Extracto
Antecedentes
En analogía a la diferenciación de células madre normales, el cáncer de células madre modelo actual (CSC) presupone una organización jerárquica y una diferenciación irreversible en el tejido tumoral. En consecuencia, las CSC debe comprender sólo un pequeño subconjunto de las células tumorales, que se alimenta el crecimiento del tumor. Sin embargo, algunos hallazgos recientes plantean dudas sobre la aplicabilidad general del modelo CSC y preguntaron por su refinamiento.
Metodología /Principales conclusiones
En este estudio se analizaron las propiedades de CSC de células de carcinoma mamario derivan de transgénicos (WAP-T) ratones. Hemos establecido una línea celular WAP-T altamente tumorigénicas (G-2 células) que muestra rasgos similares a madre. G-2 células, así como sus derivados clonales, están estrechamente relacionados con los tumores primarios sobre los perfiles de histología y expresión de genes, y reflejan la heterogeneidad con respecto a sus estados de diferenciación. G-2 cultivos comprenden poblaciones de células en estados de diferenciación distintas identificadas por la co-expresión de las proteínas del citoesqueleto (citoqueratinas y vimentina), una combinación de marcadores de superficie celular y un conjunto de factores de transcripción. subconjuntos celulares ordenados según la expresión de CD24a, CD49f, CD61, EpCAM, Sca1, y las proteínas de la superficie celular Thy1, o marcadores metabólicos (por ejemplo, actividad ALDH) son competentes para reconstituir la composición celular inicial. eficiencia repoblación varía mucho entre los subconjuntos individuales y se ve influida por la interacción con la respectiva G-2 subconjunto celular complementaria. El equilibrio entre los estados de diferenciación está regulada en parte por el factor de transcripción Sox10, como el agotamiento de Sox10 llevó a la sobre regulación de Twist2 y el aumento de la proporción de células que representan a las células en un estado de auto-renovable, reversible cuasi-mesenquimal de diferenciación Thy1 que expresan .
Conclusiones /Importancia
G-2 células constituyen un sistema de células de cáncer de auto-reproducción, mantenida por la conversión bidireccional y unidireccional de subconjuntos celulares complementarias. Nuestro trabajo contribuye a la actual discusión polémica sobre la existencia y naturaleza de CSC y proporciona una base para la incorporación de las hipótesis alternativas en el modelo CSC
Visto:. Wegwitz M, MA Kluth, Manz C, Otto B, Gruner K, Heinlein C, et al. (2010) Las células Tumorígeno WAP-T de ratón carcinoma de mama: Un Modelo para un Sistema Celular del Cáncer autorreproductores homeostático. PLoS ONE 5 (8): e12103. doi: 10.1371 /journal.pone.0012103
Editor: José Najbauer, Nacional City of Hope Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: Abril 7, 2010; Aceptado: 14 Julio 2010; Publicado: 11 Agosto 2010
Derechos de Autor © 2010 Wegwitz et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (de 212 /23-1-3 de WD y GT), el Deutsche Krebshilfe (Forschungsverbund "Tumorstammzellen") de WD y GT, el VFK Krebsforschung gGmbH de WD y el Fonds der Chemischen Industrie . El Heinrich-Pette-Instituto el apoyo financiero de la Freie und Hansestadt Hamburgo y el Bundesministerium für Gesundheit. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la definición por Rollin Hotchkiss de materia viva "como la producción repetitiva de heterogeneidad ordenada" es aplicable a la normalidad, así como para el tejido tumoral [1]. La heterogeneidad celular observado en muchos tumores sólidos en el nivel funcional y estructural es una reminiscencia de la organización celular compleja de los respectivos tejidos normales. Esta similitud de tumor al tejido normal legitima la aplicación formal de los principios y conceptos de la biología del desarrollo de la investigación del cáncer. El modelo de las células madre del cáncer (CSC) [2], [3] describe un tumor como un sistema jerárquicamente organizado de células madre similares y su progenie diferenciada. Como postulado por el modelo de CSC, un pequeño subconjunto de células impulsa el crecimiento del tumor y es responsable de la recaída del tumor después de una terapia aparentemente exitosa. Estas células tumorales, se hace referencia como células madre cancerosas, las células tumorigénicas tumor-iniciar o, se distinguen por una combinación de marcadores de la superficie celular asociados común o único operacionalmente definidos y la capacidad de establecer la enfermedad en los ratones receptores apropiadas [4]. En contraste con el modelo estocástico de la evolución clonal, que atribuye la heterogeneidad de las células tumorales a las diferencias genéticas en la piscina de células tumorales [5], el modelo CSC postula que las diferencias epigenéticas en lugar de genéticos distinguen tumorigénico de las células no tumorigénicas, proporcionando de este modo una base para las relaciones jerárquicas dentro de la población de células tumorales [6].
