Extracto
Antecedentes
Wnt5a es una glicoproteína secretada no canónica de la familia Wnt que juega un papel importante en el desarrollo y progresión del cáncer. Estudios previos indican que Wnt5a está regulada positivamente en el cáncer de próstata y sugirió que Wnt5a afecta a la migración y la invasión de células tumorales de próstata. Este estudio tuvo como objetivo evaluar el valor pronóstico de la expresión de la proteína Wnt5a en el tejido de cáncer de próstata y su potencial para predecir el resultado después de la prostatectomía radical en pacientes con cáncer de próstata localizado.
Metodología y Resultados
El análisis inmunohistoquímico de un microarray de tejido que contiene las muestras de próstata de 503 pacientes con cáncer de próstata localizado mostró significativamente más alta expresión de la proteína Wnt5a de cáncer en comparación con núcleos benignos de los mismos pacientes (p & lt; 0,0001). Los pacientes con alta expresión de la proteína Wnt5a tuvieron resultados significativamente mejores en términos de tiempo hasta la recurrencia bioquímica en comparación con los pacientes con bajos niveles de expresión (IC p = 0,001, 95% 1,361-3,570, Peligro relación de 2.204). Una combinación de la expresión de alto Wnt5a con bajos niveles de Ki-67 o la expresión del receptor de andrógenos tuvo incluso mejor resultado en comparación con todos los demás grupos. Además, hemos encontrado que la expresión Wnt5a correlacionó significativamente con VEGF y con Ki-67 y del receptor de andrógenos expresión, aunque no muy significativa. In vitro, hemos demostrado que Wnt5a recombinante disminuyó invasión de células DU145 y 22Rv1 y que siRNA desmontables de la proteína endógena Wnt5a llevado a una mayor invasión de las células LNCaP y 22Rv1.
Conclusión
Se demuestra que conserva la sobreexpresión de la proteína Wnt5a en pacientes con cáncer de próstata localizado predice un resultado favorable después de la cirugía. Esta conclusión, junto con nuestros datos in vitro que demuestran la capacidad de Wnt5a a afectar a las propiedades invasivas de las células de cáncer de próstata, sugiere un efecto supresor de tumores de Wnt5a en el cáncer de próstata localizado. Estos resultados indican que Wnt5a se puede utilizar como un marcador predictivo y que también es una diana terapéutica plausible para el tratamiento de cáncer de próstata localizado
Visto:. Syed Khaja AS, Helczynski L, Edsjö A, Ehrnström R, Lindgren A, Ulmert D, et al. (2011) Nivel elevado de proteína en el tejido Wnt5a cáncer de próstata localizado, está asociado con un mejor resultado. PLoS ONE 6 (10): e26539. doi: 10.1371 /journal.pone.0026539
Editor: L. Alana Welm, Instituto de Cáncer Huntsman, Universidad de Utah, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Abril, 2011; Aceptado: September 28, 2011; Publicado: 24 Octubre 2011
Derechos de Autor © 2011 Syed Khaja et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue apoyado por la Fundación sueca del cáncer (AB y TA), el Consejo Sueco de Investigación (AB y TA), las bases Söderberg (TA), Malmö University fundaciones hospital de Investigación (AB y TA), la Fundación del cáncer de la Gunnar Nilsson (AB y TA ) y la Unión Europea el 6º Programa Marco (P-Mark), Grant número LSHC-CT-2004-503011. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes conflictos: una solicitud de patente tiene sido presentado con Anders Bjartell y Tommy Andersson como inventores en el que, en base a los presentes resultados, se proponen para el tratamiento de pacientes con cáncer de próstata con tumores con una expresión endógena Wnt5a bajo con una sustancia que reconstituye Wnt5a señalización en los tumores de próstata de tales pacientes. Esta aplicación no altera la adhesión de los autores a todos los PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El cáncer de próstata (CaP) es el principal cáncer que afecta a los hombres de todas las razas y la segunda causa principal de muerte en los países desarrollados [1]. Los andrógenos y el receptor de andrógenos (AR) juegan un papel crítico no sólo en el desarrollo normal, el crecimiento y la función de la glándula de la próstata, sino también en la carcinogénesis y la progresión del CaP [2]. Inicialmente, las células de CaP son comúnmente dependiente AR para su crecimiento y supervivencia, y por lo tanto responden a la terapia de privación de andrógenos (ADT), pero en las etapas posteriores células de CaP se convierten andrógenos insensible, y el cáncer de próstata resistente a la castración fatal (CRPC) desarrolla [3] . Los mecanismos moleculares responsables de la transición a la CRPC son poco conocidos, sin embargo, el cambio más consistente asociado con el crecimiento resistente a la castración en génica global perfiles de expresión de xenoinjertos de CaP fue un aumento en los niveles de ARNm de AR [4]. El aumento de expresión de AR se considera que es una característica clave de CRPC y se ha demostrado como consecuencia de una mutación o de amplificación de AR o por el aumento de expresión causado por factores de crecimiento desregulado o varios co-reguladores [5]. Aunque no tenemos acceso a los factores pronósticos en el CaP, como el grado de Gleason, estadio TNM, estado de los márgenes y de PSA en suero niveles quirúrgicos, existe una necesidad urgente de identificar nuevos biomarcadores, que pueden mejorar de manera significativa, ya sea solos o en combinación de otros biomarcadores, nuestra capacidad de predecir los resultados en pacientes con CaP. Estudios previos han sugerido una posible relación entre las vías de señalización de Wnt-AR y β-catenina en el desarrollo y progresión del CaP [6], [7].
