Extracto
Antecedentes y objetivos
GLI1, como un factor de transcripción indispensable de la vía de señalización Hedgehog, juega un papel importante en el desarrollo de cáncer de páncreas (PC). metiltransferasas de ADN (DNMTs) median la metilación de la cantidad de genes relacionados con el tumor. Nuestro estudio tuvo como objetivo explorar la relación entre GLI1 y DNMTs.
Métodos
Se detectaron Expresiones de GLI1 y DNMTs en el tumor y los tejidos normales adyacentes de los pacientes con CP por inmunohistoquímica (IHC). células PANC-1 fueron tratados por ciclopamina y GLI1-siRNA, mientras que las células BxPC-3 fueron transfectadas con sobreexpresión-GLI1 vector lentiviral. Entonces GLI1 y DNMTs expresión fueron analizados por QRT-PCR y Western Blot (WB). Luego tomamos la inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP) se unen para demostrar GLI1 a DNMT1. Por último, MSP anidada fue tomada para valorar los niveles de metilación de APC y hMLH1, cuando la expresión alterada GLI1.
Resultados
Resultado de la IHC sugirió las expresiones de GLI1, DNMT1 y DNMT3a en los tejidos de PC eran todos superiores a los de los tejidos normales adyacentes (p & lt; 0,05). Después de la expresión GLI1 reprimida por la ciclopamina en el ARNm y el nivel de proteínas (baja regulación 88,1 ± 2,2%, 86,4 ± 2,2%, respectivamente), DNMT1 y mRNA DNMT3a y nivel de proteína disminuyeron en un 91,6% ± 2,2% y 83,8 ± 4,8%, 87,4 ± 2,7% y 84,4 ± 1,3%, respectivamente. Cuando golpeado al final de la expresión de GLI1 por siRNA
(
mRNA disminuyó en 88,6 ± 2,1%, la proteína se redujo en 63,5 ± 4,5%), DNMT1 y DNMT3a mRNA disminuyó en 80,9 ± 2,3% y 78,6 ± 3,8% y proteína disminuyó en 64,8 ± 2,8% y 67,5 ± 5,6%, respectivamente. La sobreexpresión de la GLI1 por GLI1 transfección génica (ARNm aumentaron 655,5 ± 85,9%, y la proteína se incrementaron en 272,3 ± 14,4%.), DNMT1 y mRNA DNMT3a y proteínas incrementaron en 293,0 ± 14,8% y 578,3 ± 58,5%, 143,5 ± 17,4 % y 214,0 ± 18,9%, respectivamente. Chip ensayos mostraron la proteína unida a GLI1 DNMT1 pero no a DNMT3a. Resultados de MSP anidada demostraron la expresión GLI1 afectó el nivel de metilación del ADN de la APC, pero no hMLH1 en el PC.
Conclusión
DNMT1 y DNMT3a están regulados por GLI1 en PC, y DNMT1 es su gen diana directa .
Visto: He S, Wang M, L Yang, Guo C, R Wan, Ke A, et al. (2011) Expresión de DNMT1 y DNMT3a están regulados por GLI1 en el cáncer de páncreas humano. PLoS ONE 6 (11): e27684. doi: 10.1371 /journal.pone.0027684
Editor: Xin Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 5 de Julio, 2011; Aceptado: 21 Octubre 2011; Publicado: 14 Noviembre 2011
Derechos de Autor © 2011 He et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Nacional Natural Science Foundation de China (81072005, 81172312) y Shanghai ciencia y Tecnología Comité (08411963000, 09JC1412200). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es una enfermedad altamente letal, que por lo general se diagnostica en una etapa avanzada de la que hay poco o ningún tratamiento eficaz. Tiene el peor pronóstico de cualquier enfermedad maligna mayor (3% de supervivencia a los 5 años) y es la cuarta causa más común de muerte por cáncer cada año en varios países. A pesar de los avances en el tratamiento médico y quirúrgico, poco efecto se ha hecho sobre la tasa de mortalidad de esta enfermedad. Una de las principales características del cáncer de páncreas es su extensa invasión local del tumor y la diseminación sistémica precoz. Por lo tanto, es una necesidad urgente para revelar los mecanismos subyacentes por los cuales las células de cáncer de páncreas se convierten invasivo y metastásico.
