Abstract> Objetivo
Desarrollo de robustas biomarcadores pronósticos y /o predictivo en pacientes con cáncer colorrectal cáncer (CCR) es imprescindible para el avance de las estrategias de tratamiento para esta enfermedad. El objetivo fue determinar si el estado de expresión de determinados miRNAs podría tener valor pronóstico /predictivo en pacientes con CCR tratados con quimioterapias citotóxicas convencionales.
Métodos
Se estudió una cohorte de 273 muestras de CRC de la etapa II /pacientes tratados III con quimioterapia basada en 5-fluorouracilo adyuvante y pacientes en estadio IV sometidas a 5-fluorouracilo y la quimioterapia basada en oxaliplatino. En un conjunto de cribado (n = 44), 13 de los 21 candidatos miRNAs se cuantificaron con éxito por multiplex RT-PCR cuantitativa. En el conjunto de validación que comprende de toda la cohorte de pacientes, estado de la expresión de miR-148a se evaluó mediante RT-PCR cuantitativa, y su metilación del promotor se cuantificó mediante pirosecuenciación bisulfito. Por último, se analizaron las asociaciones entre la expresión de miR-148a y la supervivencia del paciente.
Resultados
Entre los candidatos miRNAs estudiadas, la expresión de miR-148a era más significativamente reducido regulado en los tejidos avanzados CRC. En el estadio III y IV CRC, baja expresión de miR-148a se asoció con la enfermedad significativamente más corto libre de la supervivencia (DFS), una respuesta terapéutica peor, y peor supervivencia global (SG). Por otra parte, el estado de metilación de miR-148a inversamente correlacionada con su expresión, y se asocia con una peor supervivencia en la fase IV CRC. En el análisis multivariante, la expresión de miR-148a era un biomarcador /predictivo pronóstico independiente para los pacientes con CCR avanzado (DFS en el estadio III, bajo vs. alta expresión, HR 2,11; OS en estadio IV, HR 1,93)
Discusión. estado
miR-148a tiene un valor pronóstico /predictivo en pacientes con CCR avanzado tratados con quimioterapia convencional, lo que tiene importantes implicaciones clínicas en la mejora de las estrategias terapéuticas y gestión personalizada de este tumor maligno
Visto:. Takahashi M, Cuatrecasas M, Balaguer F, Hur K, Toiyama Y, Castells A, et al. (2012) El significado clínico de miR-148a como un biomarcador predictivo en pacientes con cáncer colorrectal avanzado. PLoS ONE 7 (10): e46684. doi: 10.1371 /journal.pone.0046684
Editor: Alfons Navarro, Universidad de Barcelona, España |
Recibido: 18 Junio, 2012; Aceptado: 3 de septiembre de 2012; Publicado: 3 Octubre 2012
Copyright: © Takahashi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La presente trabajo fue apoyado por becas R01 CA72851 y CA129286 del Instituto Nacional del cáncer, de los Institutos nacionales de Salud, con fondos del Instituto de Investigaciones de Baylor (CRB y AG), y por las subvenciones del Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF2010-19273), Agència de Gestión de Ayudas Universitarias y de Investigación (2009 SGR 849, AC), y la Fundación Mutua Madrileña (AP7901-2010; MC), XBTC, BT, Biobanc. MT fue parcialmente apoyado por una beca de la Fundación de Investigación en Ciencias de la célula. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
en la actualidad, el cáncer colorrectal (CRC) de los pacientes con metástasis en los ganglios linfáticos (TNM en estadio III) son tratados con quimioterapia adyuvante que incluye fármacos citotóxicos tales como 5-fluorouracilo (5-FU) y oxaliplatino, después de la resección quirúrgica de la cáncer. Del mismo modo, los pacientes con CRC distante metastásico (etapa IV) se tratan con diversas combinaciones de fármacos quimioterapéuticos y fármacos molecularmente dirigidos que incluyen anticuerpos anti-EGFR anti-VEGF y. Aunque estos regímenes de tratamiento han mejorado los resultados en pacientes con CRC avanzado, una proporción significativa de individuos no obtener ningún beneficio de tales tratamientos, y un poco de experiencia peores resultados, como resultado de las toxicidades asociadas con las drogas. Existe una necesidad imperiosa para el desarrollo de biomarcadores predictivos que puede seleccionar el subgrupo de pacientes que se beneficiarán de los fármacos quimioterapéuticos convencionales, por lo que los pacientes que no se beneficiarán del tratamiento pueden ser librados de la toxicidad del fármaco y se ofrecen tratamientos alternativos.