Recientemente, se ha prestado atención a la función de las proteínas Wnt y la señalización Wnt en el CaP. El nombre proviene de Wnt "sitio de integración MMTV-relacionadas sin alas" y se sugirió originalmente por Nusse y compañeros de trabajo en 1991 [8]. proteínas Wnt constituyen una familia de glicoproteínas secretadas diecinueve que juegan un papel importante durante el desarrollo y en la especificación del destino celular, la migración celular y la polaridad celular [9], [10]. proteínas Wnt se pueden clasificar en al menos dos subfamilias; Wnt canónica que promueven la transcripción mediada por β-catenina y no canónica de Wnt. la señalización de Wnt se produce de una manera automática o paracrina a través de la unión de moléculas de Wnt secretadas a siete proteínas receptoras transmembrana Frizzled (Fz) en la ausencia o presencia de co-receptores tales como LRP 5/6 y ROR [10]. Varios componentes de la señalización de Wnt también han sido implicados en la génesis de cánceres humanos; se observó la sobreexpresión de Wnt-1 en el adenocarcinoma epiteliales mamarias [11] y en varias líneas celulares y tejidos de CaP CaP. Wnt-1 de expresión correlaciona positivamente con la puntuación de Gleason, β-catenina y con niveles de PSA en suero [12]. Además, basado en la determinación de los niveles de mRNA en Wnt5a los tumores de próstata se ha sugerido que la expresión anormal de la Wnt5a no canónica está involucrado en CaP [13].
Wnt5a, uno de los más estudiados no canónica Wnts, es una proteína esencial en la inducción de Wnt y el control de la polaridad Wnt /plana celular (PCP) y el Wnt /Ca
2 + vías [14], [15]. Además, Wnt5a no sólo se ha demostrado para contrarrestar la vía /β-catenina Wnt, sino también, en contextos específicos, para activar esta vía [16]. La posibilidad de Wnt5a para inducir diferentes eventos de señalización corriente abajo puede al menos en parte, explicar la presencia de los informes que sugieren una naturaleza ambigua de Wnt5a; que tiene ya sea un supresor tumoral o tumor promoción de la función dependiendo del contexto y el tipo de tumor [16]. Estudios anteriores han demostrado que Wnt5a es downregulated en ciertos tumores malignos, incluyendo el cáncer colorrectal (expresión de la proteína) [17], neuroblastoma (niveles de ARNm) [18], carcinomas ductal de mama invasivo (expresión de la proteína) [19], [20] y leucemias (ARNm niveles) [21], lo que indica un efecto supresor de tumor de Wnt5a. Curiosamente, otros informes han lugar sugerido un efecto oncogénico de Wnt5a basado principalmente en una regulación al alza en células de cáncer de mama (niveles de mRNA) [22], el cáncer gástrico (expresión de la proteína) [23], el melanoma (expresión de la proteína) [24], el cáncer de pulmón y el cáncer de próstata (la expresión del ARNm) [13]. la expresión del gen y la proteína aberrante de Wnt5a en el CaP y los posibles mecanismos moleculares subyacentes se han descrito en informes anteriores [13], [25], [26], [27]. En un estudio reciente, basado en los estudios de Affymetrix de líneas epiteliales de la próstata y de células de cáncer normales, Wang et al demostraron que el aumento de la transcripción del gen Wnt5a en el CaP era debido a la hipometilación; lo que sugiere que la regulación epigenética de la expresión Wnt5a puede ser de importancia en la progresión del CaP [28]. Cualquier conclusión a partir de los datos de un análisis de Affymetrix sin un análisis simultáneo de la expresión de proteínas Wnt5a es peligroso ya que el ARNm Wnt5a tiene una larga transcrita región 3 'abierto para la regulación de traducción. Los datos que apoyan dicha regulación traduccional de la expresión de proteínas Wnt5a ha sido reportado anteriormente [19], [29].
