamiento revirtió la inhibición del crecimiento de la Res tanto
in vitro
y
in vivo
. La detención en la fase G1 y la senescencia inducida por el tratamiento Res fueron rescatados por Sirt1-agotamiento. Estos resultados indican que los efectos de inhibición de Res en GC dependen de Sirt1. De acuerdo con los estudios anteriores, Sirt1 puede regular la expresión génica a través de dos mecanismos diferentes. En primer lugar, directamente, Sirt1 media directamente la desacetilación de una proteína y, a continuación mejora su ubiquitinación y la posterior degradación ubiquitina proteasoma [42].