las mutaciones en
KRAS ¿Cuáles son los únicos marcadores predictivos establecidos para la selección de las estrategias de tratamiento en el CCR. Los pacientes con tumores que tienen mutaciones en el codón 12 o 13 de la
KRAS
gen no se benefician de la terapia con medicamentos a base de anti-EGFR [1], [2], y, en consecuencia, la detección de esta mutación se recomienda para todos los pacientes en estadio IV que son candidatos para la terapia con medicamentos a base de anticuerpos anti-EGFR. Además, la inestabilidad de microsatélites (MSI), un fenotipo presente en ~ 15% de CRC, se ha demostrado asociarse con la mejora de la supervivencia global (OS), independientemente de la quimioterapia adyuvante, así como una falta de beneficio de la quimioterapia basada en 5-FU en pacientes en estadio II [3], [4]. Sin embargo, si MSI tiene valor predictivo en pacientes en estadio III tratados con quimioterapia sigue siendo incierto [5], [6]. Mientras que algunos estudios han sugerido que los otros marcadores moleculares, como el fenotipo de la isla CpG methylator o expresión de estado de los genes implicados en la reparación del ADN o el metabolismo de fármacos (como
ERCC1
y
TYMS
) pueden tener potencial como marcadores de pronóstico /predictivo, no tenemos suficientes datos consistentes que apoyan la utilidad de estos marcadores [7] - [11]. Tomados en conjunto, a pesar de los avances realizados en la caracterización genómica y epigenómico del CRC, no hay
establecido
biomarcadores que puedan predecir de forma fiable los resultados terapéuticos de la quimioterapia citotóxica convencional en pacientes con estadio III o IV CRC.
La desregulación de la expresión de microARN (miARN) está implicada en la tumorigénesis temprana, así como la progresión de la enfermedad en diversos tumores malignos [12], [13]. miRNAs ejercen sus efectos supresores oncogénicos y /o tumorales mediante la unión a las regiones 3 'no traducidas del ARNm, lo que lleva a la supresión de la traducción o degradación mejorada del mensaje correspondiente. En el CCR, la expresión desregulada de varios miRNAs, incluyendo el miR-17~92, miR-21, miR-31, miR-34b /c, miR-143, miR-145 y miR-203 se ha informado anteriormente [14] - [17]. Desde miRNAs juegan un papel central en la carcinogénesis humana, existe un creciente interés en la identificación de miRNAs de pronóstico o predictivo en pacientes con CCR.
Sin embargo, sólo unos pocos informes han investigado el potencial de los genes miARN (s) como biomarcadores de pronóstico /predictivo en el CCR. En un estudio seminal, Schetter
et al.
Demostró que el miR-21 puede ser un marcador pronóstico /predictivo prometedor en fase II /III CRC tratados con quimioterapia basada en 5-FU [17]. Del mismo modo, otro grupo ha demostrado que los pacientes en estadio II con una elevada expresión de miR-320 o miR-498 había una mejor supervivencia sin recurrencia [18]. Sin embargo, los tamaños de las muestras analizadas en estos estudios fueron relativamente pequeños, los resultados no han sido validados en otros estudios, y no ha habido ningún intento de determinar la utilidad predictiva de cualquier miARN en estadio IV CRC. La hipótesis de que los perfiles de expresión de los genes miARN (s) específico podrían tener valor pronóstico y /o predictivo en pacientes con estadio IV CRC, así como aquellos con etapas anteriores. En esto, en una etapa de cribado inicial que implicó el análisis de miRNAs 21candidate, descubrimos que el miR-148a es frecuentemente downregulated en CCR avanzado. Posteriormente, mediante el análisis de una gran cohorte de validación de 273 CRC, proporcionamos nuevas pruebas de que el miR-148a es con frecuencia el regulado en esta enfermedad, y esto se produce principalmente a través de la hipermetilación de su región promotora putativa. Además, se demuestra que la baja expresión de miR-148a se asoció significativamente con un resultado desfavorable en pacientes con estadio III CRC tratados con quimioterapia basada en 5-FU y con una peor respuesta terapéutica y la supervivencia en pacientes con CCR en estadio IV tratados con 5- FU y oxaliplatino.