Estudios recientes han demostrado aumento de los niveles de proteína Wnt5a y en el CaP en comparación con el tejido benigno [25], [26] . Yamamoto et al demostraron
in vitro
que desmontables de Wnt5a reduce las propiedades invasivas de DU145, y sobre-expresión de Wnt5a estimulaba la invasión de las células PC3 [25]. Por el contrario, Wang Q y colaboradores demostraron que Wnt5a recombinante no indujo un aumento de la motilidad en las mismas células PC3 [26]. Además, se ha demostrado mediante técnicas de inmunohistoquímica (IHC) que la expresión Wnt5a correlacionado con puntuación de Gleason ≥8 en 24 pacientes de una cohorte de 98 pacientes con CaP que se habían sometido a prostatectomía radical. Esto podría indicar que Wnt5a promueve la agresividad, ya que los pacientes con bajos niveles Wnt5a tenían una mejor supervivencia libre de recaída en comparación con los pacientes con niveles altos Wnt5a [25].
Informes contradictorios sobre el papel de Wnt5a en la progresión del CaP y escaso información sobre la expresión Wnt5a en relación con el resultado clínico, nos instó a investigar la expresión de la proteína de Wnt5a en una gran cohorte de base poblacional y su posible papel para predecir el resultado después de la cirugía para localizado y (91%) del CP predominantemente de baja ley. Esta investigación se complementó con
in vitro
experimentos para explorar las posibles razones de la capacidad de Wnt5a para actuar como un biomarcador predictivo en esta categoría de pacientes. En el presente estudio se confirmó que los niveles de proteína Wnt5a se upregulated en el CaP en comparación con el tejido benigno, pero nos pareció que el aumento de expresión de la proteína Wnt5a tuvo un efecto positivo en los resultados en pacientes con CaP, ya que los pacientes con niveles altos de proteína Wnt5a había un mejor resultado en comparación con los pacientes con bajos niveles Wnt5a después de la prostatectomía radical. En buen acuerdo, también se encontró que esta capacidad de Wnt5a para influir positivamente en el resultado en pacientes con CaP podría ser debido a su capacidad para inhibir la invasión de células de CaP sin afectar inicialmente su proliferación
in vitro
. Además de Foxy5 (un péptido que imita Wnt5a) también disminuyó la invasión, pero no la proliferación de estas células.
Resultados
Evaluación inmunohistoquímica de Wnt5a, AR, Ki-67 y VEGF
Un microarray tisular (TMA) con la construcción de núcleos de duplicados de ambos tejidos benignos y malignos de 503 pacientes (características de los pacientes en la Tabla 1) que se habían sometido a prostatectomía radical, se immunostained para Wnt5a, AR, Ki-67 y VEGF (Fig. 1A- F). se detectó expresión de la proteína Wnt5a en el compartimiento citoplásmico de las células epiteliales y de vez en cuando en las células del estroma de cáncer y muestras de tejidos benignos. cáncer de los tejidos de la mayoría de los pacientes (82%) mostraron una fuerte inmunotinción citoplasmática homogénea, mientras que la mayoría de los tejidos benignos (65%) mostró inmunorreacción débil apoyo que una regulación de la proteína Wnt5a se produce en el tejido de cáncer. Los resultados de la puntuación manual de las intensidades de tinción citoplásmica en las células epiteliales malignas y benignas se ilustran en la Fig. 1G-I. Se encontró que la diferencia entre Wnt5a intensidades de tinción en el cáncer y las muestras benignas ser significativa (p & lt; 0,0001) se llevó a cabo cuando se combina prueba de suma de rangos de Wilcoxon. En casi el 80% de los pacientes se encontró una fuerte intensidad de la tinción Wnt5a (unidad arbitraria 2 o 3) en las muestras de cáncer, mientras que sólo el 35% de los pacientes muestran una fuerte tinción en muestras de tejidos benignos. Para más detalles sobre los datos de puntuación de Wnt5a, AR, Ki-67 y VEGF núcleos teñidos se dan en la Tabla 2.