los resultados recientes de que las células tumorigénicas pueden comprender una fracción significativa de la masa tumoral [7] cuestionan la organización estrictamente jerárquica del tejido tumoral [8], y bastante argumentar a favor de la "plasticidad fenotípica" de las células tumorales [9], mantenidos por mecanismos homeostáticos [10]. Por lo tanto, los CAC no existe como una población única definida por las propiedades moleculares discretas, sino que, junto con su progenie diferenciada constituye un "sistema de células madre" auto-reproducción, donde la composición celular está regulada por interconversión de diferentes estados de diferenciación [9]. Tumores de origen epitelial (carcinomas) suelen mostrar una alta heterogeneidad histológica que refleja diferentes estados de diferenciación de las células individuales. Sobre la base de tres criterios fenotípicos - polarización celular, la cohesión celular y patrón de expresión de proteínas de los filamentos intermedios citoplasmática (CIF) - se ha sugerido para definir cuatro fenotipos, que van desde lo puramente epitelial a mesenquimal por completo [11]. En consecuencia, el estado de diferenciación de las células individuales en carcinomas corresponde a un epitelial, un mesenquimales y un fenotipo intermedio. Estos estados de diferenciación pueden ser subdivididos en subtipos estables y transitorias, que en conjunto se ensamblan en un "ecosistema" dinámica. El proceso denominado transición epitelio-mesenquimal (EMT) y su contraparte, denominada mesenquimal-epitelial (MET) [12], [13], describir la conversión de los estados de diferenciación opuestos. Estas transiciones se han vinculado recientemente a stemness celular por la observación de que la inducción de EMT en modelos de cultivo de células epiteliales de mama humanos crea un subconjunto de células altamente enriquecida en células madre cancerosas [14], [15]. El modelo que emerge de estos estudios propone que en EMT carcinomas y cuenta MET para la generación de un subconjunto de células que están en equilibrio con el compartimiento epitelial tumor y son capaces de regenerar toda la población de células tumorales [9].
transgénicos y knockout ratones proporcionan singénico (o congenic) modelos para la investigación CSC, ya que permiten establecer las enfermedades de cáncer en animales inmunocompetentes que imitan la situación humana correspondiente, y son una fuente de líneas celulares que permiten estudios de las propiedades de CSC. Sin embargo, la idoneidad de los modelos de ratón es a menudo limitada por el hecho de que los efectos de la expresión de un oncogén, o la pérdida de un supresor de tumor, son ya ejercidas en la fase embrionaria y durante el desarrollo del tejido, mientras que en la gran mayoría de los cánceres humanos genéticos alteraciones que conducen al cáncer se producirán en las células de los tejidos adultos. ratones transgénicos WAP-T [16] - [19] han demostrado ser un modelo útil para el análisis de la carcinogénesis mamaria oncogén inducida en ratones adultos. En hembra WAP-T ratones activación del transgén, el virus de simio 40 (SV40) región del gen temprano flanqueado por una región ~1.4 kb aguas arriba del gen que codifica para la proteína de suero de ratón ácido (WAP) [20], se inicia durante finales el embarazo en epiteliales mamarias (ME) las células concordantes con la endógena de
Wap
de genes [21]. La expresión de SV40 principios de los genes que codifican antígeno T grande (LT) y antígeno T pequeño (st) acciona la carcinogénesis mamaria mediante la imitación de una variedad de alteraciones genéticas comúnmente visto en los carcinomas de mama humanos, como la supresión de la G1-puesto de control controlada por el PRB [ ,,,0],22], y la inactivación de la p53 supresora de tumores [23]. Como consecuencia de SV40 expresión del gen temprano, los ratones WAP-T han tenido hijos desarrollan múltiples lesiones alveolares - neoplasia intraepitelial multifocales (MIN). Algunas de estas lesiones focales avance aún más al invasor, pero los carcinomas de mama metastásico rara vez [19]. Morfológicamente, los tumores en desarrollo en ratones WAP-T son adenocarcinomas, que van desde un pozo a un fenotipo pobremente diferenciado [16]. La relevancia de este modelo se destaca por la gran similitud en la histología de los tumores de ratón con sus correspondientes tumores humanos [19].