pacientes y métodos
Ética Declaración
El estudio fue aprobado por las Juntas de Revisión Institucional (IRB) del hospital Clinic, Barcelona, España, y un escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes.
los pacientes
embebidos en parafina (FFPE) los tejidos fijados con formalina de una cohorte de 273 pacientes con CCR (tumores primarios de 76 en estadio II, estadio III 125 y 72 en estadio IV CRC) y 20 muestras de tejido de la mucosa colónica normal de individuos sanos se obtuvieron del Departamento del hospital Clinic, Barcelona, España Patología. Los pacientes incluidos en este estudio fueron reclutados entre 1996 y 2008. Todas las etapas II y III, los pacientes fueron tratados con quimioterapia adyuvante con 5-FU-basados para 6 meses posteriores a la resección del tumor, y todos los pacientes en estadio IV fueron tratados con 5-FU y oxaliplatino hasta que el tratamiento ha fallado. La etapa II y III, los pacientes fueron seguidos cada tres meses durante los dos primeros años, y cada seis meses para los tres años siguientes. Tanto la recaída locorregional y /o metástasis a distancia se define como la recurrencia del tumor, mientras que las lesiones colorrectales metacrónicas no se consideraron como recurrencia. La mediana del tiempo de seguimiento son de 52,2 meses (rango; 2.9-173 meses) en estadio II y III, los pacientes y 19,1 meses (rango, 3.7-83.7 meses) en pacientes en estadio IV. Entre fase II y III de pacientes, 70 pacientes (35%) tuvieron recurrencia del tumor (mediana; 17,8 meses, rango: 5.5-144 meses), y el DFS media de los pacientes no recurrencia fue de 40,5 meses (rango; 7.5-155 meses) . El seguimiento de los pacientes se terminó en noviembre de 2009. respuesta a la quimioterapia en pacientes en estadio IV se evaluó de acuerdo con los Criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos directrices (RECIST) [19] cada dos meses. estado de MSI de los tumores se determinó mediante el análisis de cinco marcadores mononucleótidos (BAT-25, BAT-26, MONO-27, NR-21, y NR-24; Sistema de Análisis de MSI, Promega, Madison, Wisconsin, EE.UU.). Las características clínico-patológicas de los pacientes se muestran en la Tabla 1.
ADN y ARN extracción
Se extrajo ADN de 10 micras de espesor tejidos FFPE utilizando el kit de ADN de tejidos FFPE QIAmp (Qiagen , Valencia, California, EE.UU.). El ARN total incluyendo la fracción miARN fue extraído de tejidos FFPE utilizando el kit de aislamiento total RecoverAll ácido nucleico (Ambion, Inc., Austin, Texas, EE.UU.).
Multiplex RT-PCR cuantitativa
un conjunto de selección que incluyó la mucosa colónica normal de sujetos sanos y 44 tejidos de CRC (16, etapa II y III cada uno y 12 pacientes en estadio IV), el estado de expresión de 21 miRNAs candidatos (miR-9, miR-10b, miR-19a, miR -21, miR-31, miR-34a, miR-34c, miR-101, miR-103, miR-137, miR-143, miR-145, miR-148a, miR-148b, miR-152, miR-155 , miR-194, miR-320, miR-335, miR-373 y miR-519c) se cuantificó usando las matrices dinámicas de alto rendimiento de microfluidos Fluidigm [20]. Cada ensayo Taqman miARN (. De parte 4427975, Applied Biosystems, Foster City, California, EE.UU.) se utilizó en el múltiplex análisis de RT-PCR de la siguiente manera: Identificación de ensayo, 000583, 002218, 000395, 000397, 002279, 000426, 000428, 002253 , 000439, 001129, 002249, 002278, 000470, 000471, 000475, 002623, 000493, 002277, 000546, 000561, 001163 y, respectivamente. Estos candidato miRNAs han sido previamente demostrado estar involucrados en el CCR y /u otros tumores malignos humanos [16], [18], [21] - [35].