Hedgehog cascada de señalización se activa de forma aberrante en una variedad de tumores humanos, incluyendo el cáncer de páncreas (PC) [1]. La activación de la vía Hh requiere la unión de ligandos Hh, tales como Shh, Ihh y Dhh, al receptor de Hh Patched (Ptch), liberando así Hh molécula de señalización Smoothened (Smo) de la inhibición inducida por Ptch. Smo a su vez inicia la liberación de la GLI factor de transcripción a partir del citoesqueleto por un complejo de proteínas, por lo tanto facilita su translocación nuclear, activadores GLI continuación, se unen al motivo GACCACCCA-como para la regulación transcripcional de Hedgehog genes diana, que están involucrados en el regulación de la proliferación celular, la determinación de la celda de destino, la supervivencia celular, y epitelio-mesenquimal (EMT) y etc. Una membrana glicoproteína Human Protein Hedgehog recíprocamente (Hhip) se puede unir a todos los tres ligandos y funciones Hh para regular negativamente la actividad de Hh vía de señalización [2], [3].
cambiar la metilación del ADN es un factor clave en la oncogénesis humana [4]. En las células cancerosas humanas, se altera el patrón somática normal de la metilación del ADN. Estos cambios incluyen el aumento de la isla CpG metilación, que media gen supresor de tumor silenciar [4], y la hipometilación del ADN genómico, que puede conducir a la inestabilidad genómica [5], [6]. Citosina la metilación del ADN es catalizada y regulada por una pequeña familia de metiltransferasas de ADN (DNMTs), incluyendo DNMT1, DNMT3a, DNMT3b y DNMT3L [7]. Aunque no se ha informado de mutaciones específicas del cáncer de DNMTs, varios estudios sugieren que los genes DNMT se sobreexpresa en el cáncer humano y durante la transformación celular [8] - [11]. Varios mecanismos parecen dar cuenta de DNMTs sobre-expresión aberrante, incluyendo el control del ciclo celular, el aumento de ARNm y la estabilidad de la proteína, y DNMTs mediadas por la activación de E2F promotor [11] - [14].
A pesar de las evidencias anteriores indican que DNMTs y vía de señalización Hh activa están involucradas en el desarrollo de cáncer de páncreas, se sabe poco acerca de la correlación entre DNMTs y miembros de la vía Hh. Aquí, este estudio se realizó para investigar la expresión de GLI1 y DNMTs, y la correlación entre ellos en el cáncer de páncreas humano.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Los tejidos de cáncer de páncreas y páncreas correspondientes no cancerosas se obtuvieron del hospital Shanghai Décima Popular, donde hemos obtenido la aprobación ética del Comité de ética de las Ciencias Medicina y vida.
Los cultivos de células y el tratamiento farmacológico
cáncer de páncreas humano línea de células PANC-1 y BxPC-3 se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), estreptomicina 100 mg /ml, y penicilina 100 U /ml a 37 ° C en 5% de CO2 y 95% de aire humidificado incubadora. BxPC-3 células fueron cultivadas para la transfección lentiviral de la sobreexpresión-GLI1 vector lentiviral. células PANC-1 se sembraron a una densidad de 4 × 10
4 células /cm
2 en una placa de seis pocillos, ciclopamina (Sigma, St. Louis, MO) se disolvió en etanol al 100% y después se diluyó fresco en el día de la prueba para los experimentos de cultivo celular. células PANC-1 se trataron con la concentración final de ciclopamina en 10 mM durante 24 horas.
La inmunohistoquímica (IHC)
veinte pares de PC y los correspondientes tejidos de páncreas no cancerosas se obtuvieron de Shanghai hospital de la décima Popular. secciones tumorales pancreáticas pacientes se de-paraffinised, rehidratada, se trató con tampón de citrato 10 mM a 95 ° C para recuperar antígenos, se bloquearon con 5% de BSA, y se incubaron con anti-ratón GLI1 (1:100), de conejo anti-DNMT1 ( 1:100 anticuerpos) o conejo anti-DNMT3a (1:100; todos de Santa Cruz Biotech) durante la noche. Las secciones de tejido se incubaron con anticuerpos secundarios y reactivo DAB (gen Tech, Shanghai, China). Las secciones fueron counterstained con hematoxilina, a continuación, se deshidrataron y se visualizaron con 3,3-diaminobencidina (Gen Tech, Shanghai, China). Se realizaron controles negativos en cada caso mediante la sustitución del anticuerpo primario con PBS.