En este estudio se preguntó si los tumores WAP-T son mejor descritos por el modelo clásico o CSC por hipótesis alternativas. Encontramos que las células tumorigénicas son relativamente frecuentes en tumores WAP-T (hasta 1/10) y son capaces de recapitular el fenotipo de sus respectivos tumores primarios después del trasplante ortotópico en ratones singénicos. Para estudiar sus propiedades oncogénicas con más detalle, se estableció a partir de un tumor WAP-T una línea celular (G-2 células). G-2 con células forman tumores de alta eficacia en ratones singénicos, que por el gen de expresión fenotípica y análisis están estrechamente relacionados con los tumores primarios. culturas G-2 de células se caracterizan por una expresión genética basal /luminal, la heterogeneidad de los estados de diferenciación y la presencia de subconjuntos celulares complementarias que se pueden separar de acuerdo con diferencias en la expresión de ciertos marcadores de superficie celular relacionados stemness. Se demuestra que los subconjuntos estrictamente separados por FACS de G-2 células son competentes para reconstituir la composición celular inicial del cultivo de células cuando se cultivan individualmente. Nuestros datos abogan por un "sistema de células de cáncer" homeostático auto-reproducción, donde el equilibrio se basa en la interconversión de los subgrupos celulares complementarias, sus interacciones y competencia transcripcional. En apoyo al modelo de EMT-CSC [9], se identificaron en la cultura del G-2 con una población auto-renovación de las células que se caracterizan por la expresión de Thy1 y la visualización de la reversibilidad espontánea de un estado de diferenciación cuasi-mesenquimal.
resultados
tumores WAP-T contienen una alta proporción de células oncogénicas
un criterio decisivo para los CAC es su capacidad para iniciar el crecimiento del tumor después del trasplante en ratones receptores apropiados y recapitular el fenotipo del original tumor. El trasplante ortotópico de células tumorales WAP-T diluidas en serie reveló que tan baja como 10
2 células de tumores bien a moderadamente diferenciados (grado bajo), y tan baja como 10
1 en las células de pobremente diferenciado (grado alto ), los tumores fueron capaces de inducir carcinomas mamarios en ratones singénicos (Figura 1A). tumores trasplantados por lo general reflejan el fenotipo de los tumores parentales (Figura 1B). Sin embargo, el trasplante de células de un tumor de bajo grado a veces también dio lugar a tumores de alto grado. Como pauci-clonalidad de los tumores WAP-T se ha observado en ocasiones [17], la derivación de células a partir de un conjunto de células del tumor de alto grado no puede excluirse.
(A) Las células de alto grado WAP-T Los tumores son más tumorigénico de las células de los tumores de bajo grado. Diluidas en serie (10
1, 10
2, 10
3, 10
4) se inyectaron recién aisladas células tumorales WAP-T en la glándula mamaria abdominal izquierda como se describe en Materiales y Métodos. (B) H & amp; E tinción de bajo grado y de alto grado, respectivamente, WAP-T primaria y su correspondiente tumor trasplantado. Los tumores transplantados crecieron después de la inyección de 10
4 o 10
2 células, respectivamente, a partir de tumores de bajo grado y de alto grado. Barra de escala:. 100 micras
Caracterización de las células G-2 y sus derivados clonales
Para evitar las complicaciones asociadas con el análisis de las células tumorales primarias, se estableció una línea celular de un tumor WAP-T (G-2 células) que permitiría el análisis del tumor mamario de iniciación y propiedades de células madre en
e in vitro
in vivo
configuración (ver Materiales y Métodos para más detalles) .