Cuantificación de la expresión de los genes miARN por tiempo real RT- PCR
En el conjunto de validación que incluía toda la cohorte de pacientes, los genes miARN expresión se cuantificó por Taqman PCR con transcripción inversa (QRT-PCR) usando un sistema de detección de secuencias ABI 7000 (Applied Biosystems). La expresión de miR-148a fue calculado por el método de valor de Ct delta, utilizando la expresión de miR-16 como un normalizador [36], [37]. Para mantener medidas consistentes a lo largo de todas las placas, tres muestras independientes de RNA fueron cargados como los controles internos en cada PCR plazo, y los resultados de cada placa se normalizaron de acuerdo a los datos obtenidos de los controles internos.
metilación del ADN análisis
ADN fue modificado mediante el Kit de oro metilación del ADN EZ (Zymo Research, Irvine, California, EE.UU.) con bisulfito. La metilación del promotor putativo región de miR-148a se cuantificó mediante pirosecuenciación bisulfito (sistema de pirosecuenciación PSQ SA 96A, Qiagen). Se utilizaron los siguientes cebadores; miR-148a adelante, 5'-biotina-TAGGAAGGAAGGAGAGTG, miR-148a inversa, 5'-CCCAACAAAAATAATATTTTAACA, y la secuencia de miR-148a, 5'-CAAAAATAATATTTTAACAACC. Los niveles de metilación de tres sitios CpG se analizaron y el nivel de metilación de cada tumor se representa como el valor medio de los niveles de metilación de los tres sitios CpG. Se utilizaron las siguientes condiciones de ciclo de PCR: desnaturalización inicial a 94 ° C durante 7 min, seguido de 45 ciclos a 94 ° C durante 30 seg, 52 ° C durante 30 seg, y 72 ° C durante 30 seg
In situ
hibridación para miR-148a
La hibridación in situ gratis (ISH) se realizó según lo descrito por Navarro et al. [38] con algunos ajustes menores. Una de fluoresceína (FITC) 5 'marcado con sonda de miARN-ácido nucleico incorporado bloqueado (LNA miRCURY sonda de detección, Exiqon, Woburn, Massachusetts, EE.UU.) se utilizó para la visualización de miR-148a en 3 secciones de tejido FFPE micras de espesor. A y una sonda RNU6b revueltos se incluyeron como controles positivos y negativos, respectivamente (Exiqon). Los portaobjetos se colocaron en un horno a 59 ° C durante la noche. Las secciones se desparafinaron con xileno, rehidratadas con etanol, y se trataron con agua pirocarbonato de dietilo para 1 min. Cromogénico ISH se realizó en una plataforma automatizada Bond Max (Vision BioSystems, Norwell, Massachusetts, EE.UU.). Las láminas fueron previamente con proteasa 1 de 4 minutos a 37 ° C. Se hibridó un total de 300 l de sonda 25-nM en cloruro de sodio, tampón de citrato de sodio de hibridación a 45 ° C durante la noche. detección inmunológica se realizó con un anticuerpo anti-FITC de ratón a 37 ° C durante 60 min seguido de una, polimérico peroxidasa de rábano sistema conjugado de anticuerpo enlazador libre de biotina (Sistema Refinar Detección, Vision BioSystems). DAB se utilizó como cromógeno y hematoxilina fue utilizado como colorante de contraste.
El análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Software, La Jolla, California, EE.UU.) o v12 MedCalc (software MedCalc, Bélgica). Las diferencias entre los dos grupos fueron analizados por la prueba U de Mann-Whitney. Los análisis de correlación se llevaron a cabo utilizando el método de correlación de Spearman. Los CRC tumores se clasificaron en altos y bajos de miR-148 grupos de expresión utilizando el análisis de curva característica (fase II /III) o la mediana de los valores de expresión (estadio IV). El análisis de Kaplan-Meier se realizó para estimar las distribuciones de supervivencia libre de enfermedad (DFS) y la específica por cáncer de supervivencia global (SG) en estadio II y III, los pacientes, y la supervivencia libre de progresión (SLP) y la SG en pacientes en estadio IV. Se utilizó una prueba de log-rank para analizar las diferencias estadísticas en la supervivencia como se deduce de las curvas de Kaplan-Meier. El análisis de regresión de riesgo proporcional de Cox se realizó para calcular HR y 95% IC para cada covariable. El modelo multivariado final se basó en un método paso a paso para los factores clínicos asociados con la supervivencia buena o mala (p & lt; 0,1) en los modelos univariantes. Para el análisis de supervivencia, el tumor MSI solitario fue excluido del grupo en la etapa IV. Todas las diferencias se consideraron como estadísticamente significativas cuando p. & Lt; 0,05
Resultados
miR-148a es un candidato miARN que es con frecuencia las reguladas en el estadio III y IV CRC
en un conjunto de detección, lo primero que exhibió 21 miRNAs candidatos que han sido implicados en la tumorigénesis, utilizando las matrices dinámicas Fluidigm microfluidos (n = 44; el cuadro complementario S1). Entre los 21 miRNAs analizados, 13 miRNA produjo con éxito de expresión resultados en el multiplex RT-PCR. Siete miRNAs demostraron alteraron significativamente la expresión entre los tejidos normales y CRC. Entre todos, sólo el miR-148a reveló una regulación por disminución significativa en los tumores con ganglios linfáticos (etapa III) o metástasis a distancia (IV) en comparación con los tumores sin (II), lo que subraya la importancia de este miARN en CRC progresión /metástasis. En base a estos resultados, se determina posteriormente si una expresión alteración de miR-148a en una cohorte más amplia de la CRC tiene ningún valor pronóstico /predictivo.
