Extracto
Antecedentes
La exposición crónica de la piel UV conduce a defectos de diferenciación de la epidermis en los seres humanos que pueden ser restaurado en gran parte por las dosis farmacológicas de ácido nicotínico. El ácido nicotínico se ha identificado como un ligando para los acoplado a proteína G-receptores humanos GPR109A y GPR109B que señalan a través de G
inhibición de la adenilil ciclasa mediada i. Hemos examinado la expresión, distribución celular, y la funcionalidad de GPR109A /B en la piel humana y células de la epidermis de la piel derivada.
Resultados
El ácido nicotínico aumenta la diferenciación epidérmica de la piel humana dañada por el sol, a juzgar por la marcadores de diferenciación terminal de la caspasa 14 y filagrina. Ambos genes GPR109A y GPR109B se transcriben en la piel humana y en los queratinocitos epidérmicos, pero la expresión en fibroblastos dérmicos es inferior a los límites de detección. transcripciones de receptores son en gran medida sobre-expresado en cánceres de células escamosas. la proteína del receptor en la piel normal es prominente desde el basal a través de capas granulares de la epidermis, con localización celular más dispersivo en la capa basal pero predominantemente localizada en la membrana plasmática en las capas epidérmicas más diferenciadas. En queratinocitos primarios y inmortalizadas humanas normales, los receptores del ácido nicotínico muestran la localización de membrana plasmática y funcional G
señalización mediada por i. Por el contrario, en un carcinoma de células escamosas derivados de línea celular, la proteína del receptor muestra una localización celular más difuso y los receptores son casi no funcional.
Conclusiones
Los resultados de estos estudios justifican futuro genético y los estudios de intervención farmacológica para definir el posible papel específico (s) de los receptores del ácido nicotínico en la homeostasis de la piel humana
Visto:. Bermudez y, Benavente CA, Meyer RG, Coyle WR, Jacobson MK, Jacobson EL (2011) nicotínico receptor del ácido Anomalías en el cáncer de piel humana: Implicaciones para un papel en la diferenciación epidérmica. PLoS ONE 6 (5): e20487. doi: 10.1371 /journal.pone.0020487
Editor: Christophe Egles, Universidad de Tecnología de Compiègne, Francia |
Recibido: 9 Marzo, 2011; Aceptado: April 27, 2011; Publicado: 31-may 2011
Derechos de Autor © 2011 Bermúdez et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos nacionales de Salud subvenciones CA43894, CA106677, CA78447, CA027502, ES06694 y HD048837. La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. MKJ y ELJ son principales en NiadynePharma, Inc., cuya investigación patrocinada se gestiona de de acuerdo con las políticas de conflicto de intereses de la Universidad de Arizona.
Introducción
la piel funciona como una barrera biológica metabólicamente activa la protección contra las agresiones ambientales externos. El mantenimiento de la barrera de la piel es crítica ya que muchas enfermedades dermatológicas se caracterizan por integridad de la barrera defectuosa que resulta en una disminución de la capacidad protectora de la piel. formación de la barrera de la piel se caracteriza por un proceso de homeostasis donde división de las células en la capa basal migran continuamente hacia la superficie de la piel y se someten a la diferenciación terminal y muerte celular en última instancia, previsto para formar la capa córnea compuesta de queratinocitos terminalmente diferenciados y otras sustancias que forman la barrera [ ,,,0],1]. Sin embargo, la proliferación epidérmica y la diferenciación se deben equilibrar con cuidado ya inadecuados resultados de la proliferación en un adelgazamiento de la capa epidérmica de la piel y la pérdida de protección de barrera, mientras que el aumento de la proliferación sin coordinar mayor diferenciación conduce a trastornos tales como la psoriasis y el cáncer de piel [1].
Una amenaza ambiental importante que resulta en múltiples alteraciones en la estructura y función de la piel es la exposición a la luz ultravioleta del [2] sol. exposición a la luz solar crónica en última instancia, puede conducir a la hiperproliferación epidérmica con diferenciación deteriorado dando lugar a lesiones de queratosis actínica (AK) y el carcinoma de células escamosas (SCC) de la piel. La principal característica histológica de SCC es la sustitución de los queratinocitos epidérmicos normales madurado con células escamosas atípicas pobremente diferenciados [3]. Mudgil et al. han demostrado en equivalentes epidérmicos de la piel que transformaron, mal queratinocitos diferenciados pueden ser accionados para diferenciar en la presencia de un número suficiente de queratinocitos normales [4]. Estas observaciones sugieren que los tratamientos que podrían promover la diferenciación epidérmica en la piel dañada por la luz tienen el potencial de restablecer el equilibrio de la proliferación y la diferenciación requerida para mantener la homeostasis de la piel y por lo tanto podrían contrarrestar el desarrollo de lesiones AK y SCC
.
