Extracto
malformina C, un pentapéptido cíclico de hongos, se ha afirmado que tienen un potencial anti-cáncer, pero sin
in vivo
estudio estaba disponible para corroborar esta propiedad. Por lo tanto, se realizó
in vitro Opiniones y
in vivo
experimentos para investigar sus efectos contra el cáncer y toxicidad. Nuestros estudios mostraron malformina C inhibió de colon HCT 38 y 116 el crecimiento celular dependiente de la dosis con una CI
50 de 0,27 ± 0,18 ± 0.07μM y 0.023μM respectivamente. Esta inhibición fue explicada por el efecto de malformina C en G2 /M detención. Por otra parte, se observó expresión de H2A.X fosfo-histona, p53 hasta reguladas, exfoliados caspasa 3 y LC3 después del tratamiento malformina C, mientras que el ensayo de apoptosis indica un aumento de la población de células apoptóticas y necróticas finales.
In vivo
, el estudio patológico exhibieron la toxicidad aguda de malformina C a una dosis letal en ratones BDF1 podría ser causado por una respuesta inflamatoria aguda y sutil, en consonancia con elevación de IL-6 en el ensayo de citoquinas en plasma. Otros experimentos antitumorales y toxicidad demostraron que 0,3 mg /kg inyecta semanal era la mejor dosis terapéutica de malformina C en Colón 38 ratones BDF1 xenoinjerto, mientras que 0,1 mg /kg cada dos días no mostró ningún efecto con mayor resistencia, y 0,9 mg /kg por semana, ya sea llevado a la toxicidad letal en ratones de siete semanas o mostrado ninguna ventaja sobre el grupo de 0,3 mg /kg en ratones de nueve semanas. En general, se concluye que malformina C detiene a Colon 38 células en fase G2 /M e induce múltiples formas de muerte celular a través de necrosis, la apoptosis y la autofagia. Malformina C tiene actividad de inhibición del crecimiento celular potente, pero el índice terapéutico es demasiado bajo para ser un fármaco contra el cáncer de
Visto:. Wang J, Jiang Z, W Lam, Gullen EA, Yu Z, Y Wei, et al. (2015) Estudio de malformina C, una micótica Fuente cíclica pentapéptido, como un medicamento contra el cáncer. PLoS ONE 10 (11): e0140069. doi: 10.1371 /journal.pone.0140069
Editor: A R M Ruhul Amin, Winship Cancer Institute de la Universidad de Emory, Estados Unidos |
Recibido: 2 de mayo de 2015; Aceptado: September 20, 2015; Publicado: 5 Noviembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Yung-Chi Cheng es un miembro de la Fundación Nacional para la Investigación del cáncer, EE.UU.. Parte de su salario es de la subvención del NCI de CA-154295. La mayor parte del apoyo a la investigación es financiado por un fondo fiduciario para el laboratorio de Yung-Chi Cheng de la Universidad de Yale. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Malformins son un grupo de pentapéptidos cíclicos descubierto y aislado del filtrado del cultivo del hongo
Aspergillus niger
originalmente, y que induce a las malformaciones de las plantas de frijol y curvaturas de las raíces del maíz [1, 2] . Malformina también podría ser obtenido a partir del extracto de
Aspergillus tubingensis
[3]. En la actualidad, se identifican tres sub-grupos de Malformins, a saber malformina A, B malformina [4], y malformina C. A medida que el primer subgrupo descubierto, malformina A se compone principalmente de malformina A
1, A
2, a
3 y a
4 [5, 6], en el que malformina a
1 es más bien estudiado, y se ha informado de sus actividades biológicas incluyendo malformaciones de las plantas, los efectos antibióticos contra ciertas bacterias especies [7], el aumento de la actividad fibrinolítica [8, 9], y la prevención contra la reacción procoagulante IL1-inducida [10]. Malformina C es un fenómeno relativamente nuevo y tóxico miembro del Malformins [11] (Figura 1A). Se ha demostrado actividad antibacteriana [12] así como potente contra la malaria y las propiedades Antitripanosomiásicos [13]. Además, malformina C inhibe inducida por bleomicina punto de control G2 en células Jurkat [14], y se aseguró tener potencial en el tratamiento del cáncer. Sin embargo, hay
in vivo
estudio ha sido presentado en apoyo de su propiedad anti-tumoral. Por lo tanto, llevamos a cabo una serie de preliminares
in vitro e
in vivo
estudios para explorar los efectos anticancerígenos de malformina C y sus
in vivo
toxicidad.