En toda nuestra cohorte (n = 273), el miR-148a expresión en el escenario III /IV de tumores fue significativamente menor que en mucosa normal del colon (p & lt; 0,001; Figura 1A). También se observó una tendencia hacia la reducción gradual de la expresión de miR-148a con el avance de fase de las CRCs (Figura 1A). Más específicamente, la expresión de miR-148a en la etapa III y IV de tumores fue significativamente menor que en la mucosa colónica normal (p & lt; 0,001), mientras que no fue significativamente diferente entre la etapa II tumores y las muestras de la mucosa normal (p = 0,41; Figura 1 A) .
A. la expresión de miR-148a en la mucosa colónica de los controles sanos (NC), y en la etapa II, III y IV CRC; el número de pacientes (N) y la mediana de expresión (Mediana) se enumeran a continuación el gráfico. B.
In situ
hibridación para miR-148a en los tumores de CRC y mucosa normal, en la que las manchas rojas, cromógeno y el contraste azul. fotomicrografías representativos se muestran a partir de una mucosa normal del colon (paneles superiores), un tumor con expresión de miR-148a baja (paneles intermedios), y un tumor con expresión de alto miR-148a (paneles inferiores) a aumentos indicados. Una microfotografía se muestra de un tumor con expresión de alto miR-148a usando una sonda scramble como control negativo (fondo, panel izquierdo). C. Los niveles de miR-148a metilación en tumores en estadio IV. La región promotora putativa de miR-148a, y la posición de los cebadores pirosecuenciación se ilustran en el panel superior. El gráfico de dispersión de expresión de miR-148a y metilación niveles se muestran en el panel inferior. D. niveles de expresión de miR-148a se muestran para los CRC metilados y no metilados en el panel superior. los niveles de metilación de miR-148a se muestran para los tumores con expresión alta y baja de miR-148a en el panel inferior. Un valor atípico (el nivel de metilación; 48%). Se excluye del grupo metilado en el gráfico inferior
A continuación, para confirmar el patrón de expresión específico de tumor de miR-148a, se realizó un análisis de ISH en un subgrupo de tumores en estadio IV con la expresión de altos y bajos de miR-148a. Hemos observado que la expresión en la mucosa colónica normal de los tumores en estadio II fue alta, lo que confirma los resultados QRT-PCR (Figura 1B). CRCs con alta expresión de miR-148a en QRT-PCR también expresaron esta miRNA principalmente en el citoplasma de las células neoplásicas (Figura 1B), pero no en las células del estroma no epiteliales, a excepción de la tinción de algunas células inflamatorias en la lámina propia, particularmente las células de plasma. Por otra parte, los CRC con baja expresión de miR-148a comprobada por QRT-PCR revelaron también muy baja o ausente expresión de este miRNA en el nivel de ISH (Figura 1B). Estos resultados indican que nuestros QRT-PCR resultados reflejan con precisión la expresión endógena de miR-148a dentro de las células cancerosas obtenidas a partir de muestras de tejido de CRC.