A & amp; B) Los paneles muestran immunostainings representativos Wnt5a en las áreas de tejido benignas y cancerosas del mismo paciente C & amp; D) Los paneles muestran immunostainings AR nuclear de representación en las áreas de tejido benigna y cáncer de E & amp; F) El VEGF inmunotinción paneles de contorno en las zonas de tejido benignos y de cáncer de la misma paciente. Todos los insertos en los paneles representan aumento (40 ×) imágenes de la zona indicada por la flecha en la imagen más grande visto en 15 × magnificación. G, H & amp; I) Los paneles esbozo ilustraciones gráficas de Wnt5a, AR y expresiones de proteína VEGF en las muestras benignas y cancerosas en pacientes con CaP. El bar en cada panel se esbozan 100 micras.
tinción del receptor de andrógenos era predominantemente nuclear como se esperaba y, en general, más intenso en el cáncer en comparación con las muestras de tejidos benignos que se detallan en la Tabla 2. el setenta por ciento de núcleos tumorales fueron intensamente teñidas en comparación con 53% de núcleos benignas.
Nuclear Ki-67 expresión se utilizó como un marcador de proliferación (Figura S1A, B, C, D). No hubo diferencias significativas en la tinción con Ki-67 entre el cáncer y núcleos benignos, como el 14% de los núcleos benignos fueron negativos para Ki-67, mientras que sólo el 5% de los núcleos de los cánceres fueron Ki-67 negativo. En cuanto a Ki-67 tinción positiva nuclear, casi el 9% de los núcleos de cáncer tenía una puntuación de tinción más de 2, mientras que el número correspondiente a los núcleos benignas fue sólo el 2,5% (Tabla 2).
La expresión de VEGF, como un marcador sustituto para la angiogénesis, se observó en el citoplasma de células tanto epiteliales malignas y benignas, con áreas de cáncer que muestran mayor en comparación con la tinción benigna. Más del 73% de los núcleos de cáncer mostraron una fuerte inmunotinción de VEGF, mientras que sólo el 51% de los núcleos benignos mostró inmunorreacción fuerte (Tabla 2).
La diferencia entre AR, Ki-67 y tinción de VEGF en el cáncer frente a intensidades núcleos benignos fue estadísticamente significativa (p & lt; 0,0001). cuando se realizó la prueba de Wilcoxon de suma de rangos (Tabla 2)
Correlación de la expresión tisular Wnt5a con AR, Ki-67 y VEGF
En el presente cohorte de expresión Wnt5a mostró una correlación positiva y estadísticamente significativa con la expresión de VEGF (rho de Spearman (ρ) = 0,396, p & lt; 0,0001), débil pero todavía correlaciones estadísticamente significativas con la expresión de AR (ρ = 0,159, p = 0,007) y Ki-67 expresión (ρ = 0,233, p & lt; 0,0001) (Tabla 3). La mayoría de los pacientes (220/365, 60%) con fuerte inmunotinción Wnt5a en tejidos de cáncer también mostraron tinción intensa AR (Tabla 4). Se observó una tendencia similar cuando se compararon Wnt5a y VEGF; 65% (219/339) de los núcleos de cáncer mostró una fuerte tinción para ambos Wnt5a y VEGF. No se encontraron diferencias en la intensidad de la inmunotinción Wnt5a cuando se compararon los grupos de pacientes con diferentes grados de Gleason. Entre los pacientes con Gleason patológico puntuación de hasta 3 + 4 expresión de la proteína Wnt5a ( "bajo grado"), el 81% había elevado en comparación con el 86% de los pacientes con mayor puntuación de Gleason (datos no mostrados). Del mismo modo, no se observó correlación entre la tinción Wnt5a y el estadio patológico T, T etapa clínica, estado de los márgenes quirúrgicos o invasión de vesículas seminales (datos no mostrados).
expresión de la proteína Wnt5a y predicción de la clínica resultado
a continuación, se evalúa si la expresión de la proteína Wnt5a en tejidos de cáncer analizados después de la prostatectomía radical para el CaP localizado podía predecir el resultado clínico, medido por el tiempo hasta la recurrencia bioquímica (BCR), el uso de PSA & gt; 0,2 ng /ml en sangre muestras con un valor de confirmación como un marcador sustituto. expresión de la proteína Wnt5a como se ilustra por IHC fue significativamente mayor en las zonas de cáncer en comparación con las zonas benignas (Fig. 1, Tabla 2). Curiosamente, cuando la curva de Kaplan-Meier se trazó entre la expresión de la proteína Wnt5a y BCR tiempo libre, un resultado favorable (p = 0,001) fue evidente para los pacientes con una expresión de proteínas de alta Wnt5a en comparación con los pacientes con expresión de la proteína Wnt5a baja (Fig. 2A). Como era de esperar, la baja expresión de AR (Figura S2C) y de Ki-67 (Figura S2 B) se asoció con resultado favorable mientras que la expresión VEFG no se asoció significativamente con el BCR tiempo libre (Figura S2D).