RT-PCR y PCR cuantitativa (QRT-PCR) en tiempo real
ARN total fue extraído de las células PANC-1 usando el reactivo Trizol (Invitrogen, California, EE.UU.), 1 g de ARN transcrito fue inversa a cDNA utilizando PrimeScript RT kit de reactivos (Takara Bio, Shiga, Japón). Para determinar la cantidad de mRNA, el cDNA se amplificó por PCR en tiempo real con el kit SYBR Premezcla Ex Taq RT-PCR (Takara Bio, Shiga, Japón), y la limpieza de genes β-actina se utilizó como control interno. Los ensayos de SYBR Green se realizaron por triplicado en un instrumento en tiempo real 7900HT (Applied Biosystems, CA, USA). Los cebadores usados para QRT-PCR fueron listadas (Tabla 1). Los niveles relativos de expresión se calcularon utilizando el 2
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método.
Western Blot (WB)
lisado celular total se preparó en un 1 tampón de dodecilsulfato de sodio x. Las proteínas en la misma cantidad se separaron por 6% de SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF). Después de la incubación con anticuerpos específicos para DNMT1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) o DNMT3a (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) o GLI1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) o β-actina (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), las manchas se incubaron con anticuerpo de cabra anti-conejo o anti-ratón anticuerpo secundario (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) y se visualizó con quimioluminiscencia aumentada.
inhibición mediada por ARN de interferencia pequeño de expresión GLI1 secuencias
sigilo pequeños ARN de interferencia (siRNA) para GLI1 fueron diseñados y sintetizados por GenePharma para apuntar GLI1 ARNm. La cadena codificante para GLI1 siRNA era 5'-GGCTCAGCTTGTGTGTAAT-3 '. Una secuencia de ARNsi no relacionado fue utilizado como control. En este experimento, las células se incubaron durante 12 h y se transfectaron en aproximadamente 60% de confluencia con 50 nm ARNsi dúplex utilizando Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. Todos los experimentos se llevaron a cabo 72 horas después de la transfección.
Lentiviral La transfección de sobreexpresión-GLI1 vector lentiviral
transfección Lentiviral de la sobreexpresión-GLI1 vector lentiviral PGC-FU-GLI1 se realizaron como se informó anteriormente [ ,,,0],15]. GLI1 cDNA humano se adquirió de Abierto-Biosystem (EE.UU.). La secuencia de ADNc completa de GLI1 se generó por PCR y se insertó en el PGC-FU-3FLAG vectorial (GeneChem Company, Shanghai, China) que fue linealizado con
Age I
y
NheI gratis ( Fig. S1, S2). El fragmento de 3320 pb resultante se confirmó por secuenciación (Fig. S3). vector lentiviral fueron producidos por co-transfectó en células 293T con la construcción helper. Los títulos de 2-5 × 10
se consiguieron de forma rutinaria 7 TU /ml. BxPC-3 células fueron transfectadas con el vector de expresión y GLI1 lentiviral fue establecido por PCR en tiempo real y análisis de Western blot.
Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP)
complejos inmunes-GLI1 ADN-proteína eran preparated como se informó anteriormente [15], después de reticulado inversa, el ADN se extrajo con fenol /cloroformo y se precipitó. La presencia del dominio promotor DNMT1 y DNMT3a que contienen motivos Gli1 en el ADN inmunoprecipitado fue identificado por PCR utilizando cebadores (Tabla 2). Las condiciones de PCR para la región promotora y DNMT1 DNMT3a fueron: desnaturalización de 30 segundos a 94 ° C, recocido 30 s, alargamiento de 1 hora a 72 ° C. temperaturas de recocido se muestran en la tabla 2. La amplificación de la región DNMT1 y promotor DNMT3a se analizó después de 40 ciclos. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces.