Una de las efectos farmacológicos de ácido nicotínico en la piel dañada por la luz es el de promover la diferenciación epidérmica [5], aumentando la posibilidad de que un receptor de ácido nicotínico puede estar implicado. El receptor denominado GPR109A (HM74A en los seres humanos y PUMA-G en ratones), recientemente dio la designación de HGNC NIACR1, fue descubierto en adipocitos bien diferenciados, el bazo y las células inmunes [6], [7], [8]. parejas GPR109A a proteínas G de la G
i familia, una proteína G inhibitoria, que de las señales de unión a la disminución de la adenosina 3 ', 5'-monofosfato cíclico (cAMP) de producción a través de la inhibición de la adenilato ciclasa en una toxina pertussis ligando de manera -sensible [6], [7], [8]. GPR109A es un miembro de una subfamilia de receptores acoplados a proteína G (GPCR) compuestas de GPR109A y GPR81 ambos de los cuales se encuentran en los seres humanos y roedores. GPR109B (también denominado HM74) es otro miembro de esta familia de receptores que se une aunque con baja afinidad para el ácido nicotínico y sólo está presente en los seres humanos. El ácido nicotínico se activa tanto GPR109A y GPR109B con CE
50 valores de 0.1 M y 100 M, respectivamente [9]. Si bien se considera poco probable que el ácido nicotínico es el ligando endógeno de estos receptores, las dosis farmacológicas de ácido nicotínico que actúan a través GPR109A median ambos efectos deseados anti-lipolíticas, así como efectos vasodilatación cutánea no deseados asociados con la terapia de ácido nicotínico por vía oral [6], [7 ], [8], [10], [11]. Dado que se ha sugerido inducida por el ácido nicotínico de la formación de prostanoides responsable de enrojecimiento de la piel que tenga lugar en las células de Langerhans cutánea dendríticas, la expresión de GPR109A en la piel se ha estudiado en este contexto [10], [12], [13], [14] ; Sin embargo, poco se sabe acerca de las funciones de los receptores del ácido nicotínico en otros aspectos de la biología de la piel. Aquí examinamos la expresión, distribución celular, y la funcionalidad de GPR109A y GPR109B en la piel y células de la piel derivada. Nuestros resultados muestran que los cánceres de células escamosas tienen expresión anormal GPR109A /B, distribución celular, y la función, indicando que estos receptores están implicados en la homeostasis de la piel.
Materiales y Métodos
Cultivo celular
Los queratinocitos epidérmicos humanos normales (NHEK, Lonza, Suiza) fueron cultivadas en forma rutinaria EpiLife (GIBCO /Invitrogen) que contiene suplemento de crecimiento de queratinocitos humanos por menos de 10 duplicaciones de población. Normales fibroblastos diploides humanos, CF3, (población duplicaciones menos de 30, Oklahoma Medical Research Foundation, Oklahoma City, OK) transformada-Ras, la línea celular establecida de queratinocitos epidérmicos humanos inmortalizados, HaCaT, y HaCaT, regalos del Dr. Norbert Fusenig ( Centro alemán de Investigación del cáncer, Heidelberg, Alemania) [15], la línea humana de carcinoma epidermoide de células, A-431 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA), y la línea celular de carcinoma de células escamosas, SCC-25 (ATCC ) se cultivaron de forma rutinaria en de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma Aldrich, St. Louis, MO) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS, Hyclone /Fisher Scientific). Todas las células se mantuvieron en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2 a 37 ° C.