(a) estructura química de malformina C. malformina C es un miembro de Malformins, un grupo de pentapéptidos cíclicos hongos. Su fórmula química es C
23H
39o
5 N
5S
2 con un peso molecular de 529,7. (B) la progresión del ciclo celular de Colon 38 células expuestas a una concentración creciente de malformina C durante 24 horas. la progresión del ciclo (C) de la célula de Colon 38 células expuestas a una concentración creciente de malformina C durante 48 horas. (D) La acumulación dependiente de la dosis de Colon fase G2-M 38 células tratadas por malformina C en concentraciones de 90 nM, 270 nM y 810 nM. En comparación con el grupo de control, el símbolo Δ representado
P
& lt; 0,05, mientras que * representado
P
& lt; 0,01. (E) Análisis del ciclo celular de Colon 38 células tratadas con combinaciones de malformina C y SN38. Todas las células se expusieron a los compuestos respectivos indicados encima del gráfico durante 24 horas y el análisis se realizaron por duplicado. Cuando se trata con SN38, no se observaron cambios significativos de la progresión del ciclo celular sin o con diferentes dosis de malformina C.
A pesar de que la incidencia y la mortalidad de los cánceres de colon y recto han disminuido en los últimos veinte años, cáncer colorrectal (CRC) sigue siendo el cuarto cáncer más frecuentemente diagnosticado y la segunda causa principal de muerte por cáncer en los Estados Unidos [15]. La quimioterapia se utiliza comúnmente para la CRC en diferentes etapas. Irinotecan (CPT-11, Camptosar) es un fármaco quimioterapéutico que impide que el ADN se desenrolle por la inhibición de la acción de la topoisomerasa I, y se utiliza para el tratamiento de CRC avanzado o metastásico. En este estudio, hemos utilizado células murino Colon 38, HCT116 células tumorales y aloinjertos como modelo para estudiar el potencial de la propiedad contra el cáncer de malformina C y elegimos CPT-11 como control para explorar su posible combinación y el mecanismo subyacente.
materiales y Métodos
material de hongos
la cultura de la
Aspergillus tubingensis
se aisló de la tierra de arena de la playa de Patong de Phuket, isla tailandesa (7.89 ° N , 98.29 ° E). El suelo de arena se recogió de una playa pública, y no se requería un permiso específico para ese lugar o tal actividad. Confirmamos que nuestros estudios de campo no implicaban las especies en peligro o protegidas. El aislado fue identificado por uno de los autores (Prof. Yixuan Zhang) en base a análisis de la secuencia de la región ITS del rDNA y su morfología. La cepa se le asignó la colección de cultivos nº de acceso 6992 en el General de China Microbiológico Culture Collection Center, Beijing. La cepa de hongo se cultivó en cultivos inclinados de agar de dextrosa de patata (PDA) a 28 ° C durante 4 días. A continuación, las esporas Barras invertidas se inocularon en 250 ml en matraces Erlenmeyer, conteniendo cada uno 40 ml de medio (1% de glucosa, 1% de sacarosa, 1% de peptona, harina de cacahuete 0,5%, 0,3% KH
2 PO
4, 0,1% NH
4Cl, 0,3% MgSO
4 · 7H
2O) y el pH final de los medios de comunicación se ajustó a 6,5 antes de la esterilización. cultivos en matraces se incubaron a 28 ° C en un agitador rotatorio a 160 rpm durante 48 horas para obtener líquido de semillas para la fermentación. La fermentación se realizó en Fernbach matraces de cultivo (500 ml) que contienen cada uno 80 ml de medio (1% de glucosa, ácido aspártico 0,2%, 0,1% KH
2 PO
4, 0,05% MgSO
4 · 7H
2O elementos y oligoelementos) y el pH final 6,0 antes de la esterilización. Los elementos traza por medio de fermentación 1L contenían 0,1 mg MnSO
4, 0,1 mg ZnSO
4, 0,2 mg de FeCl
3, 1 mg de vitamina B
1, 5μg biotina. 8% (relación en volumen) de líquido de semillas se plantaron en cada frasco de fermentación, y luego se cultivó a 28 ° C en un agitador rotatorio a 160 rpm durante 96 horas.