preparación de ADN
ADN se extrajo mediante TIANamp ADN genómico Kit (Tiangen, Pekín, China). Aproximadamente 500 ng de ADN fueron extraídos de bisulfito conversado y la columna purificado por metilación del ADN EZ-Gold ™ Kit (Zymo Research, Orange, CA, EE.UU.) para hacer muestra de 10 microlitros.
anidados MSP
estado de metilación de ADN en las regiones promotoras de la APC (poliposis adenomatosa coli) y hMLH1 (MutL homólogo humano 1) se determinaron por el método de MSP modificado adicionalmente como un enfoque anidado de dos etapas con los cebadores descritos anteriormente [16], [17 ]. En el paso uno del MSP anidada, se diseñaron los cebadores para amplificar las dos regiones genómicas metilados y no metilados. Los productos se diluyeron igualmente 1:100 y se someten a la etapa dos de la MSP anidada con cebadores diseñados para reconocer diferencias en la secuencia de bisulfito inducida entre las regiones genómicas metilados y no metilados. Las condiciones de PCR para la etapa uno fueron las siguientes: 95 ° C caliente inicia × 5 min, luego 40 ciclos repetitivos de desnaturalización (95 ° C x 30 s), recocido (56 ° C x 30 s), la extensión (72 ° C × 30 s), seguido de una extensión final de 5 min a 72 ° C. Y que para el paso dos fueron: 95 ° C arranque en caliente × 5 min, después 30 ciclos repetitivos de desnaturalización (95 ° C x 30 s), hibridación (59 ° C x 30 s para APC, 60 ° C x 30 s para hMLH1 ), la extensión (72 ° C x 30 s) seguido de una extensión final de 5 min a 72 ° C. MSP productos se separaron por electroforesis en geles de agarosa al 2%.
Análisis estadístico
Los datos cuantitativos se expresan como media ± desviación estándar (SD). Datos en tiempo real PCR se analizó de acuerdo con las diferencias de expresión del gen diana por la prueba t pareada y eran 2
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transformados antes del análisis. IHC datos se analizaron mediante la prueba de Chi-cuadrado. Un valor de p menor de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
GLI1, DNMT1 y DNMT3a fueron reguladas en tejidos de cáncer de páncreas humano
Para confirmar los papeles de GLI1 y DNMTs en el desarrollo de cáncer de páncreas humano, se analizó en primer lugar si sus expresiones fueron alteradas en tejidos de cáncer. Por lo tanto, hemos realizado un estudio GLI1, DNMT1 y expresión DNMT3a en 20 tejidos de biopsias pareadas de los pacientes con CP por IHC. Se encontró que GLI1, DNMT1 y expresión DNMT3a eran todas más altas en la mayoría de PC en comparación con los tejidos normales (14/20 frente a 5/20, p = 0,004; 15/20 frente a 6/20, p = 0,004; 13/20 versus 5 /20, p = 0,011; respectivamente; Figura 1). 14 de 20 casos de PC tenían una mayor expresión de la proteína GLI1, entre los cuales 12 casos expresaron niveles más altos de proteína DNMT1 (p = 0,004) y 11 casos expresan mayores niveles de proteína DNMT3a (p = 0,012)
.
El examen inmunohistoquímico para GLI1, DNMT1, proteínas DNMT3a se llevaron a cabo en 20 pares de PC y tejidos normales adyacentes. se muestran imágenes representativas. tejidos normales adyacentes no mostraron tinción débil o para GLI1, DNMT1 y DNMT3a, sin embargo, la incidencia de todas las tres proteínas inmunoreactividad nuclear era mucho mayor en los tejidos de PC. Todas las microfotografías se obtuvieron a 200 × magnificación.
ciclopamina y GLI1 siRNA tanto DNMT1 inhibido y DNMT3a expresión
Para determinar si la actividad Hh afectó a la expresión de DNMTs, se utilizó la ciclopamina, una inhibidor clásico de la vía de señalización Hh, para disminuir la expresión de GLI1. células PANC-1, que se había informado anteriormente de expresar un alto nivel de GLI1 [15], fueron tratados con 10 mM de ciclopamina durante 24 h. Después, QRT-PCR y el BM fueron tomadas para analizar la expresión de GLI1 y DNMTs. DNMT1 y mRNA DNMT3a disminuyeron 91.6.0 ± 2,2% y 83,8 ± 4,8%, respectivamente, cuando GLI1 mRNA disminuyó en 88,1 ± 2,2%. DNMT1 y proteína DNMT3a disminuyeron en 87,4 ± 2,7% y 84,4 ± 1,3% cuando la proteína GLI1 disminuyó en 86,4 ± 2,2% (Figura 2).