transcriptasa reversa reacción de polimerasa en cadena (RT-PCR)
El ARN total de tejido adiposo, la placenta , pulmón, y la piel se compraron de Stratagene (Cedar Creek, TX) y 1 g de cada uno de ARN se utilizó para realizar la síntesis de ADNc utilizando el kit TaqMan transcripción inversa a partir de Applied Biosystems (Foster City, CA). Se realizó la PCR utilizando los siguientes cebadores para GPR109A y GPR109B: GPR109A - hacia adelante - 5 'CACCACACAGACACACACCTCCTTGCTGG 3', GPR109B - hacia adelante - 5 'CACCATACAGACACACGCCACTTTGCTGG 3' y el cebador inverso para ambos genes - 5 'CAGTGACATTACTCGATGCAACAGCCCAAC 3' sintetizado por Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, IA). condiciones de ciclación térmica fueron como sigue: la activación de la ADN polimerasa a 94 ° C durante 1 min, seguido de 25 ciclos de amplificación a 94 ° C durante 1 min y 62 ° C y 68 ° C durante 1 min cada
RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR)
total RNA a partir de células cultivadas se preparó usando el sistema de purificación de RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante. Congelado logra humanos normales biopsias de piel, queratosis actínica, y los CE se obtuvieron del proyecto titulado "La quimioprevención de la Piel Las muestras del Proyecto Programa de Cáncer archivados para análisis adicionales, revisado por la Universidad de Arizona IRB (Tucson, AZ), Número del Proyecto 08-0201-04 . El estudio del que se obtuvieron las muestras se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Principios de Helsinki. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los sujetos. El ARN total de muestras de tejido de la piel se preparó utilizando el tejido fibroso Mini Kit RNeasy (Qiagen) siguiendo el protocolo del fabricante. la síntesis de ADNc se realizó utilizando el kit TaqMan transcripción reversa (Applied Biosystems, Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante, utilizando hexámeros al azar y 1 g de ARN total. Por basado en TaqMan de perfiles de expresión QRT-PCR, se añadió 25 ng de cada cDNA incluyendo ARN total de escamosas muestras de carcinoma de células (Asterand, Detroit, MI) a la iTaq Supermix (BioRad, Hercules, CA) junto con las sondas TaqMan MGB de acuerdo para el protocolo del fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA). QRT-PCR se realizó como se describe anteriormente [16]. Sondas diseñadas para detectar específicamente GPR109A humano (Expresión TaqMan Ensayo del gen Hs02341584_s1) y las transcripciones GPR109B (Expresión TaqMan Ensayo del gen Hs02341102_s1) se compraron de Applied Biosystems. monitorización de la fluorescencia en tiempo real se realizó con el ABI Prism 7000 (Applied Biosystems). En los tejidos de la piel humana, deshidrogenasa gliceraldehído 3-fosfato (GAPDH) y la expresión de genes β-actina cambiar con el grado de malignidad en comparación con 18S rRNA, que se mantuvo constante. En las células cultivadas, GAPDH y la expresión de β-actina se mantuvieron constantes en comparación con 18S rRNA; por lo tanto niveles de expresión relativos de los diferentes transcripciones se determinaron por comparación con los genes de mantenimiento, 18S rRNA para tejidos y GAPDH de células cultivadas. Todas las mediciones de expresión se realizaron por triplicado utilizando al menos tres muestras de ADNc generados de forma independiente. Los resultados se expresan como la media ± error estándar de la media (SEM). la expresión génica relativa se calculó como se describe anteriormente [17]. Las alteraciones en la expresión génica se consideraron significativas a 1,5 veces el cambio y p = 0.05.
Anticuerpo Generación y purificación
Para el análisis de GPR109A humana y GPR109B, una costumbre, el anticuerpo comercial se generaron en conejos utilizando un péptido sintético (RHHLQDHFLEIDKKNC) para generar antisueros reconociendo el N-terminal de GPR109A y GPR109B (Sigma-Genosys, Woodlands, TX). el mantenimiento de los animales y la producción de anticuerpos se realizaron por Sigma-Genosys acuerdo con el protocolo revisado y aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales Sigma-Genosys (IACUC), OPRR Aseguramiento A4182-01; USDA Número de registro 93-R-283. Los antisueros se purificaron por afinidad usando el kit de Pierce Aminolink de acuerdo con el protocolo del fabricante (Rockford, IL). Los anticuerpos fueron validados mediante la demostración de que los extractos de células HeLa, que no expresan el receptor, no muestran inmunotransferencias positivos, pero los extractos de células HeLa (American Type Culture Collection, Manassas, VA) transfectadas con el receptor de ácido nicotínico sí mostró bandas positivas en la posición de la migración esperada. Además, las células CF3 que no mostraron la expresión del receptor de QRT-PCR tampoco mostraron inmunotransferencias positivos. Además, todos los análisis de inmunotransferencia incluye un control que mostró que el péptido contra el que los anticuerpos se generaron compitió por la señal.