Extracción, aislamiento e identificación de malformina C
material de fermentación de 20 litros se filtró a vacío para eliminar el micelio, después se extrajo con alcohol n-butilo, y el disolvente orgánico se evaporó a sequedad bajo vacío, para dar un extracto crudo. 5 g de extracto bruto se disolvió en CH
3OH seguido de cromatografía en columna de gel de sílice (CC) (10 × 100 cm) usando CHCl
3-CH
elución en gradiente 3OH (15: 1 → 10: 1 → 5: 1). La fracción (0,8 g) eluyendo con 15: 1 CHCl
3-CH
3OH se separó mediante cromatografía en columna, y purificación adicional mediante RP-HPLC (Shimadzu LC-10A; DIAMonSIL C18 200 x 4,6 mm 5μm; 1 ml /min, 80% CH
3OH en H
2O para la elución, la longitud de onda de detección UV a 215 nm, malformina C t
R 13.065min) a 99% de pureza. El compuesto puro se identificó en la base de la amplia investigación espectroscópica incluyendo HR-ESI-MS, 1D-NMR y 2D-NMR. HR-ESI-MS espectros se obtuvieron en un espectrómetro de masas Bruker micro-Q-TOF. Los espectros de 1D y 2D-RMN se midieron en un espectrómetro Bruker ARX-300 (300 MHz para
1 H, 75 MHz para
13C). El compuesto puro se identificó como malformina C a través de la comparación de los datos con los que se informó anteriormente [16].
Medicamentos y líneas celulares
CPT, doxorrubicina, vincristina, taxol, VP-16, y oxaliplatino DAPI se adquirieron de Sigma. L-OddC fue proporcionada por Shire Pharmaceuticals, Inc. murino línea de células de colon 38 se estableció antes [17] y obtuvo del Dr. José Pizzorno de Ciencia Traslacional en el Instituto de Cáncer de Nevada, EE.UU.. adenocarcinoma de pulmón humano línea celular NCI-H1975 se adquirió de Instituto Nacional del Cáncer y dada por el Dr. Don Nguyen del Departamento de Patología de la Universidad de Yale. CEM linfoide humano, carcinoma nasofaríngeo humano KB y HCT líneas celulares de cáncer de colon 116 se adquirieron en la American Type Culture Collection (ATCC). líneas de células pancreáticas murinas PanO2 cáncer y KB-resistentes fueron previamente establecidos en el laboratorio y se describe antes [18-22]. Colon 38, las células NCI-H1975, CEM y KB se cultivaron en medio RPMI 1640, las células PanO2 se cultivaron en medio DMEM, y HCT 116 células en medio 5A de McCoy. líneas de células KB-resistentes se cultivaron en medio RPMI 1640 con 37nmol /L en doxorrubicina para KB-MDR, 300 nM CPT para KB300-CPT, 20 nM vincristina para KBv20c, 20μM VP16 para KB20a-VP16 y 7μM VP16 para KB7d, y todos esos medicamentos se retiró de los medios de comunicación una vez que se sembraron las células para los experimentos. Todas las células se cultivaron en medio suplementado con 10% FBS, y se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2.
Crecimiento Celular Ensayo
Las células se sembraron a 1 × 10
4 /ml en placas de 48 pocillos. Después de la incubación durante la noche, Colon 38, HCT 116, PanO2, NCI-H1975, CEM, KB, KB-MDR, KB300-CPT, KBv20c, las células KB20aVP16, y KB7d se trataron con fármacos durante 72 horas, 72 horas, 72 horas, 120 horas, 72 horas, 120 horas, 72 horas, 108 horas, 72 horas, 108 horas, y 108 horas, respectivamente. Las células se fijaron y se tiñeron con 0,5% de azul de metileno en 50% de etanol durante 2 horas a temperatura ambiente (RT), seguido de lavado con agua del grifo para eliminar el azul de metileno no absorbido. Las placas se secaron al aire durante la noche, se solubilizaron en 1% Sarkosyl y girar durante 3 horas a RT habitación. El crecimiento celular se cuantificó basándose en la cantidad de azul de metileno adsorbido de interactuar con las proteínas celulares medidos mediante un espectrofotómetro (Molecular Devices) a 595 nm. Los valores se promediaron y el valor día cero se restó de cada valor promediado incluyendo el control no tratado. Los valores tratados con fármaco se expresaron como un porcentaje del control sin tratar, y los porcentajes se representaron frente a la concentración de fármaco para generar una IC
50 valor. Todos los experimentos se realizaron por duplicado y se repitieron al menos tres veces.