La expresión de miR-148a se correlaciona inversamente con su promotor metilación estado
La región del promotor putativo de sitios de miR-148a dentro de una isla CpG, y la metilación de estos sitios CpG se han propuesto como un posible mecanismo para la inactivación de miR-148a en el CCR y los cánceres de mama [39] - [41]. Sin embargo, ninguno de los estudios anteriores han investigado a fondo la correlación directa entre la expresión de miR-148a y su estado de metilación en una gran cohorte de muestras de cáncer. En consecuencia, estábamos interesados en dilucidar si la baja regulación de miR-148a observado en nuestra cohorte fue una consecuencia de la hipermetilación del promotor. Dado que el miR-148a fue más frecuente el regulado en el CCR en estadio IV, nos hemos centrado nuestro análisis de metilación en estos tumores. Cuantitativa pirosecuenciación bisulfito reveló que algunos de etapa IV CRC demostraron hipermetilación de miR-148a. Los niveles de metilación oscilaron entre 4-26% (mediana, 10%), y cuando el estado de metilación de cada tumor se comparó con su estado de expresión derivado de QRT-PCR, se observó una correlación significativa (coeficiente de Spearman, R
2 = -0,43, p & lt; 0,001; Figura 1C). Además, cuando se categorizaron todos los tumores en un no-metilado (nivel de metilación & lt; 15%) y los grupos metilados (≥15% de metilación), se observó que los tumores metilados tenían expresión consistentemente más bajos de miR-148a (0,068 vs 0,088, p = 0,029; Figura 1D, arriba). Por otra parte, los CRC con la expresión de miR-148a menor fueron más frecuentemente metilado en comparación con los tumores con expresión más alta (mediana, 11% frente al 8%, p = 0,001, Mann-Whitney U test; Figura 1D, abajo). Estos resultados ponen de manifiesto que la hipermetilación del promotor putativo región de miR-148a es un importante mecanismo de regulación para su expresión en el CCR.
Bajo la expresión de miR-148a se asocia con un peor pronóstico en pacientes con estadio II y III CRC
a continuación el objetivo fue determinar si el estado de la expresión de miR-148a tuvo un impacto en el pronóstico en pacientes con estadio II y III CRC tratados con quimioterapia adyuvante basada en 5-FU. Para estos análisis, se compararon las diferencias en la SLE y la SG entre la alta expresión (estadio II = 58, III = 80) y baja expresión (II = 18, III = 45) grupos. No se encontró asociación significativa entre la expresión de miR-148a y cualquiera de los factores clínico-patológicos tales como la edad, sexo, localización del tumor o el estado MSI (Tabla 1). Sin embargo, la baja expresión de miR-148a se asoció significativamente con DFS más corto (5 años DFS, bajo vs. alto, 54% vs. 71%, p = 0,023; Figura 2A), y mostró una tendencia hacia una peor OS (5 años OS, 78% vs. 85%, p = 0,12; Figura 2B). Seguidamente, evaluó el valor pronóstico /predictivo de la expresión de miR-148a en un modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox. En el análisis univariante, etapa superior TNM (III vs. II, HR 2,06, IC del 95%: 1,21 a 3,52; p = 0,008) y una menor expresión de miR-148a (HR 1,74, IC del 95%: 1,08 a 2,83; p = 0,025) fueron significativamente asociado con más corto DFS, y la edad más joven mostró una tendencia hacia DFS más corto (& lt; 60, HR 1,57, IC del 95% 0,97 a 2,56, p = 0,071; Tabla 2). Por otra parte, en el modelo multivariado incluyendo estos tres factores, estado de la expresión de miR-148a se asoció de forma independiente con una peor supervivencia (HR 1,83, IC del 95%: 1,12 a 2,99, p = 0,017, Tabla 2).
Kaplan-Meyer curvas de a, la supervivencia libre de enfermedad (DFS) y B, la supervivencia global (SG) en fase II /III de pacientes de acuerdo con la expresión de miR-148a. Las curvas de Kaplan-Meyer para C, DFS en estadio II y D, etapa III DFS, dependiendo de la expresión de miR-148a.
A continuación analizaron los datos de fase II y III CRC separado para determinar si la asociación entre la baja expresión de miR-148a y el peor resultado fue uniforme en ambas etapas, o predominantemente alineado con una etapa. Se encontró que en la etapa II, la expresión de miR-148a no se asoció con DFS (5 años DFS, alta versus baja, 77% vs. 83%, p = 0,50; Figura 2C) o el sistema operativo (OS 5 años, 89 % vs. 87%, p = 0,94; datos no mostrados). Sin embargo, en la etapa III, bajo la expresión de miR-148a se asoció significativamente con una peor DFS (SSE a 5 años, 43% vs. 66%, p = 0,0071; Figura 2D), pero no con el sistema operativo (OS 5 años, 75% vs . 81%, p = 0,16; datos no mostrados). Además, la expresión bajo miR-148a era un único factor que asociada con la recurrencia del tumor en estadio III (Tabla 2). Estos resultados sugieren que el estado de la expresión de miR-148a tiene un potencial como biomarcador pronóstico /predictivo para la fase III CRC.