células PANC-1 se trataron con 10 mM de ciclopamina durante 24 horas, a continuación, expresión relativa de GLI1, DNMT1 y mRNA DNMT3a se evaluó mediante qRT-PCR (A, B, C), mientras que la expresión de GLI1, DNMT1 y proteína DNMT3a se analizó mediante Western blot (D). El recuadro muestra una disminución sustancial en GLI1, DNMT1 y expresión DNMT3a. Los resultados se normalizaron a la de la expresión de β-actina. Todos los datos se presentan como la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes.
además diseñar y sintetizar GLI1 siRNA, a continuación, se transfectaron en PANC-1 línea celular. PANC-1 transfectadas con una secuencia de siRNA no relacionado fue utilizado como control negativo [18], y PANC-1 los tratados con Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA), sólo se usó como control en blanco. 72 horas después de la transfección, QRT-PCR y el BM fueron tomadas para determinar la expresión de GLI1 y DNMTs. DNMT1 y mRNA DNMT3a disminuyeron en 80,9 ± 2,3% y 78,6 ± 3,8%, respectivamente, cuando GLI1 mRNA disminuyó en 88,6 ± 2,1%. DNMT1 y proteína DNMT3a disminuyeron en 64,8 ± 2,8% y 67,5 ± 5,6% cuando la proteína GLI1 disminuyó en 63,5 ± 4,5% (Figura 3).
células PANC-1 se transfectaron con GLI1 siRNA, 72 horas después de la transfección, expresión relativa de GLI1, DNMT1 y mRNA DNMT3a se evaluó mediante qRT-PCR (A, B, C), mientras que la expresión de GLI1, DNMT1 y proteína DNMT3a se analizó mediante Western blot (D). El recuadro muestra una disminución sustancial en DNMT1 y expresión DNMT3a después de la interferencia GLI1. Los resultados se normalizaron a la de la expresión de β-actina. Todos los datos se presentan como la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes.
La expresión de DNMT1 y DNMT3a se upregulated con GLI1 sobreexpresión
Para confirmar aún más la regulación de DNMT1 y por DNMT3a GLI1, hemos diseñado y construido un vector de lentivirus que sobreexpresa GLI1, y se transfectó en BxPC-3 con la expresión GLI1 más bajo en las líneas celulares PC como anterior reportado [15]. Las células transfectadas con vector vacío lentivirus se utilizaron como controles negativos, mientras que se utilizaron células sin transfección como controles en blanco. 48 horas después de la transfección, QRT-PCR y el BM fueron tomadas para determinar la expresión de GLI1 y DNMTs en las tres líneas celulares. DNMT1 y mRNA DNMT3a aumentaron 293,0 ± 14,8% y 578,3 ± 58,5%, respectivamente, cuando GLI1 ARNm se incrementó en 655,5 ± 85,9%. DNMT1 y proteínas DNMT3a aumentaron en 143,5 ± 17,4% y 214,0 ± 18,9%, respectivamente, cuando la proteína GLI1 aumentó un 272,3 ± 14,4% (Figura 4).
BxPC-3 células fueron transfectadas con PGC-FU-GLI1 , la expresión relativa de GLI1, DNMT1 y mRNA DNMT3a se evaluó mediante qRT-PCR (A, B, C), mientras que la expresión de GLI1, DNMT1 y proteína DNMT3a se analizó mediante Western blot (D). El recuadro muestra un aumento sustancial en DNMT1 y expresión DNMT3a después GLI1 sobre-expresión. Los resultados se normalizaron a la de la expresión de β-actina. Todos los datos se presentan como la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes.