Ensayo clonogénico
Colon 38 y HCT 116 células se sembraron a 2,4 x 10
5 /pocillo en seis y placas, respectivamente, y tratados con malformina C u oxaliplatino durante 24 horas. Se recogieron las siguientes celdas de día y se sembraron en nuevas placas de seis pocillos a 300 /pocillo con medio de cultivo fresco. Las colonias se tiñeron con azul de metileno después de 11 días y después se contaron. Los resultados incluyen los medios y S.D. obtenido a partir de tres experimentos independientes.
Análisis de Ciclo Celular
Colon 38 y HCT 116 células fueron sembradas por separado en placas de seis pocillos a 3 x 10
5 células por pocillo, y se incubó durante 48 horas. Varias concentraciones de C malformina u oxaliplatino se añadieron al medio de cultivo y se incubaron durante otras 24 horas. Las células se recogieron entonces utilizando pancreatina y 10μg /ml Dnase1, 37 ° C, 5 minutos y se lavaron dos veces con PBS frío. Un total de 1x10
Se tomaron alícuotas de 6 células para cada muestra, se resuspendieron en PBS y 500μL fija mediante la adición de 500μl 4% PFA. Después de 30 minutos de incubación en hielo, las muestras se lavaron dos veces con PBS frío. Antes de células de análisis se resuspendieron en 150μL 1 ug /ml DAPI en PBS durante 30 minutos, después se filtró para eliminar los agregados. El análisis se llevó a cabo en un BD Biosciences LSRII y analizados utilizando el software FlowJo (Árbol de la estrella).
Ensayo de apóptosis
A principios eventos apoptóticos se determinaron utilizando un kit de ensayo de apoptosis Vybrant#2 (Molecular Probes , V13241) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y el método descrito antes [23]. células de colon 38 se trataron con diferentes concentraciones de malformina C y CPT durante 24 horas. Las células tratadas con 3,7% de formaldehído durante 15 minutos se utilizaron como células de control positivo. El análisis se llevó a cabo en un BD Biosciences LSRII y analizados utilizando el software FlowJo (Árbol de la estrella).
Microscopía Confocal
células
Colon 38 fueron tratados con diferentes concentraciones de malformina C durante tres cursos de tiempo diferentes, incluyendo tratamiento de 24 horas, 48 horas de tratamiento, y el tratamiento de 24 horas seguido de la retirada malformina C y otra de incubación de 24 horas. Todas las células se fijaron con 4% de paraformaldehído en PBS y luego se permeabilizaron con 0,5% Triton X-100 en PBS. 3% de albúmina de suero bovino en PBS se utiliza para bloquear la unión no específica. Las células fueron entonces expuestos a anticuerpos monoclonales anti-p53, monoclonal anti exfoliados caspasa 3 o anti-LC3 monoclonal (1: 200; Cell Signaling Technology) a TA durante 1 hora, se lavaron con 0,2% de Tween 20 en PBS, seguido de isothiocyanate- fluoresceína conjugado IgG anti-conejo a una dilución 1: 400. actina citoplasmática fue contra el teñidas con 0.25μg /rodamina faloidina ml (Invitrogen). Las células fueron entonces sellados en reactivo antifade (Invitrogen). micrografías confocales fueron escaneados con un microscopio confocal de barrido láser (LSM 510; Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY).