Bajo la expresión de miR-148a se asocia con una peor respuesta terapéutica y peor supervivencia en la fase IV CRC
a continuación dilucidado si el estado de miR-148a tenía un potencial para la predicción del resultado terapéutico en pacientes con CCR en estadio IV tratados con 5-FU y oxaliplatino. Edad, sexo, localización del tumor, y el estado funcional no fueron significativamente diferentes entre los grupos de alto y bajo de expresión (Tabla 1). Los tumores de los no respondedores (enfermedad estable y enfermedad progresiva) mostraron una tendencia hacia la expresión de miR-148a menor en comparación con los de los respondedores (respuesta completa y respuesta parcial) (mediana, 0,063 vs. 0,092, p = 0,10; figura 3A, izquierda) . No obstante, cuando los tumores en estadio IV se divide en los grupos de expresión de miR-148a bajas y altas, el grupo de baja expresión se asoció significativamente con una respuesta desfavorable terapéutico (respondedores, 49% vs. 81%, p = 0,006; Figura 3A, a la derecha ). En el análisis de Kaplan-Meyer, el grupo de baja expresión mostró una tendencia hacia una peor SSA (mediana, 8,1 frente a 10,1 meses, p = 0,16; Figura 3B, izquierda) y significativamente peor OS (16,1 vs 25,6 meses, p = 0,024; figura 3B, derecha). Además del estado de la expresión, el estado de metilación miR-148a también se asocia con ambos PFS peores (metilado frente a no metilado, 6,9 frente a 9,3 meses, p = 0,020; figura 3C, izquierda) y OS (10,2 vs. 21,8 meses, p = 0,0015; Figura 3C, derecha)
A.. La respuesta terapéutica según la expresión de miR-148a. La respuesta completa, CR; respuesta parcial, PR; enfermedad estable, Dakota del Sur; enfermedad progresiva; PD. B. Kaplan-Meyer curvas de supervivencia libre de progresión (PFS, panel izquierdo) y OS (panel derecho) en pacientes en estadio IV según la expresión de miR-148a. C. curvas de Kaplan-Meyer para PFS (panel izquierdo) y OS (panel derecho) en pacientes en estadio IV según la metilación de miR-148a.
También se evaluó el valor predictivo de miR-148a en una Cox modelo de riesgo proporcional. En el análisis univariante, peor PS (HR 2,62, IC del 95%: 1,26 a 5,43; p = 0,010), disminuir la expresión de miR-148a (HR 1,79, IC del 95%: 1,08 a 2,98; p = 0,026) y la hipermetilación de miR-148a (HR 2,76 , IC 95% 1,44 a 5,28, p = 0,002) se asociaron significativamente con una peor supervivencia (Tabla 3). En el modelo multivariado final que incluía estos tres factores, tanto el estado de la expresión de miR-148a (HR 1,93, IC del 95% 1.15 a 3.23, p = 0,014) y la hipermetilación de miR-148a (HR 3,04, IC del 95%: 1,56 a 5,93; p = 0,0011) emergieron como factores predictivos independientes que se asociaron con peor pronóstico (Tabla 3).
Discusión
El objetivo de este estudio fue determinar si la expresión de miR-148a se desregula en CRC, y además, si esto tiene el potencial de servir como un biomarcador de pronóstico o predictivo en esta enfermedad. En este documento, nos proporcionan pruebas que ponen de relieve un papel significativo para la desregulación de miR-148a en el CCR. En primer lugar, la expresión de miR-148a era con frecuencia las reguladas en el CCR, especialmente en tumores en estadios avanzados. En segundo lugar, la expresión de miR-148a en el colon fue regulada al menos en parte a través de los mecanismos epigenéticos basados en la correlación inversa observada entre su expresión y el estado de metilación. En tercer lugar la expresión de miR-148a, bajo se asoció independientemente con un mal pronóstico en pacientes en estadio III tratados con quimioterapia adyuvante. En cuarto lugar, la baja expresión de miR-148a también se asoció con una peor respuesta terapéutica y una menor supervivencia en pacientes en estadio IV tratados con quimioterapia. Por último, el estado de metilación fue un predictor independiente de peor pronóstico en el CCR en estadio IV.