a)
in vitro
.
a partir de los primeros pasajes del G-2 cultivos celulares mostraron un patrón de crecimiento no homogénea, caracterizada por colonias apretadas embebido en adoquines similar zonas (Figura 2A). En pasajes posteriores G-2 células conservan la capacidad de formar múltiples grupos de células y tres-dimensionalmente colonias en expansión, pero adquirieron una más fibroblástica-como la morfología (Figura 2B, C). células G-2 exhiben estable, aunque la expresión heterogénea de SV40-LT, que en el complejo con la p53 de tipo salvaje endógena acumulada en el núcleo de la mayoría de las células (Figura 2D), reflejando así la expresión SV40-LT
in vivo
. La expresión de SV40-LT se correlaciona con
Wap
actividad de los genes endógenos (Figura 2E), lo que indica que los reguladores responsables de la transcripción del gen
Wap ¿Cuáles son constitutivamente activa en células G-2. En apoyo, la transducción lentiviral de 2-G células con un constructo indicador GFP bajo el control de un ~1.4 kb
Wap
fragmento del promotor mostró que, incluso después de 2 semanas en cultivo una gran población de la FACS enriquecida eGFP
+ - eGFP células se mantuvieron positivos (Figura 2F). Estas células forman ocasionalmente focos densos de células altamente expresan EGFP.
(A-C) Las imágenes de contraste de fase de G-2 células en un temprano (P9) y un pasaje posterior (p29). (D) Confocal imagen de las células G-2 teñidas con anti-SV40-LT (verde) y anti-p53 anticuerpos (rojo). Las imágenes se fusionan con una micrografía de contraste de interferencia diferencial (DIC). (E) Confocal imagen de las células G-2 teñidas con anti-anticuerpo Wap (verde). Los núcleos se visualizaron mediante tinción con DRAQ5 (azul). (F) de imágenes de fluorescencia de células en vivo del G-2 células después de la transducción lentiviral con un reportero eGFP construyen bajo el control del
Wap
-promoter. enriquecido con FACS eGFP
+ - Las células se mantuvieron en cultivo durante 2 semanas. (G y H) de la queratina 14 (rojo) y queratina 18 (verde) inmunotinción de células cultivadas G-2. Los núcleos se visualizaron mediante tinción con DAPI (azul). (I) de cuantificación basado en FACS de la queratina 18 expresión en células G-2 en el paso 20. (J y K) vimentina (verde) y SV40-LT (rojo) /queratina 18 (rojo) co-tinción de cultivaron G-2 Las células en el paso 10. Las flechas marcan G-2 células sin expresión SV40-LT detectable. Los núcleos se visualizaron mediante tinción con DAPI (azul). (L) la cuantificación basada en FACS de la expresión de vimentina en células G-2 en el paso 20. Las barras de escala: A: 150 m; B y C: 200μm; D y E: 20 micras; F, G, H y J: 100 micras; K:. 50 micras
Desde constitutiva
Wap
actividad de los genes se ha relacionado con los progenitores comprometidos bipotentes alveolares y CD61
+ progenitores luminales restringida, que son objetivos presuntivos de actividad oncogénica [24], se realizó un análisis de linaje celular por inmunofluorescencia (IF) para la tinción del epitelio luminal marcador de células de queratina 18 (KRT18), los marcadores de células basales /mioepiteliales queratina 5 (KRT5) y queratina 14 (KRT14). En los primeros pasos de la mayoría de las células G-2 expresa tanto KRT14 (Figura 2G) y proteínas de filamentos intermedios KRT18 (Figura 2H); sin embargo, el socio de co-polimerización habitual de KRT14, KRT5 la proteína, no era detectable por un anticuerpo específico (datos no presentados). En pasajes posteriores ligeras variaciones en los niveles de expresión individuales de KRT14 y KRT18 (datos no mostrados) y no se observaron una fluctuación significativa en el número de células que expresan citoqueratina que van desde 40 a 70%. La Figura 2I muestra como ejemplo la cuantificación basada en FACS de expresión KRT18 en G-2 células en el pase 20, lo que indica la transición hacia un estado de diferenciación mesenquimal. Por lo tanto, la expresión de la proteína intermedia vimentina filamento se analizó como un marcador ampliamente utilizado de células mesenquimales y células de carcinoma en fase de transición entre epiteliales y mesenquimales estados de diferenciación [25], [26]. Independiente del número de pasaje de casi todas las células G-2 expresan vimentina, por lo que la intensidad de la expresión de vimentina se extiende de una distribución citoplásmica difusa y estructuras filamentosas débiles a una red filamentosa abundante (Figura 2J-K muestran vimentina /SV40-LT y vimentina /KRT18 co -staining en el paso 10). Figura 2L muestra como ejemplo la cuantificación basada en FACS de la expresión de vimentina en G-2 células en el paso 20. expresión SV40-LT se detectó casi siempre también en células que expresan fuertemente vimentina (Figura 2J). Sin embargo, pocas células que carecen de SV40-LT estaban siempre presentes en G-2 culturas (Figura 2J, marcada por las flechas). En resumen, mediante inmunotinción análisis se observó en primer lugar que la mayoría de los G-2 células se distinguen por un estado de diferenciación se caracteriza por la co-expresión de vimentina y citoqueratinas, en segundo lugar que el número de células carentes de citoqueratinas fluctúa entre los pasajes, y en tercer lugar que una población menor de células que expresan citoqueratinas pero vimentina totalmente carente siempre está presente.
Tal heterogeneidad en los estados de diferenciación puede reflejar un origen multiclonal del cultivo celular G-2, ya que este cultivo se deriva de toda una tumor. Para hacer frente a esta posibilidad, G-2 células fueron clonados en agar blando, y diez colonias se expandieron en líneas celulares estables. Como se visualizó por SI-tinción, el patrón celular G-2 de la expresión de citoqueratina se reprodujo en el G-2 clones derivados de células (Figura S1 A-B; se muestra como ejemplo para los clones G-2C9 y G-2C11), aunque de acuerdo con el análisis qPCR los niveles relativos de
KRT14
y
KRT18
expresión génica variar notablemente entre los clones (Figura S1C-D). También en los clones secundarias, derivadas por clonación agar de G-2C9 y G-2C11 clones, una variación de 2-3 veces en la transcripción de
KRT14
y
KRT18
genes se pudo demostrar ( Figura S1E-F). Al igual que en la cultura de los padres, se observó la expresión heterogénea de vimentina en el G-2 clones de células (Figura S1G). Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que la presencia de poblaciones de células en epitelial, mesenquimal y los estados intermedios de diferenciación es una propiedad inherente del G-2 cultivos.
b)
En vivo
.
Hemos probado el tumor iniciar potencial del G-2 células de trasplante ortotópico en la glándula mamaria abdominal izquierda de los ratones receptores WAP-T nulíparas. 10
6 G-2 células forman rápidamente tumores palpables (adenocarcinomas de alto grado) en todos los ratones receptores (Tabla 1). El menor número de células trasplantadas que, cuanto más largo fue el período de demora y cuanto mayor sea su variación (Tabla 1). Incluso desde 10 inyecta G-2 células en 10 de los 12 ratones receptores consecuencia tumor fue detectado (Tabla 1), lo que indica una alta frecuencia de células tumorigénicas en la cultura G-2. La inmunotinción análisis de vimentina y KRT8 /18 expresión en tumores G-2 de células derivadas (Figura 3A) revelaron su parecido con pobremente diferenciado (G3 grado) tumores WAP-T (Figura 3B). Mientras que en bajo grado WAP-T tumores de tinción de vimentina se limita principalmente a los septos y el compartimiento del estroma (Figura 3C), la variable expresión de vimentina también fue detectable en el compartimiento epitelial (representado por KRT8 /18), en alto grado WAP-T tumores (Figura 3B), lo que indica un estado de diferenciación intermedia de las células tumorales en el G-2 derivada y los tumores de alto grado WAP-T y un estado de diferenciación epitelial de las células tumorales en tumores WAP-T de grado bajo. Co-tinción para vimentina y SV40-LT (expresión de SV40-LT está limitada a las células tumorales) permite distinguir entre las células mesenquimales del estroma reclutados en los tumores y las células tumorales que expresan un mesenquimales o un fenotipo intermedio. En trasplantados G-2 tumores (Figura 4A) y tumores WAP-T de alto grado (Figura 4B) se observó, además de la expresión esperada de vimentina en el compartimiento del estroma también la co-expresión de vimentina y SV40-LT en tumor individual Células. Por el contrario, en los tumores WAP-T de bajo grado (Figura 4C) La expresión de vimentina y SV40-LT se limita a estromales y epiteliales tumorales compartimentos, respectivamente. Los tumores que crecen a partir de G-2 células trasplantadas (Figura 5A) recapitulan las características distintivas de los tumores de alto grado WAP-T (Figura 5B), es decir, una proporción moderada de las células que expresan co-KRT14 y KRT8 /18. Por el contrario, en los tumores WAP-T de bajo grado KRT8 /KRT18 y KRT14 son frecuentemente co-expresado (Figura 5C).