Confirmación de la proteína unida a GLI1 región promotora del gen DNMT1
Hemos, hasta ahora, ha demostrado el papel de GLI1 en DNMT1 y Dnmt3 expresión. Sin embargo, el mecanismo subyacente a dicha regulación queda por esclarecer. Para explorar si DNMTs están directamente reguladas por GLI1 o no, se realizaron búsquedas en la DNMT1 y promotor DNMT3a para los posibles sitios de unión GLI1 a la secuencia de ADN consenso 5'-GACCACCCA-3 '[19] o 5'-TGGGTGGTC-3' [20] y se encontraron cinco sitios de alta puntuación candidatos de objetivos GLI1 en el promotor de DNMT1 y seis en DNMT3a de. Cada sitio tiene sólo dos diferencias de nucleótidos en comparación con 5'-GACCACCCA-3 'ó 5' TGGGTGGTC-3 '(Figura 5). Chip fue tomada para confirmar la relación de delimitación entre la proteína y el gen GLI /3a DNMT1. ADN extraído de las células PANC-1 se sometió a ultrasonidos en 100 a 1000 pb (Fig. S4) y como la plantilla de chip-PCR. El resultado de la electroforesis de ADN mostró la banda de ADN predicho en INPUT, GLI1-Ab, y los grupos de control utilizando postive DNMT1 humano imprimación-C, y no en la IgG y los grupos de control negativo (Figura 6). Sólo de entrada y el control positivo mostró la banda predicho usando humano DNMT1 imprimación-A, C-E y DNMT3a cebador A-E, pero no en GLI-Ab, IgG, y los grupos negativos (datos no presentados). Como producto positivo amplificado por DNMT1 imprimación-C contiene candidato GLI1 sitio de unión 2 y 3 (Tabla 2 y la Figura 5), mientras que el producto amplificado por DNMT1 cebador B contiene el sitio de unión candidato GLI1 2 fue negativa, y los resultados de análisis de la secuencia mostró que el secuencias eran la misma que la del promotor del gen DNMT1 de sitio 3 (Fig. S5), sugirió que GLI1 estaba obligado al promotor del gen DNMT1 de sitio 3 (GGCCTCCCA).
dos líneas paralelas en la parte superior de la cifra representa DNMT1 o ADN DNMT3a, respectivamente (A, B), dentro del cual los exones recuadros grises representados, marcos blancos representan intrones, y marcos de color negro promotor representado. En el promotor, pequeños recuadros grises marcadas con el número 1 al 5 (A) o del 1 al 6 (B) representaron el GLI1 posibles sitios de unión, que tiene sólo dos nucleótidos diferencia (subrayado) de la secuencia de unión GLI1 consenso, GACCACCCA. Los cebadores se diseñaron para amplificar la DNMT1 (A) o DNMT3a (B) región promotora que contiene el sitio de unión a GLI1 putativo. Se muestran la posición y la longitud de los productos amplificated por cada cebador.
Los lisados de las células PANC-1 se sometieron a inmunoprecipitación de la cromatina por el anticuerpo anti-GLI1. cromatina sonicado se utilizó como control ADN de entrada (INPUT). ARN polimerasa II se utilizó como control positivo (PC). IgG se utilizó como control aleatorio (IgG) y β-actina Ab se utilizó como control negativo (NC). se muestra la banda de chip-PCR productos amplificados por DNMT1 Primer-C (i) y por DNMT1 Primer-B (ii).
Los niveles de metilación del ADN de APC, pero no regiones promotoras hMLH1 cambian con se encontraron GLI1 expresión
Cantidad de genes relacionados con el tumor a ser silenciados por la metilación del ADN en PC, incluyendo APC (poliposis adenomatosa coli) y hMLH1 (MutL humano homólogo 1). Para acceder ya sea inhibiendo o aumentando la expresión de GLI1 también podría dar lugar a la hipo o hiper-metilación de APC y hMLH1 en el PC, se utilizó MSP anidada para evaluar el estado de metilación de PANC-1 con o sin caída GLI1 y BxPC-3 con GLI1 o sin sobre-expresión, respectivamente. Los resultados mostraron que el nivel de metilación del ADN APC aumentó en BxPC-3 células transfectadas con sobreexpresión-GLI1 Lentiviral Vector en comparación con el control negativo, y se inhibió en las células PANC-1 transfectadas con GLI1-siRNA en comparación con el control negativo. Sin embargo, el nivel de metilación del ADN de hMLH1 región promotora no ha cambiado significativamente después de la transfección (Figura 7). Esta metilación del ADN probablemente porque está coordinado por una familia de DNMTs que comprenden DNMT1, 3a, -3b y -3L, tal vez el cambio de expresión de la única DNMT1 y 3a regulada por GLI1 no era suficiente para afectar los niveles de metilación del ADN de cada tumor- genes relacionados [21].