Todos los casos de cáncer se separaron en 2 grupos en base a las intensidades de tinción de Wnt5a, Ki-67, AR y VEGF. Los grupos de bajos incluidos los tumores con puntuaciones de 0 o 1 y los grupos de alto incluidos los tumores con puntuación de 2 ó 3. A) El panel muestra las curvas de supervivencia trazados entre la expresión alta o baja en proteínas BCR Wnt5a y tiempo libre. B) El panel muestra las curvas de supervivencia entre los trazados de alta o baja Wnt5a y Ki-67 expresiones de alta y baja en proteínas. En consecuencia, los tumores se dividieron en los siguientes 4 grupos; Wnt5a baja & amp; Ki-67 baja, baja Wnt5a & amp; Ki-67 de alta, alta Wnt5a & amp; Ki-67 baja y alta Wnt5a & amp; Ki-67 de alto. El panel C muestra las curvas de supervivencia entre los trazados de alta o baja Wnt5a y expresiones de alta y baja en proteínas AR. En consecuencia, los tumores se dividieron en los siguientes 4 grupos; Wnt5a baja & amp; AR baja, baja Wnt5a & amp; AR alta, alta Wnt5a & amp; AR baja y alta Wnt5a & amp; AR alta. D) El panel muestra las curvas de supervivencia entre los trazados de alta o baja Wnt5a y expresiones de alta y baja proteína VEGF. En consecuencia, los tumores se dividieron en los siguientes 4 grupos; Wnt5a baja & amp; VEGF baja, baja Wnt5a & amp; VEGF alta, alta Wnt5a & amp; VEGF baja y alta Wnt5a & amp; VEGF alta. En todos los paneles de alta expresión de una proteína está indicado por ↑ ↓ mientras que indica una baja expresión. Cada paso en las curvas representan la recaída en el CaP. El p-valores dados en la parte inferior derecha de los paneles indican diferencias significativas en los resultados entre el grupo más favorable y el grupo más desfavorable (véase la Tabla 4 para obtener información más detallada).
Además, examinamos si la expresión de proteína Wnt5a también podría predecir el resultado cuando se combina con cualquiera de los otros biomarcadores tisulares. Se obtuvo el mejor modelo de predicción cuando la expresión de proteína Wnt5a se combina con AR o Ki-67 expresión (Figura 2B, C)., ya que los pacientes con alta Wnt5a y baja expresión AR o baja Ki-67 mostraron una mejor supervivencia libre de recidiva (p & lt; 0,0001), mientras que los pacientes con expresión Wnt5a baja y alta AR o de alta expresión de Ki-67 tuvieron el peor resultado después de la cirugía. Los pacientes con alta expresión del VEGF Wnt5a y baja tuvieron un mejor resultado en comparación con los otros grupos (p = 0,003) o cada marcador por sí solos. Sin embargo, la combinación de alta Wnt5a y baja VEGF era inferior a cuando Wnt5a se analizó en combinación con AR o Ki-67 que indica que VEGF en no tan fuerte como AR o Ki-67 para predecir el resultado en combinación con Wnt5a en el presente contexto ( Fig. 2D). Se utilizó el análisis regressional Cox para el análisis multivariado y reveló que la expresión Wnt5a, la puntuación de Gleason y estadio T patológica fueron factores independientes que influyen en la supervivencia libre de recaída en el CaP (Tabla 4).