(A-C) imágenes confocales representativos de tumores criosecciones de una célula G-2 -derivado del tumor (a), y un alto grado (B) y un bajo grado (C) endógena del tumor WAP-T teñidas con anti-vimentina (verde) y anti-queratina 8/18 anticuerpos (rojo). Los núcleos se tiñeron con DRAQ5 (azul). Las inserciones de potencia se utilizan para mostrar la co-expresión de vimentina y queratina 8/18 en tumores WAP-T de alto grado G-2 y. Las líneas de puntos blancos marcan las estructuras del estroma. Los confocal 3D-pilas se deconvoluted usando Huygens Essential es un software y reconstruidas con el software Imaris. Barra de escala: imagen principal: 30 m; Ampliación: 3 micras
(A-C) confocal de imágenes representativas de tumores-cryosections de un G-2 del tumor derivado de las células (A), un alto grado (B) y una baja. grado (C) endógeno tumor WAP-T teñidas con anti-vimentina (verde) y anti-SV40-LT anticuerpos (rojo). Los núcleos se tiñeron con DRAQ5 (azul). Las inserciones de potencia se utilizan para mostrar la co-expresión de vimentina y SV40-LT en G-2 y tumores WAP-T de alto grado. Las líneas de puntos blancos marcan las estructuras del estroma. Los confocal 3D-pilas se deconvoluted usando Huygens Essential es un software y reconstruidas con el software Imaris. Barra de escala: imagen principal: 50 m; Ampliación: 6 micras
(A-C) confocal de imágenes representativas de tumores-cryosections de un G-2 del tumor derivado de las células (A), un alto grado (B) y una baja. grado (C) tumor endógeno WAP-T teñidas con anti-queratina 8/18 (verde) y anti-queratina 14 anticuerpos (rojo). Los núcleos se tiñeron con DRAQ5 (azul). Las inserciones de potencia se utilizan para mostrar la co-expresión de la queratina 8/18 y queratina 14 en G-2, de alto grado y tumores WAP-T de grado bajo. Los confocal 3D-pilas se deconvoluted usando Huygens Essential es un software y reconstruidas con el software Imaris. Barra de escala: imagen principal: 50 m; Ampliación:. 6 micras
En un experimento adicional, 10
6 G-2 células fueron transplantadas a los cojines del capricho de dos ratones /c no transgénicos BALB. En tanto en ratones grandes, tumores sólidos crecieron después de 4-6 semanas. Curiosamente, las células tumorales fueron en gran medida desprovisto de marcadores epiteliales, EpCAM (Figura S2A) y citoqueratinas (Figura S2B, d), pero fuertemente vimentina expresado (Figura S2B, C), lo que indica que en la transición ratones no transgénicos en el estado mesenquimales es favorecido, posiblemente como consecuencia de una interacción con el sistema inmune del huésped. Como las células tumorales continúan expresando WAP-promotor impulsado SV40-LT (Figura S2C), es probable que la diferenciación en estas células mesenquimales era incompleta.
c) perfiles de expresión génica.