Western Blot
Colon 38 células y HCT 116 (5 × 10
5) se sembraron en placas de 6 pocillos. Después de 24 horas, las células se trataron como se indica en las leyendas de las figuras. Las células fueron lisadas en 2 x tampón de SDS de muestra (26.7mm pH 6,8 Tris-HCl, 1% de SDS, 25% de glicerol, 0.36m β-mercaptoetanol, y 0,05% de azul de bromofenol) y se sonicaron durante 10 segundos a la cizalla de ADN. Los extractos de células enteras fueron entonces a electroforesis a través de 15% o 8% en geles de SDS-poliacrilamida y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad). Ellos se incubaron durante 1 hora a RT con solución de bloqueo (TBS, 0,1% Tween 20, y 3% de leche sin grasa), seguido por un anticuerpo específico para fosfo-histona H2A.X (Ser139) (1: 2000, mAb monoclonal de conejo ; Tecnología de Señalización celular,#9718), H2A.X total de (1: 2000, mAb monoclonal de conejo; Tecnología de Señalización celular,#7631), caspasa 3 (D2R6Y) (1: 1000, conejo monoclonal mAb; Cell Signaling Technology,#14220 ), y LC3A (D50G8) (1: 1000, mAb monoclonal de conejo; Tecnología de Señalización celular,#4599) durante la noche a 4 ° C. Las membranas se incubaron a continuación adicionalmente con rábano picante IgG conjugado con peroxidasa anti-conejo (1: 2000; Sigma) a TA durante 2 horas, y las señales se visualizaron por quimioluminiscencia potenciada (Perkin-Elmer Life Science). El fosfo-histona H2A.X y transferencias totales H2A.X se volvió a sondear con anticuerpos para ß-actina. (1: 2000; Sigma, A5316)
Los estudios en animales
Un total de treinta y 4 ± 0,5 semanas de edad, los ratones hembra BDF1 (Charles River Laboratories) fueron utilizados para el primer experimento, los ratones veinticinco 6 ± 0,5 semanas de edad para el segundo experimento, y seis 6 ± 0,5 semanas de edad, los ratones para el estudio patológico. Todos los animales fueron alojados durante dos semanas antes del experimento para adaptarse al entorno en el Centro de Yale animal, libres de patógenos específicos (SPF), 23 ± 2 ° C, 12:12 luz y oscuridad ciclo, 5 por jaula. 2 × 10
6 Colon murino 38 células se trasplantaron subcutáneamente en cada ratón para el experimento. Hemos supervisado diariamente el peso del animal, pérdida de movilidad, disminución de la temperatura corporal y el movimiento anormal o la postura, la falta de actividad de la preparación, la deshidratación, a juzgar por un tiempo de tienda de campaña 2-3 seg y /o si el ratón ha perdido más del 15% del cuerpo peso, sería retirado del estudio. Cualquier animal que parecía muy enfermo que estaba fría al tacto, encorvado, no podía moverse, comer o beber normalmente a partir del tratamiento fue sacrificado con un 30% de isoflurano (mezcla de 30% v /v isoflurano y el 70% de propileno glicol) inhalación y de cuello de útero dislocación. Después de 10 a 14 días, los ratones con tamaños de los tumores de 150-300 mm
3 fueron seleccionados en una piscina, y luego se asignaron al azar a los diferentes grupos, con 5 ratones en cada grupo. Malformina C se disolvió en 10 mM de DMSO y la concentración final de DMSO fue menor que 0,05% de la solución malformina C utilizado para el tratamiento. Diferentes concentraciones de esterilizado malformina C (0,1 mg /kg, 0,3 mg /kg, 0,9 mg /kg, 1,8 mg /kg, 2.6mg /kg) y se esterilizó PBS se administraron por vía intraperitoneal (ip) en la mañana del Día 1. después de todo el tratamiento, se recogieron muestras de sangre después de la anestesia con 30% de inhalación de isoflurano, y después los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical. muestras de tejido tumoral se recogieron después de que los ratones se confirmó la muerte y se congelaron en -70 ° C para estudios futuros. Para el estudio anatomopatológico de la toxicidad aguda de malformina C, se asignó aleatoriamente a seis ratones en el grupo PBS y el grupo de 1,8 mg /kg malformina C. Los fármacos se inyectaron i.p. y todos los sujetos fueron controlados cada 15 minutos durante 6 horas hasta que los ratones del grupo C malformina estaban cerca de la muerte. A continuación, los ratones fueron sacrificados, se tomaron muestras de sangre para la química, la parte del bazo y del peritoneo se cultivaron para bacteriología, y el resto de los tejidos examinados fueron fijadas en formalina, embebidas en parafina, y se seccionaron para estudios histopatológicos. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con un aprobado Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional la Universidad de Yale (IACUC) de protocolo (2013-07784). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Todas las secciones de este informe se adhieren a las directrices de llegar para informar la investigación con animales.
Plasma ensayo de citoquinas
El ensayo de citoquinas en plasma se llevó a cabo siguiendo el manual de instrucciones de BD citométricos de bolas Array (CBA) de ratón /manual de instrucciones Th1 de citocinas Th2 Kit. Las normas de citoquinas de ratón Th1 /Th2 se reconstituyeron en diluyente de ensayo y se diluyeron en serie a la concentración de 0-5000pg /ml. Una cantidad de 10μl de cada captura de citoquinas suspensión de perlas prueba ratón se mezcló, y 50 l de diluciones estándar o perlas de ensayo mezclado se transfirieron a tubos de ensayo. Después de añadir 50 l de reactivo de detección PE, las muestras se incubaron a TA durante 2 horas. A continuación, las muestras se lavaron, y se añadieron 300μl de tampón de lavado a cada tubo. Todas las muestras se analizaron mediante Array System BD FACS.