resultados de la MSP anidada de APC y hMLH1 en seis clases de células PC respectivamente se muestran. B representa BxPC-3 células; B-G + representada BxPC-3 transfectadas con PGC-FU-GLI1 para hacer GLI1 sobre-expresión, y B-NC representó su control negativo; P representa PANC-1; P-G-si representaba PANC-1 transfectadas con siRNA y GLI1-P-NC representó su control negativo. bandas positivas en virtud M y T representan el ADN metilado y no metilado de los genes correspondientes en el panel de la derecha, respectivamente.
Discusión
En este estudio, se encontró que GLI1, y DNMT1 DNMT3a se sobre-expresan en tejidos de PC en comparación con los tejidos del páncreas no cancerosas correspondientes, entonces nos mostró que DNMT1 y expresión DNMT3a cambiar de acuerdo a la expresión GLI1 en líneas celulares PANC-1 y BxPC-3 por la interferencia GLI1 específico y transfección de genes, así como el método farmacológico
in vivo
. Más importante aún, hemos demostrado más allá de toda duda razonable que GLI1 fue capaz de unirse al promotor del gen DNMT1 del sitio 3 (GGCCTCCCA) por el chip experimentos. Por último, se utilizó MSP anidada para demostrar que la expresión GLI1 afectado el nivel de metilación del ADN de la APC, pero no hMLH1 en el PC. A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer informe demostró GLI1 como un factor de transcripción que regula la expresión DNMT1 y 3a, así como el nivel de metilación de APC en PC, y DNMT1 es su gen diana directa.
GLI1, como un factor transcripcional de la vía de señalización Hh, es upregulated en la mayoría de los tumores digestivos, incluyendo PC [22], [23]. Hasta el momento, se han identificado sólo unos pocos objetivos de abajo GLI1 [24]. Recientemente, se informó de estar implicados en la invasión y la metástasis PC, y se ha convertido en una nueva diana para el tratamiento [25], [26]. Sin embargo, poco se sabe sobre el mecanismo real implicado en la promoción de la invasión y la metástasis en PC. Por otra parte, nos hemos centrado en la acumulación de evidencia que demuestra que el carcinoma en varios órganos, incluido el páncreas, está asociado con la metilación aberrante del ADN, en la que DNMTs es el catalizador clave correlacionó significativamente con la acumulación de metilación de los genes relacionados con el tumor, entre los cuales algunos se asociaron withcell la proliferación tales como APC, algunos estaban relacionados con la reparación del daño en el ADN, tales como hMLH1, algunos eran invasión, o relacionados con la metástasis, tales como TIMP-3, SPARK, y CDH1, o muerte celular relacionada con como DAPK-1, por lo tanto jugando un papel importante en la carcinogénesis de múltiples etapas del páncreas de fases precancerosas temprana para la progresión maligna [27]. Recientemente, se encontró que la carga tumoral se reduce significativamente con la disminución de los niveles de DNMT1
in vivo
, lo que sugiere que DNMTs mediadas metilación del ADN está implicado en la carcinogénesis pancreática [28]. Sobre la base de este estudio y los informes anteriores anteriores, es posible que GLI1-DNMTs cascada de ayuda a la invasión y metástasis, con la promoción de la metilación de algunos genes invasión, o relacionados con metástasis, y puede facilitar el crecimiento tumoral mediante la promoción de la metilación de alguna relacionada con la muerte celular los genes.
Nuestro estudio mostraron que la expresión está regulada por DNMT3a GLI1 en el cáncer de páncreas humano. Sin embargo, el mecanismo real en la regulación de DNMT3a por GLI1 aún se desconoce. En los últimos años, muchos manuscritos han informado de que algunas familias de microARN podrían dirigirse DNMTs en una diversidad de cánceres humanos [29] - [32]. Por otra parte, se informó de que algunos microRNA como microRNA-29 familia fue suprimida por la transcripción c-Myc, hedgehog y NF-kappaB [33]. Sobre la base de la evidencia anterior, es posible que Hh-GLI podría regular DNMT3a a través de unos ciertos microARN, que queda por explorar.