La histomorphological similitud entre G-2 de células trasplantadas y tumores WAP-T indica que estos tumores también podrían estar estrechamente relacionados a nivel molecular. Sobre la base de la expresión de las proteínas comparables CIF, también esperábamos una estrecha relación entre el G-2 células en cultivo como en G-2 tumores. Para probar estas hipótesis, se realizó un perfil de expresión de microarrays. El ARN total de G-2, G-2C9 y las células G-2C11, a partir de dos G-2 tumores trasplantados, así como de cuatro tumores WAP-T-NP8 que representan cuatro grados histológicos (G1-G4) se analizó en un microarray de Affymetrix plataforma (MOE430 2.0). Aplicando como criterio de significación del corr. P-valor (Benjamini-Hochberg) & lt; = 0,05, y un pliegue de cambio de corte 3, se identificaron 250 genes que son expresados diferencialmente entre cultivos celulares y muestras tumorales (Tabla S1). El endurecimiento de los criterios estadísticos a una corr. Valor de p & lt; = 0,01, sólo 24 genes que cumplían estos criterios estrictos. Los 250 genes expresados diferencialmente fueron analizados por el programa de ampliación situada en el fin de identificar (ontología de genes) categorías más representadas GO y TF (factor de transcripción) sitios de unión en sus
cis-regulador
regiones [27]. El análisis GO-enriquecimiento se combinó con la agrupación jerárquica, y los resultados se presentan en el mapa de calor se muestra en la Figura 6A. Un número significativo de genes expresados diferencialmente cae en la categoría de los genes de defensa inmune, lo que refleja el hecho de que los tumores contienen un cierto contingente de células inmunes, que no se encuentra en el cultivo celular. El enriquecimiento de genes relacionados con los procesos inmunes correlaciona bien con la representación más de los sitios para Elf1 de unión, un factor de transcripción altamente expresado en células linfoides [28], en las regiones promotoras de los genes expresados diferencialmente (valor P & lt; 0,001) . Por otra parte, las muestras de cultivo celular se distinguen por una mayor expresión de genes asociados con la regulación de la transcripción, por ejemplo,
Foxa2
,
FoxM1
,
Gata6
,
Hoxb2
,
Jmjd2c
,
PPARGC1A
, y
TLE1
, y los procesos de desarrollo, por ejemplo,
Bmp4
que está implicado en la diferenciación de células mesenquimales. Esta observación puede explicarse por la adaptación de la red de la transcripción y de vías de señalización a la celda condiciones de cultivo. En su conjunto, el análisis de la expresión de genes demostró que el G-2 células y tumores presentan más similitudes que diferencias en su programa de expresión génica; las diferencias se relacionan principalmente con su contexto biológico diferente.
(A) 250 genes expresados diferencialmente en el G-2 células cultivadas y endógena WAP-T o G-2 tumores derivados de células (Tabla S1) se utilizaron para generar un mapa de calor. GO categorías enriquecidos se muestran como diagramas de barras correspondientes a mayores o menores grupos de genes expresados en el grupo de muestra respectiva. La codificación por color y la altura de una barra representa la significación estadística (-log
10 (p-valor)) del enriquecimiento observado de las respectivas categorías GO. (B) Los genes característicos de luminal ER-
+, luminal ER-
-, y basal /células mioepiteliales se utilizaron para generar mapas de calor. los datos de expresión génica obtenidos para el cultivo celular (G-2, G-2C9 y las células G-2C11) y muestras de tumores (dos G-2 tumores trasplantados y cuatro tumores WAP-T-NP8 que representan cuatro grados histológicos) se utilizaron para este análisis. La expresión génica intensidades de una glándula mamaria de un ratón /c hembras paridas BALB (50 días después del destete) se utilizaron como referencia. grupos de genes prominentes (
KRT14
,
Vim
,
KRT5
,
KRT18
, y
ESR1
) se destacan por cuadros de color amarillo . Los valores de expresión están codificadas por colores: rojo - alta expresión, azul - baja expresión
Calculamos que el análisis de la expresión génica debería ayudar a localizar las células G-2 dentro de la jerarquía de células epiteliales mamarias.. Usando una lista de genes característicos de luminal-ER