in vitro
estudios que utilizan líneas celulares no colónicos han indicado que el miR-148a ejerce una función supresora tumoral por la orientación de varios genes, como
PXR
,
TGIF2
,
MSX1
,
CDC25B
,
DNMT1
y
DNMT3b
[39], [42] - [46]. La desregulación de miR-148a se ha implicado en el CCR [14], [29], [39], [47], sin embargo, la importancia clínica de la expresión de miR-148a alterado en el CCR aún no ha sido dilucidado. En nuestro estudio, hemos analizado la mayor cohorte de pacientes con CRC al día (n = 273) y proporcionado pruebas sólidas de que la expresión de miR-148a es con frecuencia el regulado en el CCR avanzado y su expresión reducida se asocia con una peor supervivencia en la fase III y IV de la enfermedad. A lo mejor de nuestro conocimiento, ninguno de los informes anteriores se han embarcado en la identificación de miRNAs como biomarcadores para predecir la respuesta terapéutica en pacientes en estadio IV CRC tratados con quimioterapia citotóxica. Nuestra observación clínicamente más importante fue que los pacientes en estadio IV CRC con alta expresión de miR-148a tenían más probabilidades de beneficiarse de la quimioterapia citotóxica, destacando el valor predictivo potencialmente nueva de este miARN como una herramienta para la toma de decisiones en el manejo de pacientes con CRC.
Los mecanismos exactos que subyacen miR-148a baja regulación en la promoción de resistencia de las células a la quimioterapia CRC requieren una aclaración adicional. Sin embargo, la evidencia reciente para el papel de este miARN en otros tipos de cáncer han ofrecido pistas para la comprensión de algunos de sus efectos sobre la quimiosensibilidad celular. Fujita
et al.
Informó que miR-148a se dirige directamente a
MSK1
y la transfección de su precursor mayor sensibilidad a paclitaxel en células de cáncer de próstata [43]. la expresión de miR-148a también se ha demostrado que mejora la respuesta a cisplatino y 5-FU en las células de cáncer de esófago [48]. Además de estos
in vitro
hallazgos, en pacientes jóvenes con leucemia mieloide aguda, mayor
BAALC
la expresión de genes se correlaciona inversamente con la expresión de miR-148a, y se ha demostrado asociarse con un peor resultado en pacientes tratados con quimioterapia [49]. Colectivamente, nuestras observaciones para el potencial de estado de la expresión de miR-148a como un marcador predictivo en etapa IV CRC coinciden con estas publicaciones anteriores en otros tipos de cáncer.
Nuestro estudio es también el primer intento de confirmar silenciamiento metilación mediada de miR-148a mediante la comparación directa de expresión y de metilación niveles en una gran cohorte de CRC bien anotado. Además de los estudios iniciales por Lujambio
et al.
[39], más recientemente, se demostró que el miR-148a se hypermethylated en 51 de los 78 CRC [40]. Sin embargo, ninguno de estos estudios se realizó un análisis de la expresión de miR-148a y directamente correlacionada con sus resultados hipermetilación en los tejidos. Además, ambos estudios analizaron estado de metilación miR-148a utilizando un método de PCR específica de metilación no cuantitativa, que es notoriamente no específica para la metilación, y no proporciona un umbral para la metilación que se correlaciona con la inactivación transcripcional del gen. La fuerza de nuestro estudio es que se determinó la expresión de miR-148a por QRT-PCR, y se correlacionaron los datos de expresión con resultados pirosecuenciación bisulfito cuantitativa, lo cual es un enfoque más sólido para la demostración de la desregulación metilación mediada de cualquier gen. En consecuencia, se observó una asociación inversa significativa entre la metilación y de expresión, lo que refuerza el concepto de que el miR-148a baja regulación en el CCR se debe, en parte, a la hipermetilación del promotor. También observamos una asociación significativa e independiente entre la metilación de miR-148a y pobre supervivencia en pacientes en etapa IV, destacando que la expresión y la metilación del estado de miR-148a podría ser útil como marcadores de pronóstico /predictivo en el CCR.