análisis de inmunotransferencia
SDS-PAGE y Western blot se realizaron como se describe anteriormente [ ,,,0],18]. poblaciones de células adherentes se lisaron en tampón de lisis enfriado con hielo (cloruro de sodio 150 mM, fluoruro sódico 50 mM, 50 mM de fosfato de potasio, pirofosfato de sodio 40 mM, 500 l Triton X-100, 100 l SDS, 200 l 1 M Tris-HCl pH 7,4 en agua y 1 tableta de completo de mini cóctel de inhibidores de proteasa, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) durante 30 min a 4 ° C. Los lisados se centrifugaron a 12.000 rpm durante 30 min a 4 ° C. La concentración de proteína de los lisados se determinó utilizando el kit de ensayo de proteína BCA ™ (Pierce, Rockford, IL) según las instrucciones del fabricante. Veinte microgramos de proteína se añadieron a 4 × tampón de carga (250 mM Tris pH 6,8, 8% de SDS, 20% de glicerol, 0,012% de azul de bromofenol, 4% β-mercaptoetanol), se calentó a 95 ° C durante 5 min, a electroforesis en 12,5 % en geles de SDS-poliacrilamida, y se transfirieron a membranas de PVDF (Amersham, Piscataway, NJ). Todas las membranas se bloquearon durante 1 h con 5% de leche sin grasa en Tris Buffered Saline (TBS) más 0,1% de Tween-20 (10 mM TBS-T, pH 7,4) y se incubaron durante la noche a 4 ° C en anticuerpo primario o en primaria anticuerpo plus 1000 exceso de péptido molar (utilizado para generar el anticuerpo) con respecto al anticuerpo, se incubaron en 5% de leche no grasa TBS-T 24 h antes de su uso. Las membranas se incubaron y se desarrollaron en Immobilon ™ Western quimioluminiscente HRP Sustrato (Millipore, Billerica, MA) según las instrucciones del fabricante. Después de la transferencia inicial, las membranas se volvieron a sondar para β-actina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) para asegurar una carga uniforme. Las manchas se escanearon y se analizaron con el software ImageJ versión 1.39u (NIH, Bethesda, MD). Los valores reportados para las proteínas diana se normalizaron a los respectivos niveles de beta-actina los borrones 'en al menos tres experimentos independientes.
inmunocitoquímica (CPI)
HaCaT CF3, NHEK, HaCaT, Ras-transformado, a-431, y SCC-25 células se hicieron crecer en cubreobjetos. Para la fijación, las células se lavaron dos veces con TBS, se incubaron en 4% de formaldehído en TBS durante 30 min, y se enjuagaron dos veces con TBS. Para etiquetar los receptores GPR109A /B, bloqueo de biotina endógena se realizó utilizando NeutrAvidin Protein ™ biotina-Binding (Pierce) durante 30 min a temperatura ambiente. Inmediatamente después, las células se incubaron en 3% de albúmina de suero bovino disuelta en TBS (BSA-TBS) tampón de bloqueo durante 1 h y se incubaron durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo primario diluido en tampón de bloqueo (01:10). Para los experimentos de competencia de péptidos, se incluyó un exceso de 1000 veces de péptido. El día siguiente, las células se lavaron 3 veces durante 5 minutos cada uno con TBS. La etapa de bloqueo se repitió y las células se incubaron en 01:25 biotina-SP-conjugado IgG AffiniPure de cabra anti-conejo (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) durante 30 min a 37 ° C. Los portaobjetos se lavaron con TBS y se incubó en 1:25 estreptavidina Quantum Dot 605 conjugados (Millipore) durante 45 minutos a 37 ° C. Después de lavados exhaustivos con TBS, cubreobjetos se montaron utilizando medio de montaje que contiene glicerol al 90% y el 10% de TBS. Los immunostained diapositivas se colocaron a 4 ° C y se visualizaron el día siguiente bajo un microscopio de fluorescencia.