+, luminal-ER
-, y basal /células mioepiteliales [29] (Tabla S1), y el perfil de expresión génica de la glándula mamaria de un ratón BALB parous /c de ratón (50 días después del destete) como referencia, el análisis de agrupamiento jerárquico de nuevo reveló similitud entre el cultivo de células y muestras de tumores (Figura 6B). Además, un programa transcripcional complejo que comprende muchos genes de los tres linajes se hizo evidente. En particular,
ESR1 gratis (que codifican para los receptores de estrógenos alfa) está dentro de un grupo de las reguladas "luminal ER-
+" genes,
Vim gratis (que codifica para vimentina) en el clúster de los genes no regulados,
KRT14
se encuentra en el grupo de genes regulados "basales", mientras que
KRT5
junto con una serie de otros genes forma un racimo de las reguladas " basales genes ", en consonancia con la ausencia de expresión KRT5 en G-2 cultivos de células y la ocurrencia rara de células KRT5-postive en tumores WAP-T (datos no mostrados). Sobre la base de este análisis, se concluye que el transcriptoma de células G-2 probablemente está relacionada con las células comprometidas con luminal ER-
- diferenciación. Estas células podrían ser los progenitores de luminal ER-
- células, que durante el compromiso perdió la expresión de marcadores prominentes, como
ESR1
y
KRT5 CD - genes funcionalmente ligados a luminal ER-
+ y linajes de células basales, y llegó a ser inmortalizados por las proteínas de SV40. Sin embargo, clarificación final de su identidad requiere más estudios.
stemness del G-2 células y sus derivados clonales
Nos El alto potencial tumorigénico de las células G-2 llevó a estudiar sus propiedades en CSC más detalles. Se realizó una serie de ensayos estándar para medir la expresión de un conjunto de marcadores de superficie celular, la auto-renovación, y la generación de fenotípicamente diferentes progenie (actividad de repoblación denominados colectivamente), la actividad de aldehído deshidrogenasas, y el potencial de formación de colonias.
a) marcadores de la superficie celular.
la expresión de ciertas proteínas de la superficie celular asociados, como integrinas y proteínas ancladas a GPI, es diagnóstico de células madre mamarias normales y las células madre del cáncer de mama. Por FACS se observó que casi todos los G-2 células expresan la CD29 marcadores relacionados stemness-(integrina beta 1) [30] (Figura 7A) y CD44 (receptor de hialuronato) [31] (Figura 7B). Una gran fracción de las células G-2 es positivo para EpCAM (epitelial molécula de adhesión celular) [31], [32] (Figura 7C, izquierda), que es co-expresada con CD24a y CD49f (integrina alfa 6) proteínas [30] , [33] - [35] (Figura 7C, derecha). Otro marcador progenitor asociada mamaria, CD61 (integrina beta 3) [36], se detectó en una gran fracción de G-2 células (Figura 7D, izquierda) y es también co-expresada con CD24a y CD49f (Figura 7D, derecha) . Por lo tanto, hemos denominado colectivamente la fracción de G-2 células co-expresan estas proteínas asociadas a la membrana celular como el CD24a
alta subconjunto. Las variaciones que van desde ~ 30% a ~ 90% en el número absoluto de células en este subconjunto se observaron entre G-2 células y clones parentales (datos no mostrados). A continuación, se observó que la contraparte del CD24a
alta subconjunto (Figura 7E, izquierda) se caracteriza por la expresión del marcador de células madre Sca1 [37] (Figura 7E, derecha). En su conjunto, la cultura del G-2 comprende dos grandes subconjuntos distintos, CD24a
alta /Sca1
baja y CD24a
baja /Sca1
alta. transgén SV40 se transcribe por igual en ambos subconjuntos, pero la transcripción de genes KRT14 y KRT18 es mayor en CD24a
/Sca1
células baja alta (Figura S3A, B). También se observó por análisis qPCR que
Cd24a
,
CD49f
y
Sca1
genes se transcriben en ambos subgrupos (Figura S3C).
(A, B) FACS representativos del punto de gráficas que muestran la expresión de CD29 (a) y CD44 (B) en G-2 células cultivadas. (C) FACS representativos salpican gráficas que muestran la expresión de EpCAM (C, izquierda) en células cultivadas G-2 y la distribución de CD24a y CD49f (C, derecha) dentro de la población de células de alta EpCAM
.