expresión de la proteína Wnt5a y sus efectos sobre la invasión y proliferación del CP líneas celulares
Nuestros datos muestran que los pacientes con alta expresión de la proteína Wnt5a tienen resultados más favorables en comparación con los pacientes con baja expresión de la proteína Wnt5a. Para entender mejor esta expresión de la proteína Wnt5a encontrar en una línea de SV40 inmortalizada humana normal de las células epiteliales de la próstata (PNT2) y cuatro líneas celulares diferentes CaP fueron examinados. células PNT2 tenían una baja expresión de la proteína Wnt5a endógeno mientras que no hubo expresión Wnt5a considerable en las líneas celulares LNCaP y 22Rv1 CaP (Fig. 3A). Estos datos están en buen acuerdo con nuestros hallazgos de expresión de la proteína Wnt5a en la cohorte analizada actualmente del CP y un estudio reciente realizado también en epiteliales normales de la próstata y líneas celulares de CaP [26]. Sin embargo, los análisis de las dos líneas celulares de CaP más agresivos (PC3 y DU145), reveló muy baja expresión de la proteína Wnt5a, comparable a la de la próstata PNT2 línea de células epiteliales normal (Fig. 3A). Curiosamente, los niveles de proteína Wnt5a coinciden con las expresiones de proteínas AR en estas líneas celulares (Fig. 3A).
A) Este panel muestra la expresión endógena Wnt5a y AR en cuatro líneas celulares indicó PCA (LNCaP, 22Rv1 , las células DU145 y PC3) y en una línea de células epiteliales de próstata humana inmortalizada (células PNT2). Wnt5a banda de proteína se identificó mediante la ejecución de rWnt5a en paralelo en el mismo gel. Las transferencias se volvieron a sondar para β-actina como control de carga. Las manchas de transferencia presentados son representativos de 4 experimentos independientes. B) El panel esboza la invasión relativa de LNCaP, 22Rv1, DU145 y PC3 líneas celulares después de 24 h en ausencia o presencia de rWnt5a (0,4 g /ml) en el ensayo descrito en los Materiales y métodos sección. Los resultados se dan como medias ± SEM a partir de 5 experimentos separados. Se evaluaron las diferencias en la invasión entre las células tratadas con vehículo solo o con rWnt5a para la significación estadística (p = 0,0001 para 22Rv1 y p & lt; 0,0001 para DU145). C) El panel resume la proliferación de LNCaP, 22Rv1, DU145 y PC3 líneas celulares después de 24 h en ausencia o presencia de rWnt5a (0,4 g /ml). Los resultados se dan como medias ± SEM a partir de 5 experimentos separados. No hubo diferencias significativas en la proliferación entre el control y las células tratadas rWnt5a. D) El panel representa la invasión relativo de células 22Rv1 y DU145 después de 24 h en ausencia o presencia de Foxy5 (100 M) utilizando el mismo ensayo como en el panel B. Las diferencias en la invasión entre las células tratadas con vehículo solo o con Foxy5 eran evaluado para la significación estadística (p = 0,01 para 22Rv1 y p = 0,0003 para DU145). E) El panel muestra los efectos de siRNA desmontables de Wnt5a en LNCaP y 22Rv1. Las transferencias se volvieron a sondar para α-tubulina como control de carga. Las manchas de transferencia presentados son representativos de 4 experimentos independientes. F) El panel esboza la invasión relativo de células LNCaP y 22Rv1 después del tratamiento con Wnt5a si-ARN (Wnt5a knockdown) o revueltos siRNA (control), en el mismo ensayo utilizado previamente en el panel B. Los resultados se dan como medias ± SEM de 5 experimentos separados. La diferencia en la invasión entre revueltos y si-Wnt5a derribado células fueron estadísticamente significativas para ambas líneas celulares (p & lt; 0,0001).
Se utilizaron las líneas celulares de cáncer de cuatro (LNCaP, 22Rv1, PC3 y DU145 ) para nuestros experimentos posteriores de invasión. La adición de Wnt5a recombinante (rWnt5a) disminuyó el comportamiento invasivo de las dos células de cáncer de 22Rv1 y DU145 (Fig. 3B). Ni la LNCaP ni las células PC3 respondieron a rWnt5a con un cambio en su comportamiento invasivo. El resultado con las células PC3 está de acuerdo con un informe publicado recientemente por Wang et al [26], en el que las células PC3 no respondieron a la adición de rWnt5a en un ensayo de migración cero herida. Se sabe que las células LNCaP tener una actividad muy baja invasión, y esto podría explicar por qué estas células no responden cuando se añadió rWnt5a. Sin embargo, cuando la expresión Wnt5a en las células LNCaP fue derribado usando si-ARN (Fig. 3E), hubo un aumento significativo en el comportamiento invasivo de las células LNCaP (Fig. 3F). Además, Wnt5a desmontables por si-ARN en las células cancerosas 22Rv1 también dio lugar a una mayor invasión de estas células (Fig. 3E-F y la figura S4).