La inmunohistoquímica (IHC)
La detección inmunohistoquímica de GPR109A /B se realizó en secciones en parafina procedentes de la normalidad biopsias de piel humana. El material archivado de un estudio llevado a cabo de conformidad con la Declaración de Principios de Helsinki revisado por la Junta de Revisión Ética de la opinión Integ, Austin, TX. Todos los sujetos leyeron y firmaron un formulario de consentimiento aprobado por el IRB. Todos los participantes, los que administran las intervenciones, y los que evaluaron los resultados fueron cegados a la asignación a los grupos. secciones incluidas en parafina se deparaffinized en xileno y se hidrataron en una serie graduada de alcohol, las secciones se sumergieron en ácido cítrico en un baño de agua a 87 ° C durante 20 min para mejorar la recuperación de antígenos. Las secciones fueron lavadas en TBS y se bloquearon en 3% BSA-TBS durante 20 min. Inmediatamente después del bloqueo, las secciones se incubaron en anticuerpo primario en 3% BSA-TBS (01:10) durante la noche a 4 ° C. Para los experimentos de competencia de péptidos, se incluyó un exceso de 1000 veces de péptido. El día siguiente, las secciones se lavaron en TBS, bloqueado una vez más, y se incubó en 01:25 biotina-SP-conjugado IgG AffiniPure de cabra anti-conejo (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) durante 30 min a 37 ° C. Las secciones fueron lavadas con TBS y se incubaron en 1:25 estreptavidina Quantum Dot 605 conjugados (Millipore) durante 45 minutos a 37 ° C. Después de lavados exhaustivos con TBS, cubreobjetos se montaron utilizando medio de montaje que contiene glicerol al 90% y el 10% de TBS. Para los experimentos de competencia de péptidos, las secciones se lavaron en TBS y se incubaron en 1:1000 FITC de cabra anti-IgG de conejo (Jackson ImmunoResearch Laboratories) durante 1 h a TA.
análisis IHC de la caspasa 14 y filagrina involucrado procedimientos análogos usando SC5628 de anticuerpos (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) para la caspasa 14 y 3137-500 (Abcam, Cambridge, MA) para la filagrina. La cuantificación de la tinción de anticuerpos se llevó a cabo como se describe anteriormente [5].
Ensayo de cAMP
NHEK, HaCaT, Ras-transformado HaCaT, A-431, SCC-25, y las células se sembraron a CF3 una densidad de 25.000 células en placas de cultivo de 35 mm. Dos días más tarde, medio de cultivo se retiró y se reemplazó con medio de cultivo que contiene ± 100 ng /ml de toxina pertussis (incubaron durante la noche), ± 10 M de forskolina en presencia o ausencia de ácido nicotínico a diferentes concentraciones durante 1 h antes de la prueba. A excepción de los estudios de respuesta a la dosis, la concentración final de ácido nicotínico utilizado fue de 100 mM. Medición de los niveles intracelulares de cAMP se realizó utilizando el kit de AMP cíclico completa EIA (ensayo de diseños, Ann Arbor, MI) según las instrucciones del fabricante. Los experimentos se repitieron tres veces con cultivos de células independientes. Los datos se presentan como media ± SEM de tres experimentos independientes.
Resultados
El ácido nicotínico promueve la diferenciación epidérmica de la piel humana dañada por la luz
exposición UV crónica lleva a la alteración de la diferenciación epidérmica y aumentaron la proliferación epidérmica que puede resultar en lesiones de queratosis actínicas y cánceres de células escamosas de la piel [19]. Hemos concluido previamente que miristil nicotinato (MN), un profármaco que proporciona el ácido nicotínico a la piel, promueve la diferenciación epidérmica con la función de barrera de la piel mejorada asociada en la piel crónicamente dañada por la luz, a juzgar por los cambios en la epidermis y el espesor del estrato córneo, la disminución de las tasas de pérdida de agua transepidérmica y el aumento de la dosis mínima de eritema [5]. Para examinar los efectos de MN en la diferenciación de manera más directa, dos marcadores de diferenciación epidérmica, caspasa 14 y filagrina [20] fueron evaluados en sujetos con daño solar de la piel en un ensayo clínico controlado con placebo [5]. Higo. 1A muestra un ejemplo de muestras de biopsias teñidas al inicio del estudio y después de 12 semanas de aplicación tópica de una formulación que contiene 5% de Mn y Fig. 1B muestra la cuantificación de la caspasa 14 y la filagrina en los sujetos tratados con las formulaciones de placebo o Mn. La presencia de MN resulta en un aumento en relación con placebo de aproximadamente 30% para la caspasa 14 y 20% para la filagrina. La formulación de placebo sustituido miristato de miristilo para MN, descartando cualquier efecto del alcohol mirístico que se genera como ácido nicotínico se libera a partir del profármaco.