Análisis estadístico
Los datos se analizaron mediante una o dos vías de análisis de varianza (ANOVA) (GraphPad Prism 5), prueba t de Student (Microsoft Office Excel), y análisis de correlación (GraphPad Prism 5). La diferencia se consideró estadísticamente significativa cuando
P
. & Lt; 0,05
Resultados
La inhibición del crecimiento y clonogenicidad de malformina C frente a diferentes líneas celulares de cáncer
se examinaron los efectos de malformina C en la inhibición del crecimiento de diferentes líneas celulares de cáncer. Todas las células fueron expuestas a concentraciones crecientes de malformina C y L-OddC. El IC
50 valor se definió como la concentración de fármaco que inhibe el crecimiento celular en un 50%. L-OddC, también conocido como troxacitabina, es un análogo de nucleósido-L con actividad contra el cáncer [24-27] y se utilizó como control positivo en este estudio. Malformina C inhibió Colon 38, HCT 116, células PanO2, NCI-H1975, CEM y KB de una manera dependiente de la dosis con una IC
50 de 0,27 ± 0,07 M, 0,18 ± 0,02 M, 0,29 ± 0,05 M, 0,16 ± 0,04 M, 0,030 ± 0,008 M y 0,18 ± 0,05 mM respectivamente (S1 tabla). Malformina C tenía diferentes efectos de inhibición entre las diferentes líneas celulares de cáncer (
P
& lt; 0,01, ANOVA de una vía), y el malformina C era más potente que L-OddC para la inhibición del crecimiento de Colon 38, HCT 116 y PanO2 (
P Hotel & lt; 0,01, prueba t). Por lo tanto, se seleccionaron de colon HCT 38 y 116 para el siguiente estudio. Las acciones de malformina C sobre la capacidad de formación de colonias de Colon 38 y HCT116 se determinaron a continuación como el porcentaje de número de colonias visibles de grupo tratado con fármaco en comparación con grupo de control sin tratamiento por ensayo clonogénico. Colon 38 y HCT 116 células mostraron una pérdida dependiente de la dosis de la capacidad de formación de colonias después de expuestas a malformina C con una LC
50 valor de 0,6 ± 0,07 M y 0,7 ± 0,09 mM, respectivamente, que se definió como la concentración de fármaco que inhibe la formación de colonias en un 50%. La relación de LC
50 a IC
50 era aproximadamente de 2: 1 en Colon 38 células y 4: 1 en células HCT 116, y este resultado indica que los efectos de la malformina C en la inhibición del crecimiento de Colon 38 y HCT 116 eran parcialmente irreversible.
Efectos de malformina C en líneas celulares resistentes a drogas contra el cáncer
Los perfiles de resistencia cruzada de malformina C, en comparación con otros fármacos contra el cáncer convencionales, se estudiaron empleando KB línea celular y un número de líneas de células resistentes a los medicamentos KB bien caracterizados (Tabla 1). Malformina C muestra una resistencia 233 veces a las células KB-MDR que sobreexpresan P-gp humana proteína 170, en comparación con células KB (
P
& lt; 0,0001). También fue 4,4 veces resistentes a las células KBv20c (
P Hotel & lt; 0,001) y 2,8 veces más sensibles a las células KB300-CPT (
P Hotel & lt; 0,05) en comparación con las células KB ( Tabla 2). Para confirmar aún más la resistencia de malformina C a las células KB-MDR, verapamil (VRP), un antagonista de los canales de calcio de la proteína P-gp 170, se utilizó para revertir la resistencia a múltiples fármacos [28]. Una concentración no tóxica de VRP (5 M) se administró a las células resistentes KB además de malformina C, Taxol y Doxarubicin durante 72 horas. Con VRP, la IC
50 de malformina C para KB-MDR había disminuido significativamente, de 233 veces a 4 veces de la de las células KB (Tabla 3). Estos datos muestran que las células KB-MDR eran altamente resistentes a malformina C y el efecto resistente a los medicamentos fue revertida por la VRP.