Para saber si la disminución de la invasión de 22Rv1 y DU145 líneas de células con la adición de rWnt5a fue debido a la disminución en la proliferación de estas líneas celulares, se determinó la tasa de proliferación en líneas de células de CaP. La adición de rWnt5a no tenía ningún efecto significativo sobre la proliferación en estas líneas celulares durante las 24 horas utilizados para el ensayo de invasión (Fig. 3C).
Desde rWnt5a disminuyó la invasión de células DU145 y 22Rv1, ensayo de invasión se también se realizó en estas líneas celulares utilizando Foxy5 que es un hexapéptido derivada de la secuencia de aminoácidos de la proteína Wnt5a y previamente demostrado inhibir la motilidad de las células de cáncer de mama como rWnt5a [30]. Foxy5 efectivamente reprimida capacidades invasivas de estas dos líneas celulares PCA (Fig. 3D), y esta disminución en la invasión no fue causada por disminución de la proliferación como Foxy5 no afectó el estado de proliferación en estas líneas celulares (ensayo BrdU, datos no mostrados).
Discusión
a nuestro entender, esta medida sólo un estudio con un número limitado de pacientes ha demostrado un papel de la proteína Wnt5a para predecir el resultado clínico en el CP [25]. Esto nos animó a realizar un estudio sobre la expresión de la proteína Wnt5a en una cohorte más grande de pacientes con CaP bien definidos con enfermedad localizada y predominantemente de bajo grado y relacionar los resultados con la expresión de otros marcadores biológicos de tejidos conocidos y lo más importante con el BCR. El presente estudio incluyó una serie consecutiva de 503 pacientes con CaP que se habían sometido a una prostatectomía radical en 1988-2003 en el Hospital Universitario de Skåne, Malmö, Suecia con un tiempo de seguimiento medio de 41,6 meses (rango de 1,51 a 205,90). Esta cohorte de pacientes se basa grande, la población, y los pacientes están bien caracterizados (Tabla 1). En el TMA se desliza tejidos benignos y malignos de la misma paciente están presentes en los duplicados. Sobre la base de los grados de Gleason material del paciente se caracterizó aún más en cánceres de bajo grado (Gleason hasta 3 + 4) y los cánceres de alto grado (Gleason 4 + 3 o superior). Casi el 89% de los pacientes fueron clasificados como cánceres de bajo grado, lo cual es de esperar en un grupo de pacientes con CaP localizado adecuados para la prostatectomía radical. Como el control de nuestro material clínico, hemos comprobado que no había una diferencia estadísticamente significativa en los resultados clínicos entre los pacientes con bajo grado y el cáncer de alto grado mediante análisis de Kaplan-Meier de supervivencia libre de BCR (Figura S2A). Aún más el control del material clínico también reveló que el mismo ocurrió cuando se estudió la proliferación mediante la expresión de Ki-67, un biomarcador validado en el CaP tejido [31]. Los pacientes con alta expresión de Ki-67 habían reducido el tiempo de supervivencia libre de recaída en comparación con los pacientes con un bajo número de Ki-67 células tumorales que expresan (Figura S2B).