Arrays de tejido de muestras de biopsia de piel de un estudio clínico de los efectos de nicotinato miristilo (MN) en sujetos humanos con piel dañada por la luz [5] se tiñeron para los marcadores de diferenciación terminal caspasa 14 y filagrina. Panel A: Un ejemplo de una muestra de biopsia al inicio del estudio y 12 semanas de tratamiento MN teñidas con H & amp; E, y la inmunotinción para la caspasa 14 o la filagrina. Panel B: La cuantificación de la tinción para el placebo (n = 27) y MN tratados (n = 31) grupos para la caspasa 14 y filagrina. Se utilizó t de Student para comparar placebo y MN tratada se muestran los grupos y los valores de p.
genes del receptor del ácido nicotínico se expresan en condiciones normales
piel humana
La promoción de la diferenciación epidérmica ácido nicotínico nos llevó a caracterizar los receptores del ácido nicotínico en la piel humana como una diana de ácido nicotínico putativo. Los genes que codifican tanto de alta afinidad (GPR109A) y de baja afinidad (GPR109B) formas del receptor del ácido nicotínico se han descrito anteriormente y la expresión de estos genes se ha descrito en la piel [6], [12], [21], pero la caracterización muy mínimo Ha sido reportado. análisis PCR reveló la expresión de genes que codifican los receptores del ácido nicotínico en el tejido adiposo, placenta y pulmón (Fig. 2A), los tejidos mostrados previamente para expresar ambas formas del receptor de [6], [7], [8], [10], [12 ]. Higo. 2A muestra también que las transcripciones de las dos formas de alta y baja afinidad del receptor se detectaron fácilmente en la piel humana y células HaCaT. Muy poco se detectó señal en CF3 fibroblastos de piel dérmica (la señal parcial brillante se muestra para GPR109A probablemente representa la contaminación desde el carril de HaCaT, ya que no se observó en experimentos repetidos). Los niveles relativos de expresión en la piel humana examinados por qRT-PCR muestran que el gen que codifica la forma de alta afinidad del receptor se expresa a nivel de aproximadamente 2,2 veces mayor que la forma de baja afinidad (Fig. 2B).
Panel a: RT-PCR se realizó en el ARN total de tejido adiposo, placenta, pulmón, y tejidos y células de la piel usando cebadores específicos para GPR109A (fila superior) y GPR109B (fila inferior) como se describe en Materiales y Métodos. Panel B: QRT-PCR se realizó en ARN total de seis tejidos de la piel humanos normales diferentes utilizando sondas específicas para GPR109A (columna gris oscuro) y GPR109B (la luz de las columnas grises), los receptores como se describe en Materiales y Métodos. Se utilizó t de Student para comparar GPR109A a GPR109B, * p = 0.05. Panel C: análisis QRT-PCR se realizaron en el ARN total de diez tejidos carcinoma de células escamosas humanas utilizando sondas específicas para GPR109A (columnas de color gris oscuro) y GPR109B (ligeras columnas grises), los receptores. Los resultados representan la media ± SEM. Se utilizó t de Student para comparar a la piel humana normal, * p = 0.05.
genes del receptor del ácido nicotínico se expresaron sobre-en los cánceres de piel de células escamosas
La expresión de ambos GPR109A y GPR109B relación a la de la piel normal se examinó en los cánceres de células escamosas (SCC) de diferentes etapas de la progresión (Fig. 2C). muestras de la Etapa I de SCC muestran un ligero aumento en la expresión de ARNm de GPR109A, mientras que la expresión GPR109B mRNA no es significativamente elevado. En el estadio II y tumores IIB, la expresión de mRNA GPR109A se eleva aproximadamente 3 veces mientras que la expresión GPR109B de nuevo sigue siendo similar a la de la piel normal. En el estadio III y en los tumores unstaged clasificado como "SCC invasivo", los dos perfiles de expresión del receptor se elevan hasta 16 veces en relación con tejidos de la piel humana normal. En general, el aumento de expresión de los genes GPR109 se incrementa con la etapa de la progresión del cáncer.