malformina C causó G2 /M detención en Colon 38 línea celular
Los impactos de malformina C sobre la distribución de fase del ciclo celular de colon y 38 células HCT 116 fueron examinados y una concentración de 90 nm, 270 nm, 810 nm de malformina C se administró respectivamente durante 24 horas y 48 horas. Como se ilustra en la figura 1, el porcentaje de la fase G2-M gradualmente todavía aumentó significativamente en Colon 38 células tratadas con 270 nm y 810 nm malformina C tanto en 24 horas (Fig 1B y 1D) y 48 horas (Fig 1C y 1D) Los experimentos . Por el contrario, el porcentaje de la fase G1 disminuyó en las células expuestas a 810 nm malformina C. Estos resultados implicaban que malformina C induce una detención dependiente de la dosis G2-M en las células del colon 38. Sin embargo, no se observaron cambios dependientes del tiempo de la progresión del ciclo celular en Colon se encontraron 38 células (Fig 1D, Fig S1), y no hay cambios en el patrón del ciclo celular en células HCT 116 (S2 FIG). Además, se examinaron los efectos de malformina C en la progresión del ciclo celular de las células de colon expuestas a 38 SN38 durante 24 horas. Todas las células se trataron con una dosis creciente de malformina C (0nm, 30 nM, 100 nM, 300 nM) además de ningún fármaco o 9 nM SN38, respectivamente. Irinotecan (CPT-11) es un análogo de camptotecina-a inhibidor de topoisomerasa I. En el interior del cuerpo, se convierte en el metabolito activo SN38 (7-etil-10-hidroxi-camptotecina) por carboxiesterasas hepáticos e intestinales, y SN38 tiene una potencia mucho mayor
in vitro
causando daños en el ADN grave que conduce a la detención G2-M en células de cáncer. En este estudio, de nuevo se confirmó que cuando se trataron con 300 nM malformina C solo, el porcentaje de Colon fase G2-M 38 células aumentó significativamente en comparación con el control (Fig 1E). Además, SN38 induce detención G2-M en Colon 38 células y sirvió como un control positivo. No hubo diferencia significativa del patrón de progresión entre Colon 38 células tratadas con SN38 solo y los tratados con malformina C además de SN38 (Fig 1E).
acción irreversible de malformina C en la causa de muerte de células cancerosas
la inducción de la proteína p53 supresor de tumores es un evento clave para las células en respuesta al daño del ADN [29]. La mayoría de los agentes quimioterapéuticos para el tratamiento del cáncer mediante el trabajo daño en el ADN, lo que resulta en la muerte celular por apoptosis, autophapy o necrosis [30]. Para la apoptosis, las vías tanto extrínsecos e intrínsecos conducen a
caspasa 3
activación que finalmente induce la apoptosis, y por lo tanto exfoliados caspasa 3 se puede utilizar para evaluar el proceso de apoptosis [31]. Para la autofagia, la detección de la cadena ligera de la proteína asociada a los microtúbulos 3 (LC3) es ampliamente utilizado para controlar la autofagia y los procesos relacionados con la autofagia, incluyendo la muerte celular por autofagia [32]. En este estudio, p53, exfoliados caspasa 3 y LC3 se examinaron la aplicación de microscopio confocal. Todas las 38 células del colon para confocal se trataron con malformina C en las concentraciones de 0 m, 0,27 M y 0,54 M durante 24 horas, 24 horas, seguido de malformina C retirada y otro 24 horas de cultivo por medios cambiantes, y 48 horas, respectivamente ( Fig 2A). La expresión y localización de p53 se muestran en las micrografías de inmunofluorescencia que se indujo la expresión de p53 en el núcleo después de expuestas a 0,54 M malformina C durante 24 horas sin tener en cuenta si las células se cultivaron durante otras 24 horas o no (Fig 2B-2D). Cuando se tratan durante 48 horas, a pesar de p53 no se muestra en las células, el número de células se redujo significativamente, lo que indica las células que expresan p53 eran probablemente muerto de daño del ADN (Fig 2E). También, las expresiones de la caspasa escindido 3 y LC3 fueron mayores en Colon tratada malformina C 38 células, especialmente a la concentración de 0,54 M, que significaba que había más células que experimentan apoptosis y la autofagia después de haber sido expuesto a malformina C (Fig 2B-2E) .