En el presente estudio se utilizó un TMA bien caracterizado anticuerpo específico para el local Wnt5a como se ha descrito anteriormente en los estudios de cáncer de mama [20]. Aquí, también se realizó la competencia con rWnt5a para confirmar la especificidad del anticuerpo en secciones de tejido de próstata (figura S3). La intensidad de la tinción se redujo de anticuerpo solo a cuando se utilizaron anticuerpo y rWnt5a y ya en una relación molar de 1:10 encontramos una clara reducción de la inmunotinción. Además, se realizó la inmunocitoquímica (Materiales suplementarios y Métodos S1) de Wnt5a en líneas celulares de cáncer de próstata (LNCaP, 22Rv1 y DU145) después del tratamiento previo, ya sea con o revueltos Wnt5a si-ARN (Figura S4A, B, C, D, E) . En primer lugar, se observó tinción citosólica de Wnt5a similar a la observada en el tejido de cáncer de próstata y en segundo lugar, la intensidad de la inmunotinción Wnt5a disminuyó significativamente en las células tratadas si-ARN Wnt5a en comparación con los tratados con revueltos si-RNA. El tratamiento con Wnt5a siRNA disminuyó el grado de inmunotinción Wnt5a a un nivel similar a la observada en las transferencias Western (Fig. 3E). Análisis de nuestra TMA muestran claramente que la expresión de proteína Wnt5a se incrementó en CaP localizado en comparación con tejido benigno de los mismos pacientes, un efecto que exhibió una fuerte significación estadística (p & lt; 0,0001; Fig. 1 A, B & amp; G, Tabla 2 ). Estos resultados están en buen acuerdo con los últimos resultados obtenidos de una cohorte más pequeña [25]. La conclusión clínica de que la expresión de proteínas Wnt5a se aumenta en el tejido CaP localizado en comparación con el tejido normal /benigna también es apoyada por el análisis de diferentes líneas celulares de próstata humanos. Se observó claramente que la línea de células PNT2, un SV40 inmortalizado línea celular derivada de epitelio normal de próstata humano expresan niveles muy bajos de proteína Wnt5a endógeno, mientras que la expresión de la proteína Wnt5a era alto en las líneas celulares LNCaP y 22Rv1 CaP. Las líneas celulares más agresivas, PC3 y DU145, tenían una expresión de la proteína muy bajo Wnt5a. Esto está en consonancia con el resultado menos favorable observado en tumores de bajo Wnt5. Sin embargo, en el material de TMA, Wnt5a no estaba regulado por disminución en el alto grado (puntuación de Gleason & gt; 4 + 3) casos de CaP. Si estos resultados aparentemente contradictorios indican una función del grado de relación Wnt5a o sólo reflejan las características individuales de los dos tumores de los que proceden las líneas celulares es difícil de decir. Como una explicación alternativa, el número de CaP de alto grado en la presente cohorte (n = 41) podría ser demasiado pequeño para detectar una Wnt5a relacionadas grado-baja regulación.
También encontramos una mayor expresión de AR, proteínas Ki-67 y de VEGF en el tejido CaP localizado en comparación con tejido benigno (Fig. 1 C-F, H-I, Tabla 2). Para obtener una primera visión de los posibles mecanismos de cómo funciona Wnt5a en CaP, se realizó un análisis estadístico de las posibles correlaciones entre la expresión de proteínas Wnt5a y la de AR, Ki-67 y VEGF, los tres bien conocido que se upregulated en la progresiva CaP. Wnt5a correlacionó significativamente con VEGF, un marcador de la angiogénesis, lo que indica que Wnt5a podría estar relacionado con el crecimiento del tumor (Tabla 3). En este sentido nuestros datos es algo diferente de los reportados a partir de análisis de cáncer de pulmón de células no pequeñas, donde Wnt5a no se correlacionó con la expresión del VEGF en el tejido de cáncer pero con VEGF en el tejido del estroma circundante [32]. Además, la expresión en el tejido Wnt5a CaP en nuestro estudio débil pero significativa con la expresión de AR (Tabla 3). análisis de expresión de la proteína mediante inmunotransferencia de tipo Western indicó que los niveles de expresión y Wnt5a AR en una línea celular epitelial de próstata inmortalizada y 4 líneas celulares de CaP diferentes emparejados entre sí, indicando una posible correlación entre Wnt5a y AR en el CaP (Fig. 3A). A pesar de estos datos, se ha demostrado recientemente que Wnt5a inhibe la actividad transcripcional de AR en las células 22Rv1 cuando estas células fueron transfectadas con un plásmido Wnt5a [33]. Por último, la expresión de proteína Wnt5a fue débil pero significativa con Ki-67 expresión (Tabla 3). Este resultado está de acuerdo con el informe sobre el cáncer de pulmón de células no pequeñas, donde la expresión Wnt5a intratumoral significativamente correlacionado con el índice Ki-67 la proliferación [32], pero en contraste con el estudio sobre el carcinoma hepatocelular donde Wnt5a tiene un efecto supresor de tumores y pérdida de Wnt5a tiene una fuerte correlación con alta Ki-67 índice de proliferación [34]. Tomados en conjunto, estos datos indican que el papel de Wnt5a señalización en la regulación de la proliferación de las células tumorales es incierto.
En la presente investigación, no hemos encontrado una correlación entre la expresión de la proteína Wnt5a y la puntuación de Gleason, aunque este último podrá ser el mejor indicador de pronóstico disponibles del resultado en el CaP [35]. Sin embargo, Gleason de puntuación tiene sus limitaciones debido a la variabilidad interobservador entre los patólogos y por lo tanto hay una necesidad de marcadores complementarios. B & amp;