genes del receptor del ácido nicotínico se transcrito y traducido en líneas de células de la piel
Varias líneas de células de la piel se examinaron mediante QRT PCR para la expresión génica GPR109A /B y los resultados se compararon con respecto a los queratinocitos normales primarias humanas epidérmico (NHEK). queratinocitos inmortalizadas epidérmicas (células HaCaT), queratinocitos epidérmicos tumorigénicas (Ras transformadas HaCaT), una línea celular de carcinoma epidermoide derivados de vulva informó previamente para contener los receptores nicotínicos de ácido (A-431), y una línea celular de carcinoma de células escamosas humano (SCC- 25) expresar ARNm para ambos receptores (Fig. 3A). El exceso de expresión en relación con NHEK se observa hasta 40 veces en las células de cáncer de piel en comparación con NHEK (Fig. 3A). En contraste, la expresión de los receptores del ácido nicotínico en dermis derivados de fibroblastos diploides humanos normales (CF3) es indetectable
Panel A:. QRT-PCR se realizó en ARN total de queratinocitos epidérmicos humanos normales (NHEK), inmortalizada humana queratinocitos epidérmicos (HaCaT), inmortalizadas transformados por ras queratinocitos humanos epidérmico (Ras transformadas HaCaT), células epidermoides humanas de carcinoma escamoso células de carcinoma de células (A-431), (SCC-25), y fibroblastos diploides humanos (CF3), utilizando sondas específicos para GPR109A (columnas de color gris oscuro) y GPR109B (luz columnas grises), los receptores. Se utilizó t de Student para comparar con NHEK, * p = 0.05. Los paneles B y C: Expresión de proteínas de GPR109A y GPR109B en células de piel humana. Los extractos celulares de NHEK (carril 1), HaCaT (carril 2), Ras transformadas HaCaT (carril 3), A-431 (carril 4), y SCC-25 (carril 5) se sometieron a SDS-PAGE y análisis de inmunotransferencia Western utilizando un anticuerpo contra GPR109A /B pre-incubaron en ausencia (panel B) o presencia (panel C) de 1.000 veces en exceso péptido contra el que el anticuerpo se genera en relación con anticuerpo purificado. ß-actina se utilizó como control de carga para los análisis de inmunotransferencia Western. Una blot representativo se muestra de tres experimentos independientes. Las densidades relativas se cuantificaron utilizando ImageJ. Representación gráfica muestra las unidades densitométricas promedio de tres experimentos independientes. Se utilizó t de Student para comparar con NHEK, * p = 0.05.
Para determinar si se traducen transcripciones de los receptores de ácido nicotínico, se examinaron los extractos de células de proteínas GPR109A /B utilizando un anticuerpo anti-péptido desarrollado y caracterizado en nuestro laboratorio (Ver Materiales & amp; Métodos). Este anticuerpo se dirige a una secuencia cerca del extremo N-terminal común a ambos receptores y no diferencia entre el GPR109A altamente homólogos y proteínas GPR109B. Western blot análisis muestran que la proteína del receptor del ácido nicotínico se detectó en todas las líneas celulares examinadas en el tamaño esperado para los dos receptores de ácido nicotínico (~42 kDa) (Fig. 3B). El péptido usado para generar el anticuerpo compitió eficazmente la señal de anticuerpo, demostrando la selectividad de anticuerpos (Fig. 3C). La cantidad de proteína en relación con ß-actina es más alta en los, y líneas de células malignas transformadas inmortalizadas examinados en comparación con NHEK.
receptores de ácido nicotínico en la piel humana están presentes en la epidermis y el folículo piloso
Para determinar la localización celular de GPR109A /B en la piel humana, se realizaron análisis de inmunotinción. Hemos observado que GPR109A /B se expresa a partir de la capa basal a través de las capas espinosa y granular de la epidermis y en los folículos pilosos de la piel humana normal (Fig. 4A). aumento mayor (Fig. 4B) revela que la expresión GPR109A /B parece estar distribuido más uniformemente a través de la célula en las capas de células basales de la epidermis y muestra una distribución más periférica en las capas espinosas y granulares donde los queratinocitos se encuentran en etapas posteriores del terminal de diferenciación. Una etiqueta fluorescente alternativa, isotiocianato de fluoresceína (FITC), para detectar la unión de anticuerpos anti-péptido se utiliza en la Fig. 4C para demostrar que el péptido usado para generar el anticuerpo efectivamente bloqueado de unión en estos tejidos (Fig. 4D).