El nivel de expresión (fluorescencia verde) se sondeó con p53 monoclonal específico, escinde anticuerpos caspasa 3 y LC3 respectivamente, seguido por conjugado con FITC anti-IgG de ratón. La actina citoplasmática (fluorescencia roja) se counterstained con rodamina faloidina. micrografías de inmunofluorescencia son tomadas por microscopio confocal. (A) Experimento de diseño-malformina C fue dada durante 24 horas y se tiñe a las 24 horas, durante 24 horas y se tiñe a las 48 h, durante 48 horas y se tiñe a las 48 h, respectivamente. (B) La tinción de inmunofluorescencia a las 24 horas después del tratamiento 24h. (C) La tinción de inmunofluorescencia a las 48 h después del tratamiento 24h. (D) La tinción de inmunofluorescencia a las 48 h después del tratamiento 48h. (E) La expresión de p53, exfoliados caspasa 3 y LC3 después de tres formas de administración de diferentes concentraciones de malformina C en base a los resultados de microscopía confocal.
malformina C dio lugar a múltiples formas de muerte celular
histona H2A.X es una histona variante que representa aproximadamente el 10% del total de las proteínas histonas H2A en fibroblastos humanos normales. En cuestión de minutos siguientes daños en el ADN, H2A.X está fosforilada en Ser139 en los sitios de daño en el DNA [33]. En nuestro estudio, 38 células de colon y células HCT 116 fueron tratados con malformina C durante 2 horas, 4 horas, 8 horas y 24 horas, y las expresiones de fosfo-histona H2A.X y H2A.X totales fueron examinados por Western blot. Como se muestra en la figura 3, se produjo un dependiente de la dosis hasta reguladas expresión de H2A.X fosforilada en Ser139 después de tratamiento de 24 horas de malformina C tanto en las células Colon 38 y HCT 116, mientras que la expresión del total H2A.X aumentó sólo en Colon 38 células después de tratamiento de 24 horas de malformina C. Además, se observó un aumento dependiente de la dosis menor de la expresión de fosfo-H2A.X después del tratamiento de 8 horas de malformina C en las células HCT 116. Cuando tomamos la relación entre H2A.X fosforilada y total, indicó que malformina C provocó la fosforilación de H2A.X en HCT 116 células en una forma dependiente de la dosis cuando se trataron durante 8-24 horas.
( a, C) La expresión de H2A.X fosforilada y total en Colón 38 células tratadas con diferentes concentraciones de malformina C (0μM, 0.14μM, 0.27μM, 0.54μM) e hidroxiurea (1 mM, 2 mM) durante 2 horas, 4 horas , 8 horas y 24 horas a prueba por Western blot, con la expresión de β-actina como control interno. La hidroxiurea se utilizó como control positivo. H2A.X está fosforilada en Ser139. (B, D) La expresión de H2A.X fosforilada y total en las células HCT116 tratadas con diferentes concentraciones de malformina C (0μM, 0.14μM, 0.27μM, 0.54μM) e hidroxiurea (1 mM, 2 mM) durante 2 horas, 4 horas, 8 horas y 24 horas a prueba por Western blot, con la expresión de β-actina como control interno. La hidroxiurea se utilizó como control positivo. H2A.X está fosforilada en Ser139.
La expresión de la caspasa 3 y LC3 fue también examinado por Western blot. Durante la autofagia, LC3AI se convierte a través de LC3AII lipidación, y LC3AII sirve como un indicador de la autofagia. Así analizamos la expresión LC3AII para probar el efecto de malformina C en la autofagia. Después de 24 horas de tratamiento de malformina C, se observó una relación dosis-dependiente sobre regulación de la caspasa escindido 3 en las células HCT 116, y una dosis-dependiente sobre regulación de LC3AII tanto en Colón 38 y HCT 116 células (Figura 4A y 4B ). Pero no hubo dosis-respuesta para el aumento de la expresión de la caspasa 3 escindida en las células del colon 38, y podría Debido al hecho de que algunas células apoptóticas separan de la placa durante el cultivo y se perdieron cuando se retiró el medio. No se detectaron cambios significativos en la expresión de caspasa 3 escindida y LC3AII después de 4 horas y 8 horas de tratamiento (Figura S5). Para investigar más a fondo el proceso de muerte de esas células con el ADN dañado, se realizó el ensayo de apoptosis y encontramos un grupo significativamente mayor de células apoptóticas tardías y células necróticas después de la exposición malformina C, mientras que el porcentaje de células apoptóticas tempranas no mostró ninguna diferencia con respecto al control ( Fig 3E). En general, encontramos que el tratamiento de 24 horas de malformina C podría causar daños en el ADN y causar la muerte celular por apoptosis, autophapy y necrosis.
(A, B) La expresión de la caspasa 3 escindida, CASPASA totales 3, LC3AI y LC3AII en las células de colon HCT 38 y 116 tratados con diferentes concentraciones de malformina C (0μM, 0.14μM, 0.27μM, 0.54μM durante 24 horas se puso a prueba mediante Western blot, con la expresión de β-actina como control interno. durante