En nuestro estudio, los ensayos de chip mostraron unen a GLI1 DNMT1 pero no DNMT3a. También hay que destacar que GLI1 elevado DNMT3a más pliegues que DNMT1. Pensamos que había algunos posibles mecanismos subyacentes de la siguiente manera: En primer lugar, GLI1 podría no regular DNMT3a directamente, sino a través de un determinado gen, lo que podría ser una quinasa o activina, y por medio de la amplificación en cascada a fin de llevar una mayor eficiencia reguladora de DNMT3a por GLI1. En segundo lugar, Hedghog-GLI1 podría regular directa o indirectamente varios genes implicados en diferentes vías de señalización, y dos o más de estos genes también regular DNMT3a y tienen efectos sinérgicos, por lo que a pesar de GLI1 no podría regular DNMT3a directamente, pero elevaría DNMT3a más pliegues cuando se sobre-expresa. Para resolver esta cuestión, es necesario explorar más genes diana de erizo-GLI1, y para investigar la diafonía entre diferentes vías de señalización. Pensamos que la relación entre el regulador y Hh-GLI1 DNMTs sería no es tan simple como ya confirmados. También se necesitan más estudios para explorar si el comportamiento biológico de GLI1 en PC se puede lograr mediante DNMTs regulan.
El GLI1 recientemente identificado /DNMTs eje estableció un puente entre la vía y la epigenética señalización Hh, lo que ayudaría a dilucidar el mecanismo molecular subalterno en el desarrollo de PC, y pueden proporcionar nuevas dianas terapéuticas o biomarcadores para el diagnóstico precoz.
Apoyo a la Información
Figura S1.
Identificaton de productos de clones positivos en la sobreexpresión-GLI1 la construcción del vector lentiviral. Los productos GLI1 ADNc se insertaron en vectores linealizado PGC-FU-3FLAG para construir PGC-FU-GLI1 plásmido después amplificado y purificado, y luego transformados en células competentes. Los transformantes se identifican con PCR y electroforesis en gel de agarosa al 1,5%, los transformantes-1 y -4 se mostraron como una banda de 731 pb, que resultó ser clon positivo
doi:. 10.1371 /journal.pone.0027684.s001
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figura S2.
Identificación de expresión GLI1 en el clon PGC-FU-GLI1 por WB. PGC-FU-GLI1 se construye como un vector de lentivirus expresó GLI1, que fue co-expresada con FLAG. (1) WB marcador de peso molecular, con la etiqueta 3-FLAG, fusionado con el gen GFP (48 kDa). (5-8) de la muestra después de las células 293T transfectadas PGC-FU-GLI1. (7) proteína de fusión GLI1-FLAG (122 KDa + 2 = 124 kDa kDa), la expresión GLI1 certificado en el PGC-FU-GLI1 plásmido
doi:. 10.1371 /journal.pone.0027684.s002 gratis (TIF)
Figura S3.
análisis de la secuencia de los productos de clones positivos en GLI1-sobreexpresión de la construcción del vector lentiviral. El fragmento de 3320 pb resultante se confirmó mediante secuenciación que es lo mismo con la secuencia de la región de la expresión génica GLI1 en GenBank (NM_005269.2)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0027684.s003 gratis (TIF )
figura S4.
Electropheretogram de la solución de la cromatina sonicado. solución cromatina sonicado en diferentes condiciones (100 W, 80 W y 60 W, respectivamente) fueron sometidos a electroforesis en 1,5% de gel de agarosa que contiene de etidio bromied
doi:. 10.1371 /journal.pone.0027684.s004
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Figura S5.
análisis de la secuencia de los productos amplificados por chip, que DNMT1 imprimación-C. El resultado mostró que la secuencia amplificada con DNMT1 imprimación-C es el mismo que el de gen DNMT1 región promotora que contiene el sitio de unión a GLI1 2 y 3.
doi: 10.1371 /journal.pone.0027684.s005
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