La inmunohistoquímica (IHC) se realizaron análisis en secciones de piel humana incluidas en parafina utilizando anticuerpo contra GPR109A /B. Los paneles A y B utilizados estreptavidina Quantum Dot 605 conjugados para la detección. Paneles C y D utilizan FITC de cabra anti-IgG de conejo para la detección. Panel A: muestra la inmunotinción Representante se muestra a 200 × magnificación. Panel B: Muestra representativa IHC muestra a 400 × magnificación. Paneles C y D: Representante muestras IHC muestran a 400 × magnificación en ausencia (panel C) o presencia (panel D) de la competencia con el péptido utilizado para generar el anticuerpo. Abreviaturas: SC, de la capa córnea; SG, estrato granuloso; SS, spinousum estrato; SB, estrato basal. marcador de tamaño representa 2 micras.
receptor de ácido nicotínico localización celular varía entre las células epidérmicas cultivadas
células NHEK se tiñeron utilizando el anticuerpo anti-péptido (Fig. 5A) y la competencia péptido bloqueado la tinción (Fig. 5B). La tinción aparece en la periferia de los agregados de células que forman "estructuras de adoquines", mientras que las células aisladas parecen tener un patrón más difuso de etiquetado (Fig. 5A). En HaCaT células, expresión GPR109A /B se localiza principalmente a la periferia (Fig. 5C). En contraste, en Ras transformado-HaCaT (Fig. 5D), A-431 (Fig. 5E), y SCC-25 (Fig. 5F) la localización de la membrana de plasma se acompaña de etiquetado en todo el citoplasma. La expresión del receptor en los fibroblastos de la piel, CF3, es indetectable (datos no mostrados)
Los paneles A y B:. inmunocitoquímica (CPI) analiza la utilización de un anticuerpo contra GPR109A /B se realizaron en NHEK se muestra en rojo y se fusionó con nuclear DAPI en azul. El panel A muestra la tinción utilizando el anticuerpo GPR109A /B y Panel B muestra la tinción en presencia de exceso de 1000 veces de péptidos utilizados para elevar el anticuerpo. Panel C: HaCaT, Grupo D: transformada-Ras HaCaT, Grupo E: A-431, Grupo F: SCC-25. Para todos los paneles, la ampliación fue de 400 × marcador de tamaño y representa 10 micras.
queratinocitos normales demuestran una G funcional acoplado a proteína G nicotínico señalización a través de
receptor de ácido i cuya función se ve disminuida en cáncer de piel células
la mayoría de las caracterizaciones de la funcionalidad de los receptores de ácido nicotínico se han estudiado en las células que no expresan los receptores inherentemente pero en la que los genes de los receptores se transfectan y sobre-expresado. En nuestros estudios, hemos examinado la funcionalidad del receptor intrínseca mediante la medición de la capacidad del ácido nicotínico para inhibir la formación de cAMP estimulada por forskolina en ausencia de la expresión heteróloga. En estas condiciones, la contribución relativa de la formación de AMPc sensible ácido nicotínico es menor que en las células transfectadas. tratamiento Forskolin provocó la formación de cAMP en todas las células estudiadas con una acumulación de cAMP 170-200 pmol por mg de proteína en un 1 h de incubación y la presencia de 100 mM de ácido nicotínico inhibe la producción de cAMP inducida por la forskolina diferencialmente en los diversos tipos de células ( Fig. 6A). El grado relativo de inhibición en las diversas líneas celulares por el ácido nicotínico se muestra en la Fig. 6B. La inhibición de la formación de AMPc por ácido nicotínico a través de los receptores intrínsecas fue de aproximadamente 44% en las células NHEK, 43% en HaCaT y 39% en las células HaCaT transformadas con Ras. Por el contrario, cAMP estimulada por forskolina se redujo significativamente en las células derivadas de tumores. El ácido nicotínico inhibe sólo el 23% en las células A-431 y 13% en SCC-25 